전처리 방법을 달리한 보리의 발아 중 이화학적 특성 및 항산화 활성

발아를 위한 보리는 전통시장에서 당해 연도에 생산하여 건조된 국내산 겉보리를 구입하여 사용하였다. 보리 무게 대비 30%의 물을 가하여 상온에서 4시간 정도 예비 불림한 후 50℃에서 1시간 동안 열처리 한 보리(HKW)와 가볍게 세척한 후 보리가 완전히 잠기도록 하여 4시간 동안 불림 처리 한 보리(KW), 전처리를 전혀 거치치 않은 건조된 보리(CO)로 시료를 달리하였다. 불림시간 설정은 예비실험으로 보리가 물을 최대로 흡수하는 시점을 확인하기 위하여 1시간 간격으로 확인한 결과 4시간 후 최대로 흡수하여 불림시간을 4시간으로 설정하였으며, 발아시간 설정 문헌조사를 통하여 시료 채취 간격을 선정하였다. 각 실험군 별 보리 40 g을 자동급수가 되는 콩나물 재배기(SC-9000A, Sinchang INC, Osan, Korea)에 넣어서 초기 12시간 까지는 연속으로 급수하고, 그 이후부터는 20분마다 1분간 급수하면서 발아시켰다. 35시간까지 발아시키면서 5시간 간격으로 시료를 취하였다.

발아 시간에 따라 시료를 취하여 -70℃에서 보관하였다가 모두 함께 동결건조 하였다. 동결건조 된 각각의 시료는 분쇄기로 분쇄한 후 무게대비 10배의 70℃ 정제수를 가한 다음 2분간 진탕 혼합하고 70℃ water bath에서 추출액이 모두 잠기게 하여 3시간 동안 추출한 후 여과지로 여과한 여액을 시료로 사용하였다. 항산화활성 평가를 위한 시료는 이를 농도별로 다시 희석하여 사용하였다. 일부 실험에서는 추출여액을 다시 동결건조 한 후 3차 증류수를 사용하여 농도로 조절하여 사용하였다.

총 폴리페놀의 함량은 폴리페놀성 물질인 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리로 Folin-Denis법(26)에 따라 시료액 1 mL에 2 M Folin-Ciocalteau 시약(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.5 mL를 넣고 3분 후 10% Na₂CO₃ 용액 0.5 mL씩을 혼합하여 실온의 암실에서 1시간 정치한 다음 분광광도계(Libra S 35, Biochrom Ltd., Cambridge, England)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료와 동일한 방법으로 표준물질인 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 농도별로 분석하여 얻은 검량선으로 부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.

총 플라보노이드의 함량은 시료액 1 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 80% 에탄올 3.8 mL를 차례로 가한 후 혼합하여 실온의 암실에서 40분간 정치한 다음 분광광도계를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin(Sigma-Aldrich Co.)을 표준물질로 하여 얻은 검량선으로 부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

GABA의 정량을 위해 효소분석 방법을 이용하여 발아된 보리를 분쇄한 후 10배의 물을 가하여 진탕 추출한 다음 여과한 여액 1 mL에 70 mM LaCl₃ 1 mL를 가하여 15분 동안 잘 섞어준 후 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상등액 400 μL를 취하여 0.1 M KOH 160 μL를 미리 넣어둔 centrifuge tube에 넣어 5분간 교반하였다. 다시 4,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 상등액 50 μL에 0.5 M K₄P₂O₇ 완충용액(pH 8.6) 50 μL, 4 mM NADP 150 μL를 첨가한 후, 2.0 unit/mL GABase 50 μL를 혼합하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였으며(initial A), 20 mM α-ketoglutarate를 50 μL 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도를 측정(final A)하였다. 농도별 GABA(Sigma-Aldrich Co.)를 동일한 조건에서 분석한 표준검량곡선에 측정된 흡광도(final A-initial A)를 대입하여 생성된 GABA 함량을 산출하였다.

조건별 시료의 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) 및 2,2-azinobis-(3-ethylbenzo- thiazoline-6-sulphonate) (ABTS) 라디칼 소거활성을 통하여 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 DPPH에 대한 전자공여 활성으로 나타낸 것으로 Blois(27)의 방법을 응용하여 측정하였다. 즉, DPPH 용액(5 mg/100 mL methanol) 80 μL와 시료 120 μL를 혼합한 다음 실온에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 계산하여 %로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거활성은 Re 등(28)의 방법에 따라 7 mM의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12-16시간 동안 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 ABTS 용액을 사용하였다. ABTS 용액 100 μL에 시료액 100 μL를 혼합하고 실온에서 5분간 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 계산하여 %로 나타내었다.

모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 실험으로부터 얻은 결과는 SPSS statistics 18(IBM, Armonk, NY, USA) 통계 package를 이용하여 분석하였다. 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 일원배치 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 시행하였다.

전처리 방법을 달리한 보리를 35시간까지 발아시키면서 5시간 간격으로 시료를 취해 총 페놀화합물과 플라보노이드의 함량을 분석한 결과는 각각 Fig. 1 및 2와 같다. 모든 시료에서 총 페놀화합물의 함량은 발아 전 27.59-30.63 mg/100 g이던 것이 발아 5시간 후에 17.73-19.00 mg/100 g으로 유의적으로 감소한 후 불규칙한 증감을 보이면서 변화하다가 최종 발아 35시간 후에는 20.96-23.29 mg/100 g의 범위로 발아 전에 비해 유의적으로 낮은 함량이었다. 발아 5시간에 총 페놀화합물의 함량은 발아 전에 비해 61.5-64.4%로 감소한 후 HKW는 발아 20-25시간에, KW와 CO는 발아 30-35시간에 유의적으로 그 함량이 높았다.

Fig. 1. Total phenolic compounds contents of barely with different pre-treatment method and germination time. All values are mean±SD (n=3). HKW, stored at 50℃ for 1 h after keep in water for 4 h at room temperature before germination; KW, keep in water for 4 h at room temperature before germination; CO, control, not pre-treated. ^a-eMeans with different superscripts within the same pre-treatment method are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test. ^A-CMeans with different superscripts within the same germination time are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

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Fig. 2. Fig. 2. Total flavonoids contents of barely with different pre-treatment method and germination time. All values are mean±SD (n=3). HKW, stored at 50℃ for 1 h after keep in water for 4 h at room temperature before germination; KW, keep in water for 4 h at room temperature before germination; CO, control, not pre-treated. ^a-eMeans with different superscripts within the same pre-treatment method are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test. ^A-CMeans with different superscripts within the same germination time are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.

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전처리 방법을 달리한 보리의 발아기간 동안 플라보노이드 함량도 발아 전 시료에서 유의적으로 가장 높아 3.53-4.63 mg/100 g이었고, 발아 5시간 후에 1.69-1.87 mg/100 g으로 유의적으로 감소한 후 발아 10시간에는 다시 증가하는 경향을 보인 다음부터는 불규칙한 증감을 반복하여 최종 발아 35시간에는 2.13-2.42 mg/100 g의 범위였다. 발아 전에는 KW 시료에 비해 HKW와 CO 시료에서 유의적으로 함량이 더 높았으나 발아 35시간 후에는 세 시료간의 유의적인 차이가 없었다.

곡류에 함유되어 있는 항산화 물질 중 polyphenolic 화합물들은 우수한 항산화력을 가지는데, 이는 free radical을 안정화시킬 수 있는 phenolic ring의 존재 때문이며, 그 구조에 따라 특정 플라보노이드는 항산화 및 항균성 등 다양한 생리활성을 갖고 있는 것으로 보고되고 있다(30).

Woo 등(31)은 황금찰수수의 항산화 성분인 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 등은 grain 보다 껍질층 인 bran과 hull에 다량으로 존재하며, 껍질층에 있는 수용성 성분들이 살수에 의해 씻겨나가 불규칙한 증감을 반복하는 페놀 함량과 플라보노이드 함량에 영향을 준다고 보고하였다. 또한 곡류가 발아 시 유리형 및 결합형 기능성분이 변화하는데 세포벽의 결합형 폴리페놀 및 플라보노이드는 일반적으로 셀룰로스, 펙틴, 다당류 등의 세포벽 성분과 공유결합을 하고 있으며, 발아 초기 결합형 폴리페놀의 일부가 추출이 가능한 유리형 세포벽의 결합형 폴리페놀 및 플라보노이드는 일반적으로 셀룰로스, 펙틴, 다당류 등의 세포벽 성분과 공유결합을 하고 있으며, 발아 초기 결합형 폴리페놀의 일부가 추출이 가능한 유리형 폴리페놀로 변화하여 총 폴리페놀함량이 증가한다고 보고하였다(32). 본 연구에서 발아전 보리보다 발아 5시간 후 그 함량이 급격히 감소한 결과는 발아과정 중 수분을 흡수하면서 상대적인 건물량에 의한 차이가 발생하였으며, 발아시간에 따른 변화는 발아과정 중에 효소의 작용, 분해 등으로 인해 불규칙하게 변화된 것으로 추정된다.

전처리 조건과 발아시간별 보리의 GABA 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같이 모든 시료에서 발아시간의 경과와 더불어 함량이 증가하는 경향을 보이다가 다시 감소하였는데, 전처리 조건에 따라 그 경향은 다소 상이하였다. 즉, 보리에 물을 충분히 흡수시킨 후 50℃에서 1시간 동안 열처리 한 보리를 사용한 HKW 시료의 경우 발아 25시간까지 GABA의 함량은 증가하여 22.25 mg/100 g으로 최고값을 보인 후 감소하였다. 전처리를 전혀 하지 않은 건조된 CO 시료의 경우 3가지 시료 중 GABA의 함량이 가장 낮았으며, 발아 30시간에 12.31 mg/100 g으로 최고값을 보인 후 그 함량이 다시 감소하였다. 불림처리만을 거친 후 발아시킨 KW 시료의 경우도 발아 30시간에 16.15 mg/100 g으로 최고값을 보인 이후 그 함량이 다시 감소하였다.

GABA의 생성은 수분, 온도, 칼슘제제, 키토산 제제, glutamate, 기계적 자극, 산소결핍 등의 외부적 환경요인을 조절하여 증가시키는 방법들이 보고되어져 있다(33) 본 연구의 예비실험 결과 GABA의 함량은 전처리 과정만을 거친 후에도 그 함량에 차이가 있어 발아 전(0시간) 불림과 열처리를 거친 HKW 시료에서 12.48 mg/100 g으로 불림 과정만 한 KW 시료에 비해서 약 2.3배, 전처리를 하지 않은 CO 시료에 비해서는 약 7.3배 더 높은 함량이었다. HKW 시료에서는 GABA 함량이 최고치에 이르는 시간이 25시간이므로 30시간이 소요된 다른 시료에 비해 더 짧고 그 함량도 더 높아 발아 전 충분히 흡수시키고 효소작용에 적절한 온도와 시간을 제공함으로써 GABA 함량을 보다 효율적으로 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

Oh 등(34)은 보리의 GABA 함량이 발아에 의해서 2배 증가하였다고 하였으며, Choi 등(20)은 침지 전 현미의 GABA 함량은 1.80 mg/100 g이던 것이 40℃에서 침지시킬 경우 침지시간이 경과함에 따라 계속 증가하여 8시간 후 3.33 mg/100 g으로 가장 크게 증가하였으며, 50℃ 침지 시에는 약 2시간까지는 급격히 증가하였으나 그 후 약간 감소하여 평형을 이루는 경향을 나타내었고 10℃와 25℃ 침지 시에는 8시간 경과 후에도 각각 2.12 mg/100 g과 2.49 mg/100 g으로 별다른 증가를 나타내지 않았다고 보고 한 바 있다. 이처럼 발아 곡물의 GABA 함량은 발아시간 보다는 온도에 더 크게 영향을 받는 것으로 보고(7)되어 있는데 본 연구의 결과와 같이 발아 온도를 동일하게 하였을 때는 전처리 방법이 발아 중 GABA 함량에 직접적인 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

전처리 조건과 발아 시간을 달리한 보리 물 추출물의 항산화 활성을 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 통해 평가한 결과는 각각 Table 4 및 5와 같다. 발아 전 시료들의 DPPH 라디칼 소거활성은(Table 4) 64.72-68.72%로 통계적인 유의차가 없었으나 발아 5시간에 활성이 급격히 감소하여 52.48-58.49%로 가장 낮았다가 다시 발아 시간이 경과함에 따라 점진적으로 활성이 증가하였다. HKW는 20시간과 25시간 발아 시료에서 각각 73.72%와 77.40%로 두 시료 간의 유의차 없이 활성이 가장 높았고, KW 시료는 25시간 발아 시 가장 활성이 높았다.

발아 시간별 보리 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성(Table 5)은 발아 전 시료에서 유의적으로 활성이 가장 높아 85.72-88.10%의 범위였으며, DPPH 라디칼 소거활성과 동일한 경향으로 발아 5시간에 가장 낮아 46.28-58.15%의 범위였다. 그 이후부터 발아 30시간 까지는 점진적으로 활성이 증가하여 발아 30시간에 ABTS 라디칼 소거활성은 71.40-80.25%로 발아 기간 중 가장 활성이 높았으며, 그 이후에는 60.26-74.37%의 범위로 다시 활성이 감소하였다.

ABTS 라디칼 소거활성은 DPPH 라디칼 소거활성과 상관관계가 높은데, DPPH 라디칼 소거활성은 유리 라디칼을 ABTS 라디칼 소거능은 양이온 라디칼을 소거한다는 점에서 차이가 있으며, 항산화성 물질의 정도에 따라 라디칼과 결합하여 제거하는 능력에도 차이가 있다(35). 본 연구의 결과에서 발아 보리 추출물은 DPPH 라디칼 보다는 ABTS 라디칼을 소거하는 능력이 더 우수하여 양이온 라디칼 소거에 더 유리하게 작용할 것으로 생각된다.

Kim 등(36)의 연구에서 일품벼를 발아시켰을 때 항산화력은 발아 4일 차에서 최대값을 보인 후 감소하는 결과를 보였는데 본 연구에서 발아 초기에 비해 발아 5일에 항산화 활성이 감소는 총 페놀화합물과 플라보노이드 화합물의 영향으로 추측되며 DPPH 라디칼 소거활성은 발아 25시간, ABTS 라디칼 소거활성은 발아 30시간에 활성이 가장 좋았고 그 이후 활성이 점차 감소하여 유사한 경향이었다. 이는 발아 후 일정기간 증가하였다가 감소하는 GABA 함량과 또는 항산화 성분인 비타민 E 및 γ-oryzanol의 함량의 종합적인 변화에 따른 것으로 추정되는데, 비타민 E와 γ-oryzanol은 발아하기 전 생리적 대사물질로 합성되었다가 발아가 진행되면서 식물의 성장과 생리대사 작용에 관여하여 성장촉진제와 생리대사 상승 작용에 활용되면서 그 함량이 감소한다(37).