주정 농도에 따른 황칠나무(Dendropanax morbiferus) 부위별클로로젠산 및 루틴 함량과 항산화 활성 비교

황칠나무(잎, 줄기, 뿌리)는 경남 하동군 소재지에서 재배되고 있는 것을 농업회사법인 휴림황칠㈜로부터 제공받았으며 부위별 생산 시기는 잎의 경우 1년, 줄기는 5년, 뿌리는 15년이 된 것을 본 연구에 사용하였다. 황칠나무의 chlorogenic acid 및 rutin은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서구입하였다. 항산화 활성 측정에 사용한 시약 중 2,4,6-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphnoic acid)(ABTS) 및 2,2-diphenyl-1-picrydrazyl(DPPH) 역시 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. Methanol, acetonitrile, formic acid, water 및 acetic acid 등의 시약 및 유기 용매는 J.T.Baker사(Philipsbug, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 기타 시약은 필요에 따라서 분석용 1급 또는 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

Chlorogenic acid(CA) 및 rutin(RT) 분석은 high performance liquid chromatography(HPLC, Agilent 1200 system, Boeblingen, Germany)를 사용하였으며, 라디칼 소거활성 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH 및 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)) 측정은 Spectrophotometer(Mega-800, Scinco, Seoul, Korea)를 사용하였다.

추출물 제조 전 황칠나무 잎, 줄기, 뿌리는 각각 믹서기에곱게 분쇄하여 분말형태로 준비하였다. 열수추출물 제조는 분말 10 g에 HPLC 등급의 water 200 mL를 가하고, 80°C로 설정된 환류냉각장치에서 각 시료들은 2시간과 4시간씩 1회 추출을 실시하였다. 주정 추출 역시 상기와 같은 방법으로 30, 50, 70, 95% 발효주정 200 mL를 가하여 환류냉각장치로 추출을진행하였다. 황칠나무 부위별 추출이 끝난 후에는 감압조건에서 추출물(50 mg/mL)을 여과하여 본 연구에 사용하였다.

pH 측정은 황칠 부위별 추출물 1 mL를 취하여 pH 미터기(MP 220, Mettler Toledo, Bern, Switzerland)로 측정하였고, 산도는 증류수 49 mL와 각각의 추출물(1 mL)를 첨가하고, 0.1 N NaOH 용액으로 중화 적정하여 최종적으로는 lactic acid로 환산하여 백분율로 나타내었다. Total phenolics 함량은 널리 알려져 있는 Folin-Denis법을 Hwang 등(2018)의 논문에 따라 수행하였다. 각 추출물 500 μL를 시험관에 분주하고, 25% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 용액 500 μL를 첨가하고 3분간 1차 반응시켰다. 1차 반응 후 2 N Folin-Ciocalteu phenol 시약을 250 μL 첨가하여 37°C에서 1시간 발색반응을 진행하였다. 발색된 청색 반응물은 3분간 13,500 rpm 속도로 원심분리(Micro 12, Hanil Science Co., Ltd., Seoul, Korea)하여상등액만을 회수하여 spectrophotometer(732 nm)로 측정하였다. Total phenolic 함량 계산은 gallic acid를 이용하여 작성된 표준 검량곡선으로부터 함량(mg/g)을 산출하였다.

Flavonol 배당체 분석은 HPLC로 정량 분석하였다. Column은 Eclipse Plus C₁₈(5μm, 4.6×250 mm)을 사용하였으며, 이동상 용매 A(0.1% formic acid in water)와 B(0.1% formic acid in 90% acetonitrile)로 구성하여 분석을 수행하였다. 각용매 gradient 조건은 A 용매를 기준으로 100%(0분), 90%(4분), 40%(20분), 90%(23-30분)로 유지하였다. 각 샘플의 주입량은 20 μL, 이동상 속도는 30°C에서 분당 1 mL의 유속을유지하여 310 nm의 diode array detector (DAD)에서 검출하였다. 한편, chlorogenic acid와 rutin 표준품은 HPLC-grade water를 용매로 사용하여 0.25, 0.50, 0.75, 0.95, 1.00 mg/g의농도로 제조하여 검량선을 작성하여 아래의 식에 대입하여 mg/g으로 함량을 표기하였다.

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 Hwang 등(2018)의 논문을 약간 변형하여 수행하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 각각의 추출물(50 mg/mL) 100 μL를 96-well plate에 분주하고, DPPH(0.5 mM in etahnol) 용액 50 μL를 가하여 상온(25°C)에서 15분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디칼 소거능은 7 mM ABTS 용액(5.0 mL)과 140 mM의 potassium persulphate(88 μL)를 혼합하여 12-16시간동안 암실에서 ABTS 양이온을 형성시켰다. 이후 414 nm에서 흡광도의 값이 1.5±0.02가 되도록 phosphate buffer saline (PBS)로 조정하고, 조정된 ABTS 용액 190 μL에 각각의 추출물(50 mg/mL) 10 μL를 가하여 6분간 반응시키고 734 nm에서 측정하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성의 대조구는 모두 PBS로 대체하였으며, 아래 식에 따라 백분율로 나타내었다.

각 실험은 3회 반복 수행하였으며, 본 결과는 SPSS 12.0 packae 시스템으로 분산 분석을 실시하였으며, Duncan’s의다범위검정을 이용하여 조건별 유의차를 나타내었다.

황칠 잎, 줄기, 뿌리 추출 용매와 시간을 달리한 추출물의 pH, 산도, total phenolics 함량 비교는 Table 1에 나타내었다. 황칠 잎 추출물의 pH는 열수추출물이 추출 2시간과 4시간후에 각각 8.06 및 8.98로 다른 추출물에 비해 수치가 가장높았으며 모든 추출물에서 pH는 추출 시간이 증가할수록 약간 증가하는 것으로 나타났다. 30% 발효주정 추출물의 경우에는 7.16(2시간)-7.58(4시간), 50% 발효주정 추출물의 경우 6.54(2시간)-6.56(4시간), 70% 발효주정 추출물의 경우 6.66(2시간)-6.98(4시간), 95% 발효주정 추출물은 5.06(2시간)-5.55 (4시간) 수준으로 나타났으며, 발효주정의 농도가 증가할수록 pH 범위는 조금씩 낮아지는 경향을 보였으나 크게 감소하지는 않았다. 한편, 황칠 줄기 추출물의 경우 역시 열수추출물이 발효주정 추출물에 비해 pH가 9로 높았으며, 30, 50, 70% 발효주정의 경우 pH 범위가 7-8 수준으로 유사하였으나, 95% 발효주정 추출물의 경우에는 추출 2시간과 4시간째각각 4.36-4.68로 급격히 감소하였다. 황칠 뿌리 추출물의 경우도 황칠 잎과 줄기 추출물과 유사한 경향으로 pH는 열수추출물과 30% 발효주정 추출물에서 5.99-6.36으로 가장 높았고 발효 주정 농도가 증가할수록 pH는 감소하여 95% 발효주정 추출물은 추출 2시간과 4시간째 각각 3.19와 3.36으로 급격히 감소하였다. 황칠 잎, 줄기, 뿌리 추출물의 산도 변화는추출 시간에 따른 변화는 없었으나, 잎, 줄기, 뿌리 추출물의경우 주정 농도가 50%에서 95%로 증가할수록 산도는 조금씩 증가하였고 95% 발효주정 뿌리 추출물에서 추출 2시간과 4시간째 각각 1.36 및 1.52%로 가장 높았다. Total phenolic 함량은 황칠 잎 열수 추출물의 경우 추출 2시간째 2.17 mg/g에서 4시간째 2.29 mg/g으로 아주 약간 증가했지만 유의적차이는 없었다. 30% 발효주정 잎 추출물 역시 2.50 mg/g(추출 2시간) 및 2.52 mg/g(추출 4시간)이었고, 50%와 70% 발효주정 추출물 역시 2.15 mg/g에서 2.49 mg/g으로 유사한 함량을 나타내었다. 95% 발효주정 추출물에서는 1.06 mg/g으로 열수와 30-70% 발효주정 추출물에 비해 낮은 함량을 나타내었다. 한편, 황칠 줄기와 뿌리에서는 열수와 발효주정 추출에 따른 차이는 나타나지 않았고, 잎 추출물에 비해 그 함량은 현저히 낮았으며 전체적으로 TPC 함량은 잎 > 줄기 > 뿌리 순으로 나타났다.

천연물에 대부분 함유되어있는 항산화성 물질인 폴리페놀및 플라보노이드 화합물들은 항산화뿐 아니라, 피부질환 예방효과도 있는 것으로 보고되었다(Park과 Han, 2016). 특히, Park과 Han(2016)의 황칠나무 잎 추출물에서는 폴리페놀 함량은 74.08 mg/g, 총 플라보노이드는 97.36 mg/g으로 보고하였고, 이는 본 연구에서의 황칠 잎(열수 및 주정) 추출물에서의 함량 차이가 크게 나타났다. 이는 Park과 Han(2016)은 70% 메탄올을 사용하여 초음파 분쇄를 통해 72시간 추출하고, 용매 제거 후 동결 건조한 시료를 대상으로 폴리페놀 및플라보노이드 함량을 측정했음으로 본 연구방법과 함량 차이가 크게 나타나는 것으로 판단된다. 따라서 같은 천연물이라도 추출 용매와 추출 시간, 각 시료들의 전처리 상태(휘발성 용매 제거 등)에 따라 여러 상이한 결과가 도출되는 것으로사료된다.

황칠 부위별(잎, 줄기, 뿌리) 열수와 발효주정 추출물의 CA와 RT 함량을 분석한 결과는 Table 2와 Fig. 1에 나타내었다. 황칠 잎 추출물 중 열수추출에서 CA는 추출 2시간째 7.06 mg/g이었고, 4시간째에는 6.98 mg/g으로 추출 시간에따라 함량이 증가하거나 감소하는 변화는 없었다(Table 1). RT 역시 추출 2시간(12.16 mg/g)과 4시간(12.44 mg/g) 함량은 유사하였다. 황칠 잎 30% 발효주정 추출의 경우 CA는 추출 2시간(Fig. 1A)과 4시간째 각각 4.42-4.27 mg/g으로 열수추출에 비해 낮은 함량이 검출되었다. 50% 발효주정 추출 역시 2시간째 4.56 mg/g이었고(Fig. 1B), 추출 4시간째 6.60 mg/g으로 함량에 큰 차이는 나타나지 않았다. 그러나 70% 발효주정 추출물에서는 추출 2시간째 12.33 mg/g으로 열수추출과 발효주정 30%와 50%에 비해 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1C). 그러나 추출 4시간째에는 5.53 mg/g으로 감소하였다. 95% 발효주정 추출물은 추출 2시간과 4시간째 1.11 mg/g과 2.01 mg/g이 검출되었으며, 95% 발효주정에서는 CA와 RT가 거의 용출되지 않는 것으로 사료된다(Fig. 1D). RT는 95% 발효주정 추출을 제외하고 열수와 모든 발효주정 추출물에서 비교적 많은 양이 용출되는 것으로 결과가 도출되었다. 황칠 잎 열수추출물의 경우 추출 2시간째 RT 함량은 12.16 mg/g이었고 30% 발효주정의 경우 추출 2시간째 14.60 mg/g, 50% 발효주정의 경우 11.71 mg/g, 70% 발효주정 추출물에서는 14.09 mg/g으로 가장 많은 양이 검출되었다(Table 2). 한편, 황칠 줄기와 뿌리의 경우에는 잎 열수와 발효주정 추출물에 비해 월등히 낮은 함량을 보였으며, 이를 통해 황칠 잎에는 CA와 RT가 풍부하게 함유되어 있으나, 줄기와 뿌리의 경우에는 그렇지 않은 것으로 판단된다.

Fig. 1. Comparison of HPLC chromatogram of Dendropanax morbiferus extract according to ethanol concentration. A, leaf-30% fermented alcohol (2 h); B, leaf-50% fermented alcohol (2 h); C, leaf-70% fermented alcohol (2 h); D, leaf-95% fermented alcohol (2 h).

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황칠나무에는 chlorogenic acid(CA)와 rutin(RT)과 같은성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Hyun 등, 2013). Youn 등(2018)의 황칠나무 추출물 연구에서는 황칠 잎의 경우 CA와 RT가 검출되었는데, CA보다 RT 함량이 약 5배 이상 많은 것으로 보고하였다. 본 연구 또한 이 추출물의 경우 5배 이상 함량 차이가 나지는 않았으나, 전반적으로 CA보다는 RT 함량이 좀 더 많은 것으로 나타나 Youn 등(2018)의결과와 유사한 것으로 판단된다. 또한, Youn 등(2018)은 주정(추출용매)의 비율이 높을수록 CA 및 RT 성분이 많이 용출되는 것으로 보고하였고, 이는 70% 주정에서 추출 2시간째 CA와 RT 함량이 가장 높았으므로 본 연구 결과와도 일치하였다.

황칠 부위별(잎, 줄기, 뿌리) 열수 및 발효주정 추출물에따른 항산화 활성 비교 결과는 Fig. 2에 나타내었다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 추출시간과 관련하여 활성에변화가 있지는 않는 것으로 나타났다. 황칠 잎 열수추출 2시간째 DPPH 라디칼 소거활성은 62.33%였고, 4시간째 추출물에서는 62.43%로 동일하였다. 30% 발효주정 추출 시에도 마찬가지로 추출 시간에 따른 활성 변화는 없었으며, 2시간과4시간째 각각 60.05% 및 61.86%를 나타내었다. 50% 발효주정 추출 시에는 열수와 30% 발효주정 추출물에 비해 51.29% (2시간) 및 51.48%(4시간)로 약간 감소하였다. 70% 발효 주정 추출물에서는 85%로 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 보였다. 95% 발효주정 추출물은 46.81%(2시간) 및 47.14%(4시간)의 라디칼 소거활성을 보였다(Fig. 2A). 한편, ABTS 라디칼 소거활성 역시 70% 주정 추출물(잎)에서 110%로 가장 높았다(Fig. 2D).

Fig. 2. Comparison of DPPH and ABTS radical scavenging activities of Dendropanax morbiferus extracts according to ethanol concentration. All values within a column with different superscript letters are significantly different from each other at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. A, leaf; B, stem; C, root DPPH assay; D, leaf; E, stem; F, root ABTS assay.

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항산화 활성의 기작은 항산화 물질이 인체내에서 노화와세포손상을 일으키는 free radical을 소거함으로써 산화를 방지하는 것이다(Lee 등, 2015). 특히, Lee 등(2015)은 황칠나무 잎 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 추출물의 농도가 5, 1, 0.5, 0.1 mg/mL일 때 각각 89.8%, 76.4%, 44.7%, 19.1%로 보고하였고, 농도 감소에 따라 라디칼 소거활성이 감소하는 것으로 보고하였다. 이 결과는 본 연구결과와 비교하였을 시 항산화 활성(%) 수치는 서로 다르게 나타났지만, 추출물의 농도와 측정방법 차이에 의한 것이라 판단된다. 한편, 구실잣밤나무의 경우 사용한 추출용매 종류에 따라 DPPH 라디칼 소거활성 차이가 있었고, 물추출물이 가장 높았으며, 에탄올과 에틸아세테이트 등의 용매의 경우 합성 항산화제(BHA)와 유사한 활성도를 나타냈다고 Kim 등(2011)은 보고하였다. 이러한 차이는 식물 종류에따른 차이가 가장 크다고 생각되며, 추출용매 종류와 추출방법에 따라서도 항산화 활성 등의 효능은 각기 다른 양상을나타내는 것으로 판단된다. 끝으로, 본 연구에서 제조된 황칠나무(잎) 주정 추출물의 경우, 70% 발효주정 추출물에서 CA 및 RT 함량이 가장 많이 용출되었으므로 황칠나무 잎에서 CA와 RT 최적 추출조건은 추출온도 80°C, 추출용매는 70% 주정, 추출시간은 2시간인 것으로 결론을 도출하였다.