국내 소비 수산자원 및 가공품 중의 비타민 A 및 E vitamers 분석 및 검증

비타민 A(retinol, β-carotene)와 비타민 E(α-, β-, γ-, δ- tocopherol) 분석을 위한 표준품은 Sigma Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 및 분석에 사용된 시약과 용매는 특급 및 HPLC 등급을 사용하였다.

시료는 연근해, 내수면, 다소비 수산물 중 표준수산물성분표(Composition Table of Marine Products in Korea, 2018)에 따라 어류, 패류, 두족류, 갑각류, 해조류, 수산가공품(건조품 및 염장품)으로 분류하고 분류군별 2종 이상의 수산자원을 샘플링하였다(Table 1). 선정된 총 20종의 시료는 비가식부를 제거한 뒤 가식부위만을 균질화한 다음 소분하여 분석실로 배송되었으며, 배송된 시료는 분석 전까지 -70°C에서 보관하며 사용하였다.

시료 5 g을 유리 추출관에 취한 후 6% pyrogallol in ethanol 용액을 10 mL 첨가하여 잘 섞이도록 10분 동안 sonication(8893-DHT, Cole-Parmer, Chicago, IL, USA) 하였다. 다음으로 추출관에 60% KOH 용액을 8 mL 넣어준 후 혼합하고, 추출관의 상부에 질소를 주입하여 공기를 치환시켰다. 질소로 치환된 추출관에 air condenser를 부착한 후 shaking water bath(HB-205SW, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea)에서 75°C, 100 rpm, 1시간 동안 반응시켜 검화(saponification)하였다. 반응이 끝난 추출관은 충분히 냉각시킨 후 2% NaCl 20 mL를 가하여 반응을 종결하였다. 검화액에 추출용매(hexane:ethyl acetate=85:15, v/v, 0.01% 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol) 15 mL를 가하여 2분간 혼합 후 암실에서 정치시켜 지용성 성분이 추출된 hexane층을 분리하였다. 분리된 hexane층은 sodium sulfate anhydrous가 채워진 유리관에 통과시켜 추출액의 수분을 제거한 후 50 mL volumetric flask에 수집하였다. 이 과정은 총 3회 반복하였으며, 추출용매를 이용하여 수집된 추출액은 50 mL로 정용하여 잘 혼합한 후 분석에 사용하였다.

비타민 A 분석은 Thomas 등(2001)의 방법에 따라 레티놀과 베타카로틴을 동시분석하였다. Saponication 법으로 추출한 추출액을 시험관에 10 mL 취해 질소로 전량 휘발시킨 후 클로로포름과 에탄올 혼합용액(1:4, v/v)을 1 mL 가하여 재용해한 후 0.45 μm membrane filter(Futecs Co., Daejeon, Korea)로 여과한 후 분석에 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC는 Shimadzu(Kyoto, Japan), column은 Vydac 201TP C₁₈(4.6×250 mm, 5 μm, GRACE, Santa Clara, CA, USA) 으로 사용하였다. 레티놀 및 베타카로틴 정량 분석을 위한 이동상은 methanol, butanol 및 DDW(deionized distilled water) 혼합용액 A(89.5:10:0.5, v/v/v)와 methanol, butanol 및 DDW 혼합용액 B(60:10;30, v/v/v)를 사용하였으며, 분석 시 사용된 gradient 조건은 Table 2에 나타내었다. 분석 시 PDA(photodiode array detector, Shimadzu)를 사용하여 각각 325 nm와 452 nm에서 검출하였으며, 이때 injection volume은 20 μL, flow rate는 1 mL/min, column oven 온도는 30°C에서 분석을 진행하였다. 섭취 시 비타민 A 활성을 나타내는 단위인 retinol activity equivalent(RAE)는 다음 식을 사용하여 계산하였다.

비타민 E 분석은 식품공전(KFDA, 2017)의 방법에 따라 분석하였다. 추출액 2 mL을 시험관에 취한 후 질소로 전량 휘발시킨 후 hexane(J.T.baker, Easton, PA, USA) 1 mL로 재용해 하였다. 그 다음 0.5 μm membrane filter(Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하여 분석에 사용하였다. 비타민 E 정량 분석을 위해 사용한 HPLC는 Shimadzu(Kyoto, Japan), column은 LiChrospher Diol 100(250×4 mm, 5 μm, Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 분석 시 FLD(fluorescence detector, Shimadzu)를 이용하여 Exλ=285 nm, Emλ=325 nm에서 비타민 E 8종 homolog(α, β, γ, δ-tocopherol(T), α, β, γ, δ-tocotrienol(T₃)를 분리 검출하였다. 이동상은 0.6% isopropanol을 함유한 hexane을 사용하여 isocratic 조건으로 분석하였고, 이때 분석시간은 50분, injection volume은 20 μL, flow rate는 1 mL/min이었다. 비타민 E 체내 활성을 나타내는 α-tocopherol equivalent(α-TE)는 다음 식을 이용하여 계산하였다.

비타민 A와 E 분석 유효성에 따른 분석법 검증은 AOAC (2002a; 202b)가 제시하고 있는 single laboratory guideline에 따라 수행하였다. 각 성분의 직선성은 각각의 표준용액을 단계적으로 희석하여 각 농도에서 3회 반복하여 HPLC로 분석하였다. 표준용액의 피크 면적과 농도를 변수로 검량선을 작성한 후 나타나는 검량선의 상관계수 값(R²)을 이용하여 직선성의 유효성을 확인하였다.

분석 검증을 위한 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 공시험액(blank)을 HPLC로 분석하여 얻은 signal-to-noise(S/N)의 평균값에 표준편차를 각각 3과 10을 곱하여 나온 값을 더하여 산출하였다. LOD 이하의 값은 ND(not detected)로 표시하였다.

분석법의 정밀성(precision)은 상업용 분유(Imperial dream XO world class 3, Namyang, Seoul, Korea)를 시료로 사용하여 하루에 5회 반복 실험한 결과와 5일간 5회 반복 실험한 결과의 표준편차를 각각 repeatability(relative standard deviation, RSD_r)와 reproducibility(RSD_R)로 나타내어 평가하였다. 정확성(accuracy)은 NIST(National Institute of Standard and Technology, Gaithersburg, MD, USA)에서 구매한 표준참고물질(standard reference material, SRM) SRM 1869(Infant/ Adult Nutritional Foemula Ⅱ(milk/whey/soy based))을 사용하였다. SRM 1869의 레티놀, 베타카로틴 및 비타민 E 함량을 분석한 후 NIST에서 제시한 참고값(certified value)과 분석값(analytical value)을 비교하여 회수율(recovery, %)을 구하여 분석법의 정확성을 평가하였다.

본 연구가 수행되는 모든 기간 동안 품질관리시료인 상업용 분유를 반복 분석하여 표준편차 5% 이내에 포함되는 10개의 데이터 값을 산출한 후 이들의 평균값을 품질관리도표(quality control(QC) chart) 작성을 위한 기준값으로 선정하였다. 품질관리도표의 관리상한선(upper control line, UCL)과 관리하한선(lower control line, LCL), 조치상한선(upper action line, UAL) 및 조치하한선(lower action line, LAL)은 다음과 같이 기준을 설정하여 시료 분석 기간동안 분석품질관리에 사용하였다.

분석 숙련도 평가를 위해 영국 식품환경연구청(Department for Environment, Food and Rural Afairs, DEFRA)에서 주관하는 국제 분석숙련도시험(analysis proficiency test) Food Analysis Performance Assessment Scheme(FAPAS)에 참여하여 결과를 비교 평가하였다. 이때 제공된 분석시험 시료는 powdered baby food였으며, 레티놀과 α-토코페롤 지표 성분을 본 연구에서 검증된 분석법을 이용하여 분석하고 전 세계에서 참가한 실험실의 분석 결과와 함께 z-score를 비교하여 숙련도를 평가하였다.

본 연구에서 비타민 A와 E 분석에 관한 직선성, 검출한계 및 정량한계는 Table 3에 나타내었다. 직선성은 각 표준품을 5-7개의 농도 수준으로 제조하여 각각 3회에 걸쳐 분석한 결과, 모든 직선성의 상관계수(R²)는 0.999 이상의 상관계수를 나타내어 본 연구에서 사용된 분석법의 직선성이 우수한 것을 확인하였다.

PDA detector를 사용하여 분석한 레티놀과 베타카로틴의 LOD는 각각 0.380 μg/100 g, 0.602 μg/100 g, LOQ는 각각 0.996 μg/100 g, 1.402 μg/100 g을 나타냈다. Domínguez 등(2017)은 HPLC-PDA를 사용하여 레티놀을 분석하였으며, 이때의 LOD와 LOQ는 각각 0.94 μg/100 g과 2.93 μg/100 g이라고 보고하였다. UV detector를 사용하여 베타카로틴을 분석한 Karnjanawipagul 등(2010)은 분석법의 LOD와 LOQ는 각각 4 μg/100 g과 11 μg/100 g이라 보고하였다. 이에 비하여 본 연구에서 사용된 분석법의 LOD와 LOQ는 약 2.5-20배 정도 낮은 것으로 나타나 수산 자원 및 식품 중 미량 함유하고 있는 레티놀과 베타카로틴을 낮은 수준까지 분석이 가능할 것으로 보인다. 한편, 비타민 E homolog 분석은 FLD를 사용하여 분석하였으며 LOD는 α-, β-, γ-, δ-T가 각각 0.0002 mg/100 g, 0.0001 mg/100 g, 0.0001 mg/100 g, 0.0001 mg/100 g, LOQ는 각각 0.0006 mg/100 g, 0.0003 mg/100 g, 0.0003 mg/100 g, 0.0002 mg/100 g으로 나타났다. HPLC-FLD로 분석한 Gornas 등(2014)은 비타민 E 각 성분의 LOD는 0.0002- 0.0005 μg, LOQ는 0.0006-0.0016 μg이라 보고하였는데, 이에 비하여 본 연구에서 적용한 비타민 E 분석법이 LOD와 LOQ가 약 10배 정도 낮은 것으로 나타나 미량 존재하는 비타민 E의 정량적 분석에 유용할 것으로 사료된다.

비타민 A와 E 분석법의 정밀성은 Table 4에 나타내었다. AOAC의 단일실험실 분석법 검증 가이드라인(2002)에 따르면 시료 농도 수준이 1 mg/100 g일 때 정밀성의 반복성과 재현성의 수용 범위는 각각 6%, 11% 이하 수준이며, 1 μg/100 g의 수용범위는 각각 8%, 16% 이하로 수용 가능한 범위를 더 넓게 나타내고 있다. 본 연구에서 비타민 A와 E에 대한 정밀성 검증 결과 모든 성분에서 반복성의 상대표준편차 RSD_r은 0.4-2.4%, 재현성의 상대표준편차 RSD_R은 1.7-4.5%를 나타냈다. 이것은 AOAC에서 제시한 단일실험실에서 확보해야 할 정밀성 기준범위보다 낮은 수준으로 본 연구에서 적용한 분석법이 수용 가능한 범위를 충족시킴을 확인할 수 있었다. 표준참고물질 SRM 1869를 분석하여 측정한 회수율은 모든 성분에서 92.2-110.4%의 범위를 나타내어 본 연구에서 적용한 분석법의 정확성이 우수함을 확인할 수 있었다(Table 5). AOAC guideline은 시료 농도 수준에 따라 회수율이 달라지므로 수용가능한 회수율 범위를 농도에 따라 1 mg/100 g일 경우 80-115%, 1 μg/100 g일 경우 70-125%로 제시하고 있다. 비타민 A와 E의 분석법의 경우 수용범위 안에 충족되는 회수율(92.2-110.4%)을 확보하여 본 연구에서 분석한 모든 성분에 대한 정량 분석법의 정확성이 우수함을 확인할 수 있다.

수산물 및 수산 가공품에 대한 레티놀 및 베타카로틴 함량은 Table 6과 같이 수산물의 군별 및 종류에 따라 넓은 차이를 나타냈다. 레티놀 함량은 어류에 속하는 눈볼대(blackthroat seaperch)에서 311.77 μg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타냈다. 베타카로틴은 가공품 중 어리굴젓(seasoned fermented oyster)이 가장 높은 함량(613.10±5.18 μg/100 g)을 보였으며 다음으로 톳(fusiformis)에서 높은 함량(440.99±18.85 μg/100 g)을 나타냈다. 한편, 수산 시료 20종 중 청어(pacific herring), 대롱수염새우(razor mud shrimp), 갈고리흰오징어(schoolmaster gonate squid), 멸치액젓(anchovy sauce), 바다대구포(dried codfish), 자반고등어(salted mackerel)에서는 레티놀과 베타카로틴 모두 검출되지 않았다. 베타카로틴의 경우 주로 식물성 식품에 존재하는데 본 연구에서 분석된 20종 중에서는 동물성 수산자원인 패류와 갑각류에서도 베타카로틴 함량이 상당량 검출되었다. 이는 이들이 해조류와 같은 식물성 수산물을 먹이로 이용하며 생육하고 있어 내장에 베타카로틴 함량이 높은 다시마와 미역과 같은 분해물들이 잔류되어 있는데, 패류와 갑각류와 같은 동물성 수산자원은 주로 내장을 포함하여 가식부로 이용되기 때문에 동물성 자원이지만 식물성에서 존재하는 베타카로틴의 함량이 27.17-335.05 μg/100 g 수준으로 함유될 수 있는 것으로 보여진다. 한편, 동물성 자원인 어리굴젓의 경우는 굴 내장에 존재하는 다시마나 미역과 같은 해조류의 잔물이 존재하는 것 외에도 가공 시 조미료로 사용되는 고춧가루로 인하여 베타카로틴 함량이 가장 높게 나타나는 원인으로 사료된다. 명란젓(seasoned pollack roe)의 경우도 가공 시 조미료로 첨가되는 고춧가루에 의해 베타카로틴 함량이 검출되는 것으로 보여진다. 반면, 두족류와 어류와 같이 내장을 불가식부로 제거하는 수산자원의 경우, 식물성 베타카로틴이 검출되지 않고 동물성 레티놀 성분만 일부 검출되었다. Moon 등(2019)은 수산물을 사용하여 조리한 해물콩나물찜과 코다리찜에선 레티놀이 검출되지 않았으나, 일부 해산물 식단에선 다량의 레티놀이 검출되었다고 보고하였으며, Park 등(2018)도 수산물이 들어간 식단에서 일부 식단의 경우 레티놀이 검출되지 않았다고 보고하여 수산자원의 종류에 따라 비타민 A 함량에 차이를 보이는 것을 알 수 있다.

수산자원의 레티놀과 베타카로틴의 함량을 함께 고려한 총 비타민 A activity(retinol activity equivalent, RAE)는 Table 6과 같다. 레티놀 함량이 절대적으로 높았던 눈볼대(311.77 μg RAE/100 g)가 가장 높은 값을 보였으며 다음으로 베타카로틴 함량이 높은 어리굴젓(74.96 μg RAE/100 g), 진주담치(blue mussel, 37.25 μg RAE/100 g) 그리고 톳(36.75 μg RAE/100 g)순으로 높게 나타났다. 한국 성인 기준 비타민 A 권장섭취량은 여성은 650 μg RAE, 남성은 800 μg RAE이다(KDRIs, 2020). 수산자원은 한국인의 식단에서 자주 섭취되는 자원으로 이를 통해 필요한 비타민 A 섭취량을 상당량 채울 수 있을 것으로 보여지며, 특히 눈볼대와 같은 수산식품의 경우 100 g의 섭취로 여성은 약 48%, 남성은 약 38%의 일일권장섭취량을 충족시킬 수 있을 것으로 보여진다.

수산물 및 수산가공품에 대한 비타민 E의 8종 vitamers 함량 분석 결과와 비타민 E activity를 α-tocopherol equivalent(α-TE)로 Table 7에 나타내었다. 본 연구에서 분석한 총 20종 수산식품에서 α-T가 모두 검출되었으나, δ-T₃는 모든 시료에서 검출되지 않았다. 수산식품의 α-T 함량은 0.07-4.72 mg/100 g의 분포를 나타냈으며, 명란젓이 4.72 mg/100 g으로 가장 높았고, 쇠미역이 0.07 mg/100 g으로 가장 낮은 것으로 나타냈다. Kim 등(2021)은 해조류의 비타민 E 분석 시 α-T를 제외한 나머지 유도체들은 검출되지 않았다고 하였으나, 본 연구에서 분석한 2종의 해조류인 톳과 쇠미역에서는 α-T와 β-T가 검출되었으며, 톳에서는 γ-T도 검출되었다. 이는 종의 차이 외에도 수산자원의 서식지, 계절 등 다양한 생육환경에 따라 검출되는 vitamers의 종류와 함량이 달라질 수 있기 때문인 것으로 보여진다.

Table 7에 제시된 α-TE는 체내 비타민 E 활성을 나타내며, γ-T₃와 δ-T₃를 제외한 비타민 E 유도체들의 체내 활성도를 고려하여 산출되었으며 수산식품 20종은 0.01-0.62의 mg α- TE/100 g의 범위를 나타냈다. 가공품 중에서는 명란젓(0.62 mg α-TE/100 g), 훈제연어(0.52 mg α-TE/100 g, 어리굴젓(0.35 mg α-TE/100 g), 청어과메기(salted dried mackerel, 0.23 mg α-TE/100 g) 순으로 높은 α-TE 값을 보였으며, 비가공품 중에서는 눈볼대(0.29 mg α-TE/100 g), 피조개(ark shell, 0.23 mg α-TE/100 g), 대롱수염새우(razor mud shrimp, 0.22 mg α-TE/100 g)의 순으로 α-TE 함량이 높게 나타났다. 가공품 중 어리굴젓과 명란젓의 비교적 높은 α-TE 값은 가공 시 첨가되는 고춧가루에 의한 비타민 E 함량의 추가적인 증가 때문인 것으로 보여진다. Kim 등(2006)은 지용성 비타민은 수분에 민감하여 손실 속도가 빨라진다고 보고하였고, Kim 등(2021)은 해조류의 생것과 건조품을 비교하였을 때 생것에선 검출되지 않았으나 건조품에선 α-T가 검출되었다고 보고하였다. 일반적으로 수산물 생것을 건조하거나 젓갈류와 같이 양념을 첨가하여 수분활성도를 낮추는 경우 존재했던 영양성분의 함량이 상대적으로 높아질 수 있으나 비타민 E와 같이 항산화능이 있는 경우 저장 및 가공 중 산화에 노출 시 그 함량이 감소될 수 있다. 본 연구에서 분석된 청어는 0.04 mg α-TE/100 g, 상당 기간 건조시켜 제조되는 수산가공품인 청어과메기는 0.09 mg α-TE/100 g을 보여주었다. 국가표준식품성분표 기준에 따르면 생것 청어의 수분함량은 66%, 말린 것은 24%로(National Standard Composition Table, 2021) 건조에 의한 수분 제거로 고형분 함량이 약 두 배 이상 증가하는 것을 보여주며 이로 인해 비타민과 같은 영양성분도 중량 당 두 배 이상 증가될 것으로 생각되며, 이 중 일부 비타민 E가 가공 및 저장 중 산화 등으로 인한 손실될 것으로 보여진다. 전반적으로 본 연구에서 분석한 7종 수산가공품의 비타민 E 함량 수준이 생것에 비하여 비교적 높게 나타나 생것으로 유통되는 수산자원뿐만 아니라 수산가공품을 통해서도 상당량의 비타민 E를 섭취할 수 있을 것으로 생각된다.

한편, ‘2020 한국인 영양소 섭취기준’에 따르면 성인 기준 비타민 E의 충분섭취량은 12 mg α-TE이며 상한섭취량은 540 mg α-TE로 알려져 있다(KDRIs, 2020). 본 연구에서 분석한 20종의 수산물 및 수산가공품의 경우 100 g 섭취 기준으로 일일기준 최대 5% 수준까지 비타민 E를 섭취할 수 있을 것으로 보여지며 다빈도 섭취를 고려해 볼 때 이들의 충족량은 더 증가할 것으로 보여진다.

비타민 A와 E의 분석품질관리는 QC chart(Fig. 1)를 작성하여 관리하였다. QC chart는 분석 기간 동안 검증된 분석법으로 분석 시 내부 및 외부 변동 요인에 의해 문제가 없는지에 대한 분석의 품질을 관리하며, 다양한 변수에 의해 영향을 받는 분석 결과를 관찰할 수 있다(Moon 등, 2019). Fig. 1에 나타난 QC chart의 분석값은 분석 시 동시에 진행하였으며, 분석값이 UCL과 LCL 범위 밖으로 벗어나는 경우, 분석 조건과 환경 등을 재점검하고 분석된 시료를 재분석하여 결과값을 비교하였다. 레티놀 1회, 베타카로틴 3회, γ-T 1회를 제외한 모든 분석성분은 관리 범위 내에 들어오는 것을 확인하였으며, γ-T의 경우 분석 조건을 점검하여 데이터로 사용하였다. 이는 본 연구에서 진행된 비타민 A와 E 분석이 모두 수용 가능한 분석 환경에서 진행되었음을 보여주며, 본 연구에서 얻어진 지용성 성분에 대한 분석값은 수산물 및 수산가공품의 데이터베이스로 활용할 수 있는 신뢰도를 나타냈다.

Fig. 1. Quality control charts of retinol, β-carotene and tocopherols. (a), Retinol; (b), β-Carotene; (c), α-Tocopherol; (d), β-Tocopherol; (e), γ-Tocopherol; (f), δ-Tocopherol.

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분석숙련도 평가를 위해 국제숙련도시험 PT-21124에 참여한 결과, 레티놀 분석에 대한 z-score는 -0.1, α-T 분석에 대한 z-score 값은 -1.1로 나타냈다(Table 8). z-Score는 표준편차를 단위로 하여 측정값이 평균에서 벗어난 정도를 평가하는 것으로, 일반적으로 ±2 이내의 범위에 들어오는 경우 국제적으로 우수한 분석숙련도를 보유하고 있음을 나타낸다. 본 연구에서 참여한 FAPAS 시험에서의 z-score는 비타민 A와 E 분석 모두 ±2 이내의 값을 나타내어 검증된 분석법을 이용한 분석을 수행하는 숙련도가 국제적인 수준으로 우수함을 보여준다 하겠다.