약주 제조를 위한 저온 적응성 효모의 특성

본 실험에서 사용한 효모는 전국에서 수집한 메주, 누룩 등의 발효식품 50여종으로 분리한 482균주들을 사용하였 다. 비교균주로 시판효모인 Fermivin(S. cerevisiae, Gist Brocades, Denmark)와 La parisienne(S. cerevisiae, DB ingredients, UK) 사용하였다. 실험에 사용된 효모는 yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose 2%(Difico, Becton Dickinson and company, spark, USA) 액체배지에 배양 후, glycerol를 20% 첨가하여 -80℃에서 보관하여 실험에 사용 하였다.

효모는 YPD 한천배지(Difico, Becton Dickinson and company, spark, USA)에 도말하여 2일간 배양한 후 순수 분리하였다. 저온에서 생육이 우수한 효모를 선발하기 위 해 shaking incubator에서 2일간 15℃에서 배양한 후 spectrophotometer(SYNERGmx, D.I Biotec Ltd., Seoul., Korea)에서 600 nm로 흡광도를 측정하여 생육이 우수한 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 온도(15℃, 25℃)에 따른 생장 정도와 에탄올 내성(0~20%) 및 glucose(0~60%)를 사 용한 내당성과 sodium chloride(0~10%)에 의한 내염성을 Bioscreen C(OY Growth Curves Ab Ltd., Finland)을 사용하 여 600 nm에서 확인하였다. 또한 cerulenin(Sigma-Aldrich Co., St Louis, USA)과 5,5,5,-trifluor-DL-leucine(TFL,Sigma- Aldrich Co., St Louis, USA)에 대한 저항성은 yeast nitrogen base(YNB, Difco, detroit, Mi, USA)에 2% glucose 및 2% agar 조성의 한천배지에 cerulenin(25 μM)과 TFL(1 mM)을 첨가하여 제조한 후 효모를 접종하여 15℃에서 48시간 배양 한 후 집락 생성 여부에 따라 내성을 평가하였다(17,18). 황화수소 생성능을 알아보기 위해 Biggy 한천배지(Difico, Becton Dickinson and company, spark, USA)에서 15℃, 48시 간 배양 한 다음, colony의 색깔 진하기에 따라 황화수소 생성능을 평가하였다(19).

분리 효모를 동정하기 위해 26S rDNA 유전자의 D1/D2 부위 염기서열을 분석하였다. 프라이머로 NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG- 3’) 및 NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3’)를 사용하여 26S rRNA D1/D2 부 위 단편을 증폭 후, ㈜ZENOTECH사에 의뢰하여 염기서열 을 분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST를 사용하여 유전자의 상동성 을 비교하였으며 염기서열은 DNASTAR pro software (Seqman Pro, Ver 9., Lasergene)를 사용하였고 효모의 계통 분석도(phylogenetic tree) 작성은 MEGA 6.0의 Kimura2- parameter method를 이용하여 작성하였다.

효모의 효소활성을 확인하기 위해 yeast protein extraction buffer kit(GE healthcare, St Louis, USA)를 사용하여 단백질 을 추출하였다. β-glucosidase(EC 3.,2.1.21.)의 활성은 Grover 등(20)의 방법을 적용하여 실험하였다. 10 mM의 기질 ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(Sigma-Aldrich Co., St Louis, USA)을 100 μL 넣고 100 mM citrate phosphate buffer(pH 4.0)을 890 μL 넣은 후, 효모추출액을 넣은 후 45℃에서 반응시킨 후 0.5 M sodium carbonate(Sigma- Aldrich Co., St Louis, USA)로 반응을 멈춘 후 원심 분리한 상등액을 spectrophotometer에서 흡광도 405 nm로 활성을 확인하였다. esterase(EC 3.1.1.6)의 활성은 Frank 등(21)의 방법을 변형하여 실험하였다. 효모 추출액(32 μL)에 4.5 M ρ-nitrophenyl acetate(Sigma-Aldrich Co., St Louis, USA) 가 포함된 0.1 M tris-HCl buffer(pH 7.0)을 넣고 35℃에서 반응시켜 효소활성을 확인하였다. 또한 5 M ρ-nitrophenyl- β-butyric acid(Sigma-Aldrich Co., St Louis, USA)를 기질로 하여 0.5 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)에서 40℃에서 반응 후 405 nm에서 활성을 확인하였다. 모든 효모는 YPD(25% glucose)배지에서 5일간 120 rpm을 배양하였고 분당 생성되는 1 μmol의 ρ-nitrophenol을 1 unit으로 정의하 여 실험하였다.

효모의 에탄올 생성량은 25% glucose가 포함된 YPD 액 체배지에서 분리한 효모를 접종한 후 15℃에서 120 rpm으 로 5일간 배양한 후 원심 분리한 상등액 100 mL를 증류하여 회수한 후 주정계를 사용하여 측정하였다(22).

분리효모를 한천배지에 도말하여 2일간 25℃에서 한 후 순수 분리된 균주를 Karnovsky’s 고정액을 처리한 후 50~100% alcohol을 이용하여 탈수시킨다. 탈수된 샘플을 CO₂ 가스를 이용하여 건조한 후 gold coating작업 후 전자주 사현미경(scanning electron microscopy, SEM; H-2460N, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하여 5,000~10,000배 배율을 사용하여 균 형태를 확인하였다.

실험결과의 통계처리는 SAS program(9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균(mean)과 표준편차 (SD)로 표시하였다. 통계분석은 분산분석(ANOVA)을 사 용하였고 Tukey's Studentized Range test로 유의성을 검증 하였다.

메주와 누룩 등의 발효식품에서 분리한 482균주를 이용 하여 저온(15℃)에서 YPD 액체배지에 2일간 배양한 후 생 장정도를 spectrophotometer로 확인하였다. Table 1은 분리 한 균들 중에서 저온 생장 정도가 우수한 5균주와 시판효모 2종에 대해 알코올 생산능과 향기관련 효소 및 저항성을 확인한 결과이다. 저온에서의 생장은 시판효모인 control 1(Con1)과 비슷한 생장정도를 보이며 control 2(Con2)에 비 해서는 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. Chiva 등(5)의 보고에 의하면 Saccharomyces spp.의 경우 저온에서 높은 생장률을 보이는 균주는CSF1, HSP104, TIR2 유전자가 과 발현되는 현상이 보고되고 있다. 저온적응성 균주 분리 시 위와 같은 유전자의 발현 특성을 확인할 수 있다면 좀 더 빠르고 쉽게 균주를 분리할 수 있을 것이다. 알코올 생산능 은 Y605 균주가 14.8%로 가장 높은 농도를 보였으며 Con1 과 Y205, Y297, Y624는 비슷한 농도가 관찰되었고 Con2와 Y389는 8~9%로 가장 낮은 알코올 생산능을 보였다. Baek 등(1)의 논문에서 25℃, 48시간 배양 시S. cerevisiae의 알코 올 생성능은 7.3~9.5%의 생성능을 보였고 non-S. cerevisiae 의 알코올 생성능은 2,2~4.7%로 나타났다. 온도와 배양시 간의 차이는 있지만 대체적으로S. cerevisiae의 알코올 생성 능이 non-S. cerevisiae에 비교하여 2배 가까이 높은 것으로 조사되었다. 하지만 시판효모인 Con2의 경우, 이 균주가 S. cerevisiae인 것을 감안하면 Con2가 알코올 생성능과 저 온적응성에서도 낮은 결과가 나타났다. 이 결과를 통해 Con2는 저온에서 생육성장 뿐만 아니라 발효능이 감소되 어지는 것으로 생각된다. β-Glucosidase의 경우, 전반적으 로 모든 효모에서 높은 활성을 보였다. 이 효소는 비휘발성 향기성분을 생산하는데 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데S. cerevisiae의 경우 pH4 그리고 40~50℃에서 높은 활성을 보인다고 보고되었다(23). 또한 non-S. cerevisiae에 서도 Candida stellata, Candida hellenica, Kloeckera apiculata 균주들에서 β-glucosidase의 활성이 있음을 확인 할 수 있다(24). Y389 균주는 ceruleni과 TFL에 대한 저항성 을 모두 확인 할 수 있었고 Y297, Y605 균주는 TFL에 대한 저항성을 관찰할 수 있었다. 이취에 관련된 황화수소 생산 능은 Y389 균주가 가장 높은 것으로 나타났다. Table1의 결과를 토대로 Y389의 경우 저온적응성과 향기인자의 활 성이 강했지만 알코올 생성능이 낮고 이취가 강하기 때문에 약주 생산에 적합하지 않는 것으로 판단된다. Y297 균주는 알코올 생성능이 높고 황화수소 생산도 거의 보이지 않으며 향기인자의 활성 또한 확인되어 Y297 균주의 특성을 우선 적으로 조사하였다.

Fig. 1은 선발된 효모 균주의 26S rRNA 유전자의 D1/D2 부위 염기서열 분석 결과를 나타내었다. Y297 균주는 Saccharomyces cerevisiae로 동정되어졌으며 Fig. 2는 출아 중인 S. cerevisiae Y297 균주의 형태를 SEM을 이용하여 확인한 결과이다.

Fig. 1. Phylogenetic relationship between Saccharomyces cerevisiae strain Y297 and other previously reported strains based on their 26S rDNA sequences. Evolutionary distances were calculated according to the Kimura2-parameter method.

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Fig. 2. Scanning electron microscope micrograph of budding yeast cells, Saccharomyces cerevisiae.

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Fig. 3은 선발된 Y297균주에 대등(5)의 실험에서도 시판 효모인S. cerevisiae QA23 역시 25℃에 비해 장기간 정지상 으로 상하여 여러 환경조건에서 Bioscreen C를 이용하여 48~72시간까지의 균 성장정도를 조사한 결과이다. Fig. 3A 는 온도에 따른 균 성장도를 확인한 결과로써 25℃에서 19시간이 경과했을 때 정지상으로 접어들어 38시간에 정지 상으로 접어드는 15℃에서보다 빠른 생장 속도를 보였다. 그렇지만 저온 정지상에서 세포질량의 값은 15℃에서 보다 높은 흡광도를 확인할 수 있다. Chiva 등(5)의 실험에서도 시판효모인 S. cerevisiae QA23 역시 25℃에 비해 장기간 stationary phase상태를 유지하고 높은 발효능을 보였다. 그 에 반해 25℃에서는 24시간 만에 정지상에 도달했지만 짧은 시간에 성장곡선이 급격히 감소하는 곳으로 보고되었다. 알코올 내성(Fig. 1B)의 경우 Y297 균주는 10% 알코올 함량 에서도 0.4이상의 흡광도를 보여준다. S. cerevisiae K-701 균주를 높은 알코올 농도에 노출 후 생존율을 확인한 실험 에서 급격하게 균 생존율이 떨어지는 것을 확인할 수 있었 다(25). 내당성에 관한 실험인 Fig. 3C의 경우는 glucose 60%에서 0.5정도의 흡광도를 나타내며 내염성 실험인 Fig. 3D에서는 NaCl 8%에서 흡광도 0.7를 유지한다. Wu 등(26)의 내염성 실험에서 염 감수성 효모인 S. cerevisiae AXT3은 25 mM의 NaCl에서 급격히 균수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 위 결과를 통해 Y297이 저온적응성을 가지고 있으며 여러 환경 조건에 대한 내성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Changes in yeast cell growth under different fermentation conditions. A: Temperature (15℃ and 25℃), B: Alcohol tolerance (0~20%), C: Glucose tolerance (0~60%), D: Salt tolerance (NaCl, 0~10%).

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저온(15℃)에서 배양한 효모의 세포질 단백질을 추출하 여 향기성분과 관련된 효소인 β-glucosidase와 esterase의 활성을 확인했다(Fig. 4). Y297의 β-glucosidase의 활성(Fig. 4A)은 시판효모들보다 2.5배 높은 활성을 확인할 수 있었 다. Hernández 등(23)의 실험에서 ρ-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside을 기질로 하여 활성을 측정한 결과, 균 생 장 속도와 비례하여 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었 고 배양 후 10시간 이후에 활성이 점점 감소되어진다고 보고하고 있다. 또한 상등액보다 균체를 이용한 활성 실험 에서 좀 더 높은 활성이 관찰되었다. ρ-nitrophenyl acetate를 기질로 하여 실험한 esterase의 활성(Fig. 4B)은 Con2에 비해 높은 활성을 보였고 ρ-nitrophenyl-β-butyric acid를 기질로 하여 실험 Fig. 4C 또한 시판효모들보다 높은 esterase 활성 을 보였다. 위의 결과를 통해 발효식품에서 선발된 Y297 균주는 대조구에 비해 향기성분 관련된 효소의 높은 활성을 관찰할 수 있었다. 이러한 점은 약주제조에 있어서 유용한 종균자원 될 수 있는 가능성이 있을 것으로 판단된다.

Fig. 4. β-glucosidase and esterase activity in the cytoplasm fractions of yeasts based on the release of ρ-nitrophenol from ρ-nitrophenyl- β-D-glucopyranoside (A), ρ-nitrophenyl acetate (B) and ρ -nitrophenyl-β-butyric acid (C).

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