국내육성 품종 ‘하례조생’의 생리활성 성분과 항산화 활성

본 연구에 사용된 하례조생은 2018년 9월부터 12월까지 국립원예특작과학원 감귤연구소에서 시료를 채집하여 실험을 수행하였다. 시기별로 채집된 ‘하례조생’은 과육과 과피를 분리하여 건조 후 분쇄하여 70% 에탄올로 3회 반복 추출하였다. 70% 에탄올 추출물은 농축 후 사용하였으며 추출 수율은 28-35%로 나타났다. DPPH, ABTS, sodium nitroprusside, folin-ciocalteus, thiobarbituric acid, EDTA 등 항산화 활성 분석을 위한 시약은 Sigma-Aldrich Co.(St, Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

‘하례조생’ 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis(13)법을 이용하여 비색 정량하였다. 추출물 100 μL에 증류수 900 μL를 넣고, Folin-ciocalteus' phenol reagent 100 μL를 첨가하여 실온에서 5분간 반응 시킨 후 Na₂CO₃ 용액 (7%, w/v) 200 μL와 증류수 700 μL를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 흡광도는 SpectraMax^Ⓡ M3 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 720 nm에서 측정하였고, gallic acid를 이용하여 작성한 표준검정곡선을 이용하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.

DPPH radical 소거 활성 실험은 Blosis 방법(14)을 사용하였다. 0.2 mM로 준비된 DPPH 용액과 농도별로 준비된 시료를 섞어 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이 때 사용된 대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다.

ABTS radical 소거활성은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합 후 실온 암소에서 15시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 후 이 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 준비하였다(15). 준비된 ABTS 용액 180 μL에 추출물 20 μL를 가하여 실온에서 15분 동안 방치한 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

NO radical 소거 활성은 Marcocci 등(16)의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도별로 준비된 시료 100 μL와 PBS에 녹인 5 mM sodium nitroprusside 100 μL를 25℃에서 30 분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 Griess reagent 100 μL를 첨가한 후 25℃에서 15분간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정한다.

Hydroxyl radical 소거활성은 Kunchandy와 Rao(17)의 방법을 변형하여 사용하였다. 실험을 위해 준비한 reaction mixture(1 mL)는 28 mM 2-deoxy-D-ribose 100 μL, 1.04 mM EDTA 100 μL, 200 μM FeCl₃ 100 μL, 1 mM H₂O₂ 100 μL, 1 mM ascorbic acid 100 μL로 준비되어 있는 용액에 추출물 500 μL를 혼합 후 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 1%의 thiobarbituric acid 1 mL와 2.8% trichloroacetic acid 1 mL을 첨가한 후 100℃에서 20분간 반응 후 식힌 다음 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Hydrogen peroxide 소거 활성 측정은 농도별 시료 20 uL에 0.1 mM H₂O₂, 50 mM sodium phosphate buffer를 넣고 37℃에서 5분간 반응하였다. 반응이 끝난 용액에 0.1 mM ABTS와 0.15 U/mL peroxidase를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

FRAP(ferric reducing antioxidant power)법에 의한 항산화 활성은 96 well plate에 시료 20 μL, FRAP 기질액(300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액, 20 mM FeCl₃·7H₂O를 각각 10:1:1 (v/v/v)로 혼합한 용액 180 μL를 넣어 혼합한다(18). 혼합 용액은 암소에서 30분간 반응시킨 후 590 nm에서 흡광도를 측정하였으며, FeCl₃·7H₂O를 표준물질로 하여 얻은 표준검정곡선으로부터 계산하였다.

Flavonoid 성분 분석을 위한 시료는 70% 에탄올로 추출, 농축하여 용매에 녹여 0.22 μm PVDF filter(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로 여과한 후 High Performance Liquid Chromatography(HPLC, e2695 Separations module, Waters Co., Ltd., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 column은 YMC-Triart C18, 250×4.6 mm, S-5 μm, 8 nm을 사용하였고 detector는 UV/Visible Detector(Waters 2489, Waters Co., Ltd., Miliford, MA, USA)을 사용하였다. 유속은 1 mL/min을 유지하였고 UV 280 nm에서 검출하였다. 표준물질은 감귤류에 많이 함유되어 있는 10종의 플라보노이드를 사용하였으며 종류에 따라 3가지 조건으로 나누어 분석하였다. Rutin, narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin은 이동상 조건이 acetonitrile: 20 mM phosphoric acid=2:8이다. Quercetin, naringenin, hesperetin의 분석을 위한 이동상 조건은 acetonitrile: 20 mM phosphoric acid=4:6으로 수행하였고, nobiletin과 tangeretin의 이동상 조건은 acetonitrile: 20 mM phosphoric acid= 6:4로 수행하였으며 모든 시약은 HPLC grade를 사용하였다. 표준검량선 작성은 각각의 표준물질을 에탄올로 1:1 비율로 6단계 희석하여 15.625 μg/mL부터 1,000 μg/mL의 농도의 표준물질을 이용하여 작성하였다. 표준물질로 작성된 표준검량선으로 플라보노이드 성분들의 정량 분석에 사용하였다.

β-cryptoxanthine 분석은 YMC C18-triart 컬럼을 사용하였고, 전개용매로는 ethyl acetate:acetonitrile(with 0.2% formic acid)를 60:40, flow rate은 1 mL/min으로 HPLC를 수행하였다. 데이터 분석 S/W는 Waters의 Empower System을 사용하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복하여 이루어졌으며, 실험 결과는 각 항목에 따라 평균과 표준편차로 나타내었다. 실험군과의 차이는 SAS package(Statistical Analysis Program, version 9.1)을 사용하여 Duncan’s mutiple range test로 평균을 비교하여 나타내었고, p<0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.

식물계에 널리 분포되어 있는 페놀류 화합물은 강한 항산화 활성으로 자유라디칼 소거 활성이 우수하며, 다양한 구조와 분자량을 가지는 것으로 알려져 있다. 페놀류 화합물은 phenolic hydroxyl(-OH)기를 갖고 있어 단백질 및 기타 거대분자들과 쉽게 결합하여 효과적으로 활성산소종을 제거한다. 또한 산화 및 노화를 억제하는 항산화 효과뿐만이 아니라 항암, 콜레스테롤 저해, 정장 작용 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다(19-21). 이러한 페놀류 화합물은 특히 감귤에 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다, 감귤류 중 국내 육성 품종인 하례조생의 과육(HRFE)과 과피(HRPE) 추출물에서 시기별로 총 폴리페놀 함량을 분석하여 기능성 소재로 활용하기 위한 적절한 시기를 알아보고자 하였다. 시기별 함량 분석을 위해 9월부터 한 달 간격으로 12월까지 채집하였고 총 폴리페놀 함량 측정을 위해 gallic acid를 표준물질로 사용하였으며, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 하례조생의 총 폴리페놀 함량은 9월의 HRFE와 HRPE에서 2.95 mg/100 g과 4.92 mg/100 g 함량으로 가장 높았으며, 완숙 될수록 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 완숙될수록 감소하는 총 폴리페놀 함량은 미숙과 시기인 9월과 12월 과피에서는 약 1.5배의 함량 차이를 보여 함량의 변화는 과피에서 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 미숙과 시기에 총 폴리페놀 함량이 높은 결과는 재래귤인 병귤을 이용한 시기별 폴리페놀 함량 분석 결과와도 유사하게 나타났다(22). 이러한 시기별로 다른 폴리페놀류 화합물의 함량은 항산화 활성에 영향을 미칠 것으로 예상하여 다양한 방법으로 항산화 활성을 측정해 보고자 하였다.

Fig. 1. Total polyphenol contents of HRFE and HRPE. Results are mean ±SD of data from three derterminations recorded for at least two independent extractions. HRFE: Haryejoseang flesh extract. HRPE: Haryejoseang peel extract.

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시기별로 총 폴리페놀 함량에 차이를 보이는 하례조생 추출물의 항산화 활성 측정은 free radical 소거능을 보기 위한 DPPH, ABTS, hydroxyl, superoxide anion, NO radical과 hydrogen peroxide 소거활성을 측정하였으며, 산화 및 환원 반응에 의한 메카니즘으로 항산화 활성을 측정하게 되는 FRAP를 측정하였다. 항산화 활성 측정 방법 중 가장 간편하면서 신뢰성이 높아 많이 사용되고 있는 DPPH radical 소거 활성은 화학적으로 유도되어 비교적 안정적인 DPPH radical이 전자를 공여 받으면 고유의 보라색이 없어지는 것으로 활성을 측정하게 된다. 그 결과 HRPE에서의 활성이 우수하였으며, 시기적으로는 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 9월의 시료에서 가장 높았다. DPPH radical 소거 활성은 Fig. 2(A)에 나타낸 것처럼 HRPE에서는 시기적으로 9, 10, 11, 12월에 IC₅₀이 0.78±0.05, 1.13±0.09, 1.26±0.13, 1.29±0.13 mg/mL이었고, HRFE에서 IC₅₀은 2.01±0.15, 2.21±0.19, 3.04±0.21, 3.08±0.28 mg/mL인 것을 확인 할 수 있었다. ABTS radical 소거 활성은 ABTS와 potassium persulfate가 반응하여 밝은 청색을 띤 ABTS radical을 형성하며, 수소를 공여하는 항산화 활성을 지닌 물질과 반응 시 감소되면서 무색으로 변색된다. ABTS radical 역시 DPPH radcial과 같이 합성된 radical로 상당히 안정적이며, 수용성 및 지용성 물질에 모두 적용 가능하다는 점에서 항산화 활성 측정 시에 많이 이용되고 있다. HRPE와 HRFE의 ABTS radcial 소거 활성은 HRPE에서 시기적으로 9, 10, 11, 12월에 0.14±0.01, 0.19±0.01, 0.22±0.02, 0.27±0.03 mg/mL, HRFE에서 0.36± 0.03, 0.43±0.03, 0.59±0.04, 0.59±0.04 mg/mL의 IC₅₀의 활성을 보였으며, 이는 DPPH radcial 소거 활성과 같은 경향으로 HRPE 중 9월의 시료에서 radical 소거활성이 가장 높았다.

Fig. 2. Antioxidative activities of HRFE and HRPE. Free radical scavenging activity of (A) DPPH, (B) ABTS, (C hydroxyl, and (D) superoxide anion. The data are presented as mean±standard deviation. Results are mean±SD of data from three determinations recorded for at least two independent extractions. HRFE: Haryejoseang flesh extract. HRPE: Haryejoseang peel extract.

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DPPH와 ABTS radical 소거활성은 양성 대조군인 ascorbic acid의 IC₅₀인 8.9 μg/mL과 6.6 μg/mL인 활성과 비교하면 낮은 활성이지만 총 폴리페놀 함량과 비례하여 radical 소거활성은 증가하는 것을 확인할 수 있었다. DPPH radical 소거활성에서 총 폴리페놀 함량과의 상관관계는 R²=0.98(HRFE)와 R²=0.75(HRPE)로 나타났다(data not shown).

Superoxide anion, hydroxyl, NO radical과 hydrogen peroxide과 같은 활성산소종(ROS)은 정상적인 세포내 필요한 에너지 생산을 위한 생화학적인 산화과정에서 생성되며, 비공유전자를 갖고 있기 때문에 매우 불안정하고 반응성이 높아 생체내 세포와 조직의 구성성분을 쉽게 공격하는 것으로 알려져 있다(23), 특히 hydroxyl radical은 반응성이 매우 크고 반응 속도가 빠르며 지질의 산화 및 DNA에 손상을 주고 돌연변이를 유발하여 다양한 질환에 관여하는 자유라디칼 중 가장 강한 독성을 갖는 활성산소이다. 이러한 hydroxyl radical에 HRFE와 HRPE 모두 강한 항산화 활성을 보였으며 9월의 HRPE에서 IC₅₀이 0.126 mg/mL로 가장 우수하였으며 이는 HRFE에서 가장 활성이 우수한 9월의 활성(0.228 mg/mL)보다도 1.8배 활성이 높았다(Fig. 2(C)). 또한 superoxide anion radical 소거 활성에서 역시 HRPE에서 활성이 우수하였으며 그 중 HRPE 9월의 시료에서는 IC₅₀이 0.14 mg/mL로 HRFE에서 가장 우수한 활성인 9월 시료의 0.418 mg/mL보다 약 3배나 높은 활성을 보였다(Fig. 2(D)). 양성 대조군인 ascorbic acid의 IC₅₀은 0.012 mg/mL로 나타났다. 이는 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 HRPE의 9월 시료에서 공통적으로 우수한 활성이 나타나고 있어, 하례조생 추출물에 다량 함유되어 있는 페놀성 화합물의 영향으로 여겨진다.

활성산소종 중의 하나인 hydrogen peroxide는 과산화지질의 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 하례조생 추출물인 HRFPE와 HRPE를 10 mg/mL의 농도로 처리 시 HRFE에서는 15%미만의 저해활성을 보였고(data not shown), HRPE 중 9월의 시료에서는 38%의 저해활성을 확인할 수 있었다(Fig. 3(A)). 이는 50 μg/mL 농도의 ascorbic acid가 갖는 20% 소거 활성보다 높게 나타났다. NO는 생체내에서 NO synthase(NOS)라는 효소의 작용을 통해 L-arginine으로부터 생성되는 반응성이 강한 radical이다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 과잉 생산된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증 반응을 촉진 시킬 뿐만 아니라 염증 매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 NO 소거 활성 측정을 위해 HRFE와 HRPE를 처리하였으나 HRFE에서는 소거 활성을 확인 할 수 없었고, HRPE는 5 mg/mL로 처리하였을 때 9월의 시료에서 40% 정도의 소거활성을 확인할 수 있었다(Fig. 3(B))(24,25).

Fig. 3. Antioxidative activities of HRFE and HRPE. Free radical scavenging activity of (A) hydrogen peroxide, (B) nitric oxide. The data are presented as mean±standard deviation. Results are mean±SD of data from three determinations recorded for at least two independent extractions. HRFE: Haryejoseang flesh extract. HRPE: Haryejoseang peel extract.

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HRFE와 HRPE의 환원력을 알아보기 위해 FRAP 방법을 사용하였다. FRAP법은 총 항산화능을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferri tripyridyltriazine(Fe³⁺-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine(Fe²⁺-TPTZ)으로 환원되는 원리를 이용한 것으로 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점을 이용하여 개발된 방법이다. HRFE와 HRPE의 환원력을 측정한 결과 9, 10, 11, 12월에서 농도가 증가함에 따라 환원력도 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 0.5 mg/mL의 농도에서 나타나는 시기별 추출물의 환원력을 Fig. 4에 나타내었다. FRAP 환원력에서 역시 HRPE의 9월에 활성이 가장 우수하였다. 시기별 하례조생 추출물인 HRFE와 HRPE의 항산화 활성을 측정한 결과 HRPE의 9월에 항산화 활성이 가장 우수하였고, 이 시기에 총 폴리페놀 함량이 가장 많이 함유되어 있었다.

Fig. 4. Ferric ion reducing antioxidant powers of HRFE and HRPE. The data are presented as mean±standard deviation. Results are mean±SD of data from three determinations recorded for at least two independent extractions. HRFE: Haryejoseang flesh extract. HRPE: Haryejoseang peel extract.

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항산화 활성은 폴리페놀 화합물의 함량과 높은 상관관계(26)가 있다고 알려져 있다. 하례조생 추출물인 HRFE와 HRPE 역시 폴리페놀 함량과 비례하여 항산화 활성이 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 총 폴리페놀의 함량이 가장 높은 9월의 HRPE에서 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 여겨진다.

항산화 활성이 우수한 하례조생 추출물인 HRFE와 HRPE의 bioactive 화합물 분석은 HPLC를 이용하여 감귤류에 다량 함유되어 있는 것을 알려진 플라보노이드와 카로티노이드를 분석하고자 하였다. 플라보노이드는 자연계에 널리 분포하는 폴리페놀에 속하는 성분으로, C6-C3-C6이 기본 골격인 담황색 또는 노란색의 화합물로 flavanone, flavone, flavonol, isoflavone, anthocyanidin으로 구분할 수 있다(27). 감귤의 플라보노이드는 과피에 집중적으로 존재하고, 감귤류에서만 보고되고 있는 polymethoxylated flavones(PMF)인 nobiletin과 tangeretin이 포함되어 있어 혈소판 응집 억제, 임파구 증식 억제, 항염증 등의 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 플라보노이드는 시기별로 과육과 과피를 분리하여 추출한 70% HRFE와 HRPE를 이용하여 분석하였다. HRFE와 HRPE의 플라보노이드 분석은 배당체를 갖는 플라보노이드(rutin, narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin), 배당체가 없는 플라보노이드(quercetin, naringenin, hesperetin), 그리고 메톡시기를 갖는 플라보노이드(nobiletin, tangeretin)(Fig. 5)로 나누어 분석하였다. 그 결과 narirutin>hesperidin>rutin>nobiletin>tangeretin 순으로 함량이 높은 것을 확인 할 수 있었다(Table 1). 과육추출물인 HRFE보다 과피추출물인 HRPE에서 함량이 더 높고, 시기적으로는 9월에 플라보노이드 함량이 가장 높았으며 완숙될수록 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 하례조생에 함유되어 있는 플라보노이드 중 미숙과 시기인 풋귤에서 높은 함량을 보이는 narirutin과 hesperidin은 풋귤추출물을 이용한 화장품 등의 소재로 활용시 원료 표준화를 위한 지표성분으로 사용이 가능할 것으로 여겨진다. 또한 감귤류에만 함유되어 있는 것으로 알려진 PMF인 nobiletin과 tangeretin의 함량도 9월의 과피 추출물에서 각각 270.8±23.5 mg/100 g과 102.6±8.8 mg/100 g으로 가장 높게 나타났다. 감귤류에만 다량 함유되어 있는 것으로 알려진 PMF는 항바이러스, 항암, 항염 등의 활성과 활성 산소종으로부터 피부를 보호하는 것으로 알려져 있으며, 감귤류 중 재래귤인 병귤과 진귤 등에서만 함량이 높게 나타났으나 하례조생의 bioactive 성분을 분석한 결과 미숙과 시기인 9월에 PMF의 함량이 높은 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 5. HPLC chromatogram of flavonoids of standard, HRFE and HRPE. A) standard 1 (1. Rutin; 2. Narirutin; 3. Naringin; 4. Hesperidin; 5. Neohesperidin,), (B) HRFE, (C) HRPE, (D) standard 2 (6. Nobiletin; 7. Tangeretin), (E) HRPE.

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감귤류의 또 다른 지용성 색소 성분인 카로티노이드는 빨간색, 주황색, 노랑색을 내는 천연색소 성분으로 식물, 조류, 효모 등 자연계에 널리 분포되어 있으며, 600여종의 카로티노이드 화합물이 보고되어 있다. 식품에 주로 존재하는 카로티노이드는 lutein, zeaxanthin, β-cryptoxanthin, α-carotene, β-carotene, lycopene 등이 있으며, 비타민 A의 전구체 역할과 함께 항산화, 항염, 심혈관질환 예방, 면역 활성 등이 보고되어 있다. 카로티노이드 성분 중 특히 감귤류에 다량 함유되어 있고 폐경기 여성의 골다공증을 억제하고 항암, 항염 등의 활성을 갖는 것으로 알려진 β-cryptoxanthin을 하례조생에서 분석하고자 하였다(28,29). 그 결과 β-cryptoxanthin의 함량은 하례조생의 수확시기인 11월과 12월에 1.86 mg/100g과 1.72 mg/100g로 가장 높았고, 플라보노이드 성분과 달리 완숙될수록 증가하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig 6). 감귤의 과육에 다량 함유되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 6. The β-cryptoxanthin contents of HRFE according to maturation Changes of β-cryptoxanthin contents of ‘Haryejoseang’ according to maturation. Results are mean±SD of data from three determinations recorded for at least two independent extractions. HRFE: Haryejoseang flesh extract.

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감귤에 함유되어 있는 bioactive compound를 분석한 결과 완숙될수록 감소하는 성분과 증가하는 성분을 확인 할 수 있었으며 그 중 플라보노이드와 구연산 등은 완숙될수록 감소하고, β-cryptoxanthin과 비타민C의 경우는 완숙될 수록 증가하는 것을 확인 할 수 있었다(data not shown). 시기별로 다양한 bioactive 화합물을 함유하는 하례조생은 우수한 항산화 및 항염 활성의 천연 소재로의 활용이 가능할 것으로 여겨진다.