대장균군 건조필름의 위양성과 위음성 균주 분리 동정

본 실험에 사용된 재료는 젓갈 51건, 고춧가루 45건, 후춧가루 30건, 생강가루 30건, 마늘가루 17건 총 173건을 사용하였으며, 시중에서 유통 중인 제품을 재래시장, 대형마트 및 온라인을 통해 구입하여 사용하였다.

대장균군 검출을 위해 본 실험에 사용한 배지는 3M Petrifilm coliform count(PCC; 3M, St. Paul, MN, USA), Sanita-kun coliform count(SCC; Chisso Corp., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 생화학적 확인 실험을 위해 nutrient agar(BD, Sparkm, MD, USA), lactose broth(BD), Gram stain kit(BioMrieux, Marcy l'Etoile, France), sporulation medium (Formedium, Norfolk, UK), carbol-fuchsin(BD), 30% hydrogen peroxide(Daejung, Gyeonggi-do, Korea), nigrosin(SRL, Maharashtra, India), oxidase reagent(BioMerieux), O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG) disc(Oxoid, Hampshire, UK), motility test medium(BD), API kit(BioMerieux) 및 Vitek card(BioMerieux)를 사용하였다.

향신료는 실온에 보관하였으며, 젓갈은 냉장고에 저장하여 실험에 사용하였다. 검체 25 g을 정밀히 달아 멸균인산완충액 225 mL를 가한 후 균질기(BagMixer^Ⓡ400, Interscience, St Nom, France)로 1분간 균질화해 시험원액으로 사용하였으며, 멸균인산완충액을 이용하여 시험원액을 십진 희석 후 시험용액으로 하였다(2).

PCC 건조필름에서 생성된 대장균군의 전형적인 집락과 비전형적인 집락 각각 5개씩을 선별하여 생화학적 동정을 실시하였다. SCC는 비전형적인 집락이 형성되지 않아 전형적인 집락을 10개씩 선별하여 실험하였다. 선별된 각각의 균주를 35℃에서 48시간 Lactose broth에 배양해 가스 생성 유무를 확인하였다. 전형적인 집락 중 가스가 생성된 것을 대장균군 진양성으로 판정하였고, 비전형적인 집락 중 가스가 생성되지 않은 집락을 진음성으로 판정하였다. 진양성, 진음성, 위양성 및 위음성으로 판정된 집락수를 이용하여 대장균군 검출 정확도를 산출하였다(12).

전형적인 집락 중 lactose broth에서 가스가 생성되지 않은 집락을 위양성, 비전형적인 집락 중 lactose broth에서 가스가 생성된 집락을 위음성으로 판정하여 catalase test, oxidase test, ONPG test, motility test, Gram stain, spore stain(11,13-15)을 실시하여 판정된 생화학적 결과를 기초로 API 또는 Vitek을 이용하여 동정하였다.

생화학동정 실험결과 정확한 동정이 이루어지지 않은 P13-S-2, P20-S-4, G7-S-8, G30-S-7 균주는 Bionic(Seoul, Korea)에 의뢰하여 16S-rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 Bioedit 프로그램을 이용하여 편집한 후 National Center for Biotechnology Information의 유전자 염기서열 정보를 이용하여 동정하였다.

건조필름에서 확인된 집락의 진양성, 위양성, 진음성, 위음성 현황과 식품별 대장균군 검출 정확도는 Table 1에 나타내었다. 젓갈에서 분리된 집락의 lactose broth 실험결과 PCC의 경우 전형적인 41개 집락 모두 가스를 생산하여 진양성으로 판정되었고, 비전형적인 68개 집락 모두 가스를 생산하지 않아 진음성으로 판정되었으며 위양성과 위음성은 나타나지 않아 정확도는 100%로 산출되었다. SCC의 경우 전형적인 36개 집락 중 35개에서 가스를 생산하여 진양성으로 판정되었고, 1개 집락에서 가스가 생산되지 않아 위양성으로 판정되었다. SCC는 비전형적인 집락이 형성되지 않아 진음성, 위음성은 나타나지 않았으며 정확도는 97.2%로 산출되었다.

고춧가루에서 분리된 집락의 lactose broth 실험결과 PCC의 경우 전형적인 73개 집락 모두에서 가스가 생산되어 진양성으로 판정되었고, 비전형적인 48개 집락 모두에서 가스가 생성되지 않아 진음성으로 판정되었으며 위양성과 위음성이 나타나지 않아 정확도는 100%로 산출되었다. SCC의 경우 전형적인 36개 집락 중 35개에서 가스가 생성되어 진양성으로 판정되었고, 1개 집락에서 가스가 생성되지 않아 위양성으로 판정되어 정확도는 97.2%로 산출되었다. 후춧가루에서 분리된 집락의 lactose broth 실험결과 PCC의 전형적인 34개 집락 모두에서 가스가 생성되어 진양성으로 판정되었다. 비전형적인 집락 32개 집락 중 28개에서 가스가 생성되지 않아 진음성으로 판정되었으며, 4개 집락에서 가스가 생성되어 위음성으로 판정되었고 정확도는 93.9%로 산출되었다. SCC는 전형적인 집락 62개 집락 중 60개 집락에서 가스가 형성되어 진양성으로 판정되었고, 2개 집락에서 가스가 형성되지 않아 위양성으로 판정되어 정확도는 96.8%로 산출되었다.

생강가루에서 분리된 집락의 lactose broth 실험결과 PCC의 경우 전형적인 59개 집락 모두에서 가스가 생성되었고, 비전형적인 집락 76개 집락 중 71개 집락에서 가스가 생성되지 않았으며, 5개 집락에서 가스가 생성되어 위음성으로 판정하였고 정확도는 96.3%로 산출되었다. SCC는 전형적인 집락 91개 중 89개 집락에서 가스가 형성되어 진양성으로 판정되었고, 2개 집락에서 가스가 형성되지 않아 위양성으로 판정되어 정확도는 97.8%로 산출되었다. 마늘가루는 대장균군이 검출되지 않아 정확도를 판정하지 못하였다.

젓갈, 고춧가루, 후춧가루, 생강가루의 실험결과를 보면 PCC의 경우 진양성 207개 집락, 위양성 0개 집락, 진음성 71개 집락, 위음성 9개 집락으로 나타나 정확도는 97.9%로 산출되었다. SCC는 진양성 219개 집락, 위양성 6개 집락으로 나타나 정확도는 97.3%로 산출되었고, PCC와 SCC의 대장균군 검출 정확도는 유사하게 나타났다. 이러한 결과는 PCC의 정확도가 98.3% 였다는 Suwansonthichai와 Rengpipat(16)의 보고와 SCC의 정확도가 96.7% 였다는 Morita 등의(17) 보고와 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 PCC와 SCC를 사용하여 젓갈과 향신료 중 대장균군을 검출한다면 2.1%에서 2.7%의 위음성 또는 위양성 균주가 대장균군으로 판정될 수 있었다. 따라서 건조필름을 이용하여 대장균군을 검출할 경우 추가적인 확인 시험이 필요한 것으로 나타났다.

PCC에서 확인된 9개의 위음성 집락과 SCC에서 확인된 6개의 위양성 집락에 대한 생화학적 동정 실험 결과는 Table 2, 3에 나타내었다. PCC에서 확인된 9개의 위음성 집락을 SCC에 도말한 결과 푸른색의 전형적인 대장균군 성상을 나타내었고, 생화학적 동정 실험 결과 9개 집락 모두 gram 음성 단간균, catalase 양성, oxidase 음성, motility 양성, ONPG 양성 반응을 나타내었다. 이들 균주를 API 20E를 이용하여 동정한 결과 Pantoea spp.와 Escherichia hermannii로 동정되어 위음성 집락 9균주 모두 대장균군으로 확인되었다. Park 등(18)의 보고에 의하면 살균 온도 등 스트레스를 받은 균주는 활성이 저하된다고 보고하였으며, 이로 인해 생강가루, 후춧가루 제조 공정 중 가열 등 스트레스를 받은 Pantoea spp., E. hermanni와 같은 대장균군의 생육활성이 저하되어 3M Petrifilm에서 기포를 형성하지 않은 붉은색 집락을 나타낸 것으로 판단된다. 따라서 PCC를 이용하여 대장균군을 실험할 경우 24시간 배양 후 대장균군을 판정하기 곤란하다면 48시간 이상 추가 배양하여 가스 생성 유무를 확인하여야 할 것으로 판단된다. SCC에서 확인된 6개의 위양성 집락을 PCC에 도말하여 배양한 결과 모두 생육하지 않았다. 생화학 동정 실험 결과 6개 집락 모두 gram 양성 간균, catalase 양성, oxidase 양성, ONPG 양성, motility 양성 반응을 나타내었으며 spore stain 결과 포자가 확인되었다. Vitek BCL로 실험한 결과 R4-S-6, S22-S-4는 Bacillus licheniformis로 동정되었다.

SCC에서 위양성으로 판정된 6균주 중 Vitek 실험결과 정확한 동정이 이루어지지 않은 4균주에 대하여 16S rRNA 염기서열을 분석하여 동정을 실시하였다. 분자생물학적 동정결과 P13-S-2는 Bacillus rhizosphaerae 또는 Bacillus clausii, P20-S-4는 Bacillus pumilus 또는 Bacillus safensis, G7-S-8는 Bacillus pumilus 또는 Bacillus safensis, G30-S-7는 Bacillus pumilus 또는 Bacillus safensis로 동정되어 SCC에서 위양성을 나타낸 6균주 모두 그람양성의 Bacillus spp.로 동정되었다. 대장균군은 lactose가 존재할 때 β-galactosidase, lactose permease, transacetylase의 세 가지 효소를 생산하는데, β-galactosidase는 lactose를 glucose와 galactose로 분해하는 효소이며 lactose permease는 lactose를 세포 안으로 운반하고, transacetylase는 lactose를 아세틸화 시켜준다(19). PCC는 lactose를 함유하고 있어 세 가지 효소가 모두 존재해야 미생물이 lactose를 분해해 산과 가스를 생성 붉은색 집락을 나타내고 대장균군으로 판정된다. SCC는 X-gal을 함유하고 있어 β-galactosidase, lactose permease, transacetylase의 세 가지 효소 중 β-galactosidase 한 가지 효소만 보유하고 있어도 푸른색 집락을 나타낸다. SCC는 β-galactosidase 활성 한가지로 대장균군 양성을 판단하기에 β-galactosidase를 가지고 있으나, lactose permease, transacetylase를 가지고 있지 않은 Bacillus spp. 등 그람 양성균이 건조필름 상에 함께 검출되는 것으로 사료된다. 따라서 SCC를 이용 대장균군을 검출할 경우 파란색 집락을 대상으로 gram stain, oxidase 생화학 실험을 통해 대장균군을 판정하여야 할 것으로 판단된다.