용매극성 최적화를 통한 센티페드그라스(Eremochloa ophiuroides) 추출물의 maysin 함량 및 항산화 효능 향상

본 연구에 사용된 센티페드그라스[Eremochloa ophiuroides (Munro) Hack.]는 ㈜바이오메이신 전용 재배 농지(전북특별자치도 익산시 소재)에서 수확하여 사용하였으며, 수확된 센티페드그라스는 흐르는 물에 세척 후 자연 건조하여 건초로 사용하였다. 센티페드그라스 건초 20 g을 80% 에탄올, 80% 메탄올, 80% 아세톤, 물, 열수(90°C) 400 mL를 용매로 1일간 침지 추출하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 추출액은 여과지로 여과한 후 50°C 수욕상에서 감압 농축하였으며, 물 추출물의 경우 소량의 에탄올을 단계적으로 첨가하여 농축 효율을 높여주었다. 농축된 시료는 밀봉하고 보관하여 실험에 필요한 시료로 사용하였다.

용매별 센티페드그라스 추출물 내 polyphenol 함량은 추출물 5 mg을 1 mL의 추출 용매로 용해하여 분석에 필요한 시료로 사용하였다. Cicco 등(2009)의 방법에 따라 각 시료와 Folin & Ciocalteu 시약을 정확히 동량 혼합한 후 0.1 M의 sodium carbonate 용액 800 μL를 가하여 40°C에서 20분 동안 반응시키고, 10분 동안 냉각시킨 뒤 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, gallic acid를 표준물질로 농도에 따른 일차방정식(y = 0.0009x + 0.0355, R²=0.9988)을 이용하여 총 페놀 함량[mg gallic acid equivalent (GAE)/g]으로 계산하였다. flavonoid 함량 측정은 용매별 센티페드그라스 추출물 시료 1 mL과 5%의 sodium nitrite 용액 30 μL를 혼합하여 정확히 5분 반응시킨 후 10%의 aluminum chloride 용액 30 μL와 1 M의 sodium hydroxide 용액 200 μL를 가하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다(Lee 등, 2012). Flavonoid 함량은 quercetin을 표준물질로 농도에 따른 일차방정식(y = 0.0011x + 0.0836, R²=0.9951)을 이용하여 총 flavonoid 함량[mg quercetin equivalent (QE)/g]으로 계산하여 나타내었다.

Maysin 표준물질은 ㈜바이오메이신에서 센티페드그라스로부터 반복적인 칼럼크로마토그래피를 수행하여 순수한 단일 물질로 분리 정제하고 NMR 및 high-resolution electrospray ionization mass spectrometry 등 분광학적 분석을 수행하여 화합물의 구조를 동정하였다. 용매별 센티페드그라스 추출물 내 maysin의 함량을 분석하기 위해 시료 5 mg을 정밀히 달아 50% 메탄올 1 mL를 첨가한 뒤, 10분간 초음파를 가하여 시료를 용해하였다. 이후 원심분리(10,770 × g, 5 min)하여 상등액을 취해 분석에 필요한 시료로 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC는 SPD prominence UV/VIS detector가 장착된 HPLC (LC-20AD, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였으며, 컬럼은 YMC-Pack C18 column (4.6 mm I.D. × 150 mm; particle size 5 μm; YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)을 사용하였다. 컬럼의 온도는 40°C를 유지하였으며 mobile phase는 용매 A (0.1% formic acid가 포함된 물)와 용매 B (acetonitrile)를 분당 1 mL의 유속으로 흘려주었다(Table 1).

용매별 센티페드그라스 추출물의 DPPH radical 소거 활성을 측정하기 위해 시료 50 μL와 에탄올을 용매로 제조한 0.2 mM의 DPPH 용액 200 μL를 96-well plate에 가하여 실온의 암소에서 정확히 30분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Yoshida 등, 1989). 용매별 센티페드그라스 추출물의 ABTS radical 소거 활성을 평가하기 위해 7.4 mM의 ABTS 용액과 2.6 mM의 potassium persulfate 용액을 혼합하여 실온의 암소에서 24시간 동안 반응시켜 radical을 형성시켰으며, 흡광도의 값이 0.70±0.03이 되도록 phosphate buffered saline (pH 7.4)을 이용하여 적절히 희석하여 사용하였다. 이후, 희석된 ABTS 용액 190 μL와 시료 10 μL를 96-well plate에 가한 후 실온의 암소에서 10분간 반응시키고 microplate reader를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조물질로 catechin을 사용하였다(Re 등, 1999).

용매별 센티페드그라스 추출물의 xanthine과 xanthine oxidase에 의해 생성되는 superoxide radical의 소거 활성을 측정하기 위해 시료 10 μL와 100 μM nitro blue tetrazolium (NBT)와 xanthine (250 μM)을 포함하는 phosphate buffer (pH 7.8, 20 mM)를 혼합하여 5분간 반응시켰다. 이후, xanthine oxidase (0.05 U/mL) 100 μL를 가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 후 69 mM의 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 가하여 반응을 멈춘 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Superoxide radical 소거 활성에 대한 측정은 시료와 대조군이 NBT를 환원시키는 정도로 비교하였다(Thuong 등, 2007).

센티페드그라스 에탄올 추출물의 영양성분 분석은 한국기능식품연구원(Seongnam, Korea)에서 수행되었다. 분석 항목은 비타민B₁, B₂, C, E, K, 칼슘, 칼륨 등을 포함하며, 모든 항목은 식품의약품안전처 고시 ｢식품공전｣에 명시된 시험법에 따라 분석되었다.

통계 자료의 값은 평균값±표준편차(mean±SD)로 표기하였으며, SPSS package program (version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 유의성을 검증한 후 Duncan’s multiple range test에 의해 실험군과의 차이를 p<0.05 유의수준에서 검증하였다.

용매별 센티페드그라스 추출물 내 polyphenol 함량을 분석한 결과, 80% 에탄올 추출물이 0.46±0.01 mg GAE/g으로 가장 높았고, 이어 80% 메탄올(0.42±0.01 mg GAE/g), 열수(0.32±0.02 mg GAE/g), 물(0.30±0.01 mg GAE/g), 80% 아세톤(0.28±0.02 mg GAE/g) 순으로 나타났다(p<0.05). Flavonoid 함량 역시 에탄올 추출물이 0.26±0.02 mg QE/g으로 가장 높았으며, 메탄올(0.25±0.02 mg QE/g), 열수(0.17±0.02 mg QE/g), 물(0.17±0.02 mg QE/g), 아세톤(0.12±0.00 mg QE/g) 순으로 유의적 차이를 나타내었다(p<0.05; Table 2). 70-80% 에탄올은 중간 정도의 극성을 가지기 때문에 친수성인 페놀성 수산기와 소수성인 benzopyran 골격을 모두 지닌 polyphenol 및 flavonoid를 효과적으로 용출시키는 용매로 알려져 있으며(Kähkönen 등, 1999), 본 연구 결과도 이와 동일한 경향을 나타내었음을 확인하였다. Kim 등(2018)이 보고한 대나무 잎 추출물, Anokwuru 등(2011)이 보고한 님나무(Azadirachta indica) 추출물 연구에서도 70-80% 에탄올이 물 또는 메탄올, 아세톤 대비 높은 phenolic flavonoids 회수율을 나타낸 바 있어, 에탄올의 용출 효율이 다양한 식물 종에 걸쳐 재현됨을 시사한다. 종합하면, 센티페드그라스의 항산화 성분 추출에는 80% 에탄올이 가장 적합한 용매라고 판단되며, 해당 용매 조건에서 얻은 추출물이 다른 용매보다 높은 polyphenol 및 flavonoid 함량을 나타내는 만큼 radical 소거 활성 및 세포 기반 항산화 활성에서도 우수한 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

센티페드그라스 추출물의 maysin 함량을 추출 용매별로 비교하기 위해 HPLC 분석을 수행하였으며, 각 추출물의 주요성분에 대한 크로마토그램은 Fig. 1에 제시하였다. 정량 결과, 80% 에탄올 추출물이 21.9±0.2 mg/g으로 가장 높은 maysin 농도를 나타내었고, 80% 아세톤(20.0±0.1 mg/g)과 80% 메탄올(17.8±0.2 mg/g)이 그 뒤를 이었다. 반면, 물 추출물과 열수 추출물은 각각 5.9±0.1 mg/g, 3.45±0.3 mg/g로 유의적으로 낮았다. Chlorogenic acid와 isoorientin 또한 80% 에탄올에서 각각 20.6±0.3 mg/g, 20.6±0.2 mg/g으로 다른 용매 추출물보다 우수한 함량을 나타내었다(p<0.05; Table 3). Maysin은 C-glycosyl flavone 계열로서 친수성(C-glucoside)과 지용성 특성을 갖는 benzopyran 고리 구조를 동시에 지니고 있어, 극성과 비극성 상호작용이 모두 가능한 특성을 나타낸다. Chlorogenic acid와 isoorientin 또한, 극성과 비극성 특성을 동시에 갖는 중간 극성의 화합물로써 중간 극성의 수용성 유기용매인 80% 에탄올에서 용해도가 높아 용출 효능이 극대화되는 경향을 보인다. 페놀계 화합물 및 플라보노이드 배당체는 70-80% 에탄올과 같은 중간 극성의 용매에서 가장 잘 용해되는 특성을 가지며(Sultana 등, 2009), 실제로 Moringa oleifera 잎(Wang 등, 2017), Hylocereus polyrhizus 종자(Zulkifli 등, 2020)에서도 70-80% 에탄올이 flavonoid 회수율을 극대화한 바 있다. Flavonoid는 대표적인 2차 대사산물로 전자 공여 및 금속 이온 킬레이션을 통해 강력한 활성산소종 소거 활성을 나타낸다(Pietta, 2000). 따라서, maysin과 chlorogenic acid, isoorientin이 고농도로 함유된 에탄올 추출물은 다른 용매 추출물보다 우수한 항산화 활성을 나타낼 것으로 기대된다.

Fig. 1. HPLC chromatograms of maysin, chlorogenic acid, and isoorientin from Eremochloa ophiuroides extracts obtained using different extraction solvents. The Y-axis shows UV detector response (mV). (A), maysin standard; (B), 80% EtOH extract; (C), 80% MeOH extract; (D), 80% acetone extract; (E), water extract; (F), hot water extract; (G), maysin standard curve; (H), chlorogenic acid standard curve; (I), isoorientin standard curve.

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DPPH radical과 ABTS radical 소거 활성법은 시료의 항산화능에 의해 radical이 제거 및 탈색되는 원리를 이용한 방법으로 항산화 활성을 평가하는데 널리 이용된다(Moreno 등, 2000). 본 연구에서는 각 추출물의 radical 소거능을 50% 저해농도인 IC₅₀ 값으로 비교하였다(Fig. 2, Table 4). 센티페드그라스 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 80% 에탄올 추출물 53.8 μg/mL, 80% 메탄올 추출물 53.1 μg/mL, 80% 아세톤 추출물 55.4 μg/mL, 물 추출물 208.9 μg/mL, 열수 추출물 175.7 μg/mL로 측정되었으며, 에탄올과 메탄올 추출물의 IC₅₀ 값은 물, 열수 추출물에 비해 약 3-4배 낮아(p<0.05) 우수한 소거 활성을 나타내었다. ABTS radical 소거 활성 역시 80% 에탄올(34.2 μg/mL)과 80% 메탄올(33.5 μg/mL) 추출물이 가장 뛰어난 활성을 나타내었으며, 80% 아세톤(38.4 μg/mL), 열수(62.6 μg/mL), 물(88.0 μg/mL)이 뒤를 이었다. DPPH radical과 ABTS radical 두 모델에서 얻은 IC₅₀ 값은 매우 높은 양의 상관계수(r=0.97, p<0.01)를 나타내어 두 라디칼 시스템이 동일한 항산화 성분군에 의해 일관되게 영향을 받음을 시사하였다. 개별 성분과의 상관 분석 결과, maysin 함량은 평균 IC₅₀ 값과 강한 음의 상관을 보였다(r=−0.93), 반면 총 flavonoid 함량은 중등도 수준의 음의 상관(r=−0.39)을 나타내었다. 이는 maysin이 센티페드그라스 추출물의 라디칼 소거 활성에 핵심 기여 인자임을 뒷받침한다. 80% 에탄올 계열 용매가 flavonoid를 가장 효율적으로 회수한다는 점은 화살나무 잎(Min 등, 2023)과 님나무 잎(Anokwuru 등, 2011) 등 선행 연구와 일치한다. 또한 옥수수 수염 유래 순수 maysin은 DPPH radical 소거능이 양성 대조인 rutin을 능가하였으며(Kim 등, 2003), 본 실험에서 에탄올 추출물의 maysin 함량이 최고치(21.9 mg/g)였다는 점을 고려하면 maysin이 추출물의 항산화력 향상에 크게 기여한 것으로 판단된다. 자료 전반은 80% 에탄올 · 메탄올 추출 조건이 센티페드그라스의 항산화 유효 성분을 최적으로 농축함을 시사하며, 해당 추출물이 천연 항산화제 후보로서의 가치를 뒷받침한다.

Fig. 2. DPPH (A), ABTS (B), Xanthine-originated superoxide quenching activities (C) of the extract of Eremochloa ophiuroides. Different superscript letters (^a-d) on the bars represent significant differences at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

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Xanthine oxidase (XO)는 xanthine을 기질로 하여 uric acid를 생성하는 과정에서 superoxide radical을 생성하고 hydrogen peroxide 등의 산화제로 작용하여 통풍을 유발하게 된다(Hatano 등, 1989; Ziegler 등, 1971). Superoxide radical은 NBT와 반응하면 blue formazan을 생성하게 되는데 이때 시료의 항산화 활성과 반응하게 되면 청색의 blue formazan이 superoxide anion radical-NBT-complex 작용으로 인해 탈색되고, 페놀성 화합물에 의해 radical이 소거된다고 보고되어 있다(Gülçin, 2006). 본 연구에서는 센티페드그라스를 용매별로 추출하였을 때 xanthine oxidase와 xanthine으로 인해 생성된 superoxide radical 소거 활성에 미치는 영향을 확인하였으며, 80% 메탄올 추출물이 가장 뛰어난 소거 활성을 나타내었고 그 뒤로 80% 에탄올 추출물이 우수한 소거 활성을 나타내었다(p<0.01; Fig. 2, Table 4). 비극성 비율이 높은 아세톤과 물, 열수 추출물은 IC₅₀ 값이 120-335 μg/mL로 현저히 높게 분석되었으며, 메탄올은 제조, 식품의 적용에 독성을 나타내어 대체 용매로 부적합하기 때문에(Roopashree과 Naik, 2019), 80% 에탄올이 산업적 측면에서 항산화 소재를 개발하는 최적의 용매라고 판단된다. 본 연구 결과는 앞서 도출된 polyphenol, flavonoid 및 maysin 함량의 분포와 매우 일관되는 경향을 나타내는데 특히, 에탄올과 메탄올 추출물의 maysin (21.9 mg/g, 17.8 mg/g)은 페놀성 전자공여체로 superoxide radical을 소거하여 formazan의 형성을 억제한 것으로 사료된다.

센티페드그라스 80% 에탄올 추출물의 영양성분 분석 결과, 비타민 C는 883.3 mg/100 g, 칼륨은 6,608.5 mg/100 g로 매우 높은 함량을 나타내었다(Table 5). 비타민 C는 수용성 항산화제로서 활성산소종을 제거하고 산화된 tocopherol을 재생하는 역할을 하며(Davey 등, 2007), 칼륨은 신경과 근육의 정상적인 기능을 돕는 필수적인 전해질이다(Youn과 McDonough, 2009). 본 추출물에는 이들 미량 영양소 외에도 maysin (21.9 mg/g)을 포함한 C-glycosyl flavone이 고농도로 존재하여, 이전의 연구에서 보고된 항산화, 항염 효과(Lee 등, 2011)를 상호보완적으로 증진시킬 수 있을 것으로 판단된다. 센티페드그라스 추출물은 우수한 항산화 활성뿐만 아니라, 영양학적 가치 또한 뛰어나 기능성 및 식품 원료로서 우수한 잠재력이 있음이 확인되었다. 즉, 비타민과 미네랄, polyphenol 복합 성분을 포함하는 센티페드그라스 에탄올 추출물은 식의약 및 화장품 분야에서 다양한 항산화 소재로서의 활용 가치가 높음을 시사한다.