탄닌계 색소를 함유한 식물의 열수추출물과 효소추출물의 항산화 및 항세균 활성

본 연구에 사용된 옻나무(케브라초), 가자나무(미로발란), 밤나무 껍질(체스넛), 아카시아(와틀)은 2018년 3월에 경북 영천시에서 구입하여 사용하였으며, 시료의 학명, 일반명, 사용된 부위 및 적용 효소에 대해서는 Table 1에 나타내었다. 열수추출은 건조된 시료 100 g에 증류수를 가하여 1 L로 맞춰 100℃에서 4시간 가열하고 여과한 후, 감압농축 및 동결건조 과정을 거쳐 분말화하여 실험에 사용하였다. 효소추출은 시료의 특성, 에너지 효율, 추출시간을 달리하여야 하나, 일반 열수 추출과의 비교를 위해 저온조건인 60±2℃에서 4시간 효소반응 및 추출을 동시에 진행한 후 효소 불활성화를 위해 90℃에서 30분 노출시킨 후 추출액은 고밀도 포켓 필터를 사용해 여과, 농축, 동결건조를 통해 분말화한 후 사용 전 까지 4℃에서 보관하였다. 또한 효소추출 조건을 설정하기 위하여 사용한 효소는 식품첨가물로 고시되어 있는 Novozyme사(Denmark)의 효소를 사용하였다. 내열성 전분분해효소(α-amylase)인 Termamyl, 중온성 전분분해효소(α-amylase)인 Ban800MG, 셀룰로우즈 분해효소인 Cellu-Bio를 사용하여 소재의 안전성을 높였고, 효소 처리량은 시료 100 g에 중량 대비 4 g을 각각 처리한 후 증류수를 가하여 1 L로 맞춘 후 pH는 중성조건에서 진행되었다. 실험에 사용된 용매 및 시약은 Duksan(GR grade), Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

추출된 시료의 총 폴리페놀 함량을 평가하기 위해 Folin-Ciocalteu법(7)을 이용하였다. 즉 시료 100 μL와 Folin-Ciocalteu 시약 50 μL, 20% Na₂CO₃ 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 반응시킨 후, 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준검량곡선을 표준선으로 하여 계산하였으며, 총 폴리페놀 함량을 추출물 시료 1 mg 중 존재하는 양으로 계산하여 단위를 gallic acid equivalents(GAE mg/g)로 작성하였다. Gallic acid의 농도는 10-500 μg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 765 nm에서 흡광도를 평가하여 작성하였다.

Brand-Williams 등의 방법(8)에 따라 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 6×10^-5 M DPPH를 methanol에 녹인 후, DPPH 라디칼 용액 900 μL와 시료 100 μL를 혼합하여 5분간 반응시킨 후 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼의 소거능은 아무 것도 첨가하지 않은 대조군과 시료 첨가 후 흡광도의 변화로 하여 다음 식으로 계산하였다.

시료의 농도별 DPPH 라디칼 소거능(전자공여능, %)을 도식화하여 전자공여능 50%일 때의 시료 농도를 50% 소거농도(IC₅₀)로 나타내었다.

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 라디칼 소거활성을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(9)에 의하여 측정하였는데, 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate를 섞어 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시켜 냉장 보관하였으며, radical stock solution은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02이 되도록 에탄올로 희석하였다. 이 용액 0.9 mL에 농도별로 제조한 각 시료용액 0.1 mL를 가한 후 실온에서 7분간 반응시킨 후, 반응액의 흡광도 변화를 734 nm에서 측정하였다. ABTS⁺ radical cation decolorization 정도는 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

지질 과산화물을 측정하기 위하여 쥐의 간 조직을 phosphate buffer saline(PBS)을 사용하여 4℃에서 균질화하였다. 그 후 10,000 rpm에 5분 동안 원심분리하여 상층액을 사용하였다. 0.15 M potassium chloride와 각각의 균질화된 조직 500 μL에 시료를 처리하여 20 mM ferric chloride 100 μL를 가하였다. 그 후 37℃ incubator에서 30분간 반응시킨 후 15% TCA, 0.38% TBA와 0.5% BHT가 포함된 0.25 N cold-HCl을 500 μL를 첨가하였다. 90℃에서 60분간 열을 가해준 후 5,000 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 흡광도 532 nm 파장에서 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)를 측정하였다(10).

식물 추출물에 대한 항균 실험을 하기 위해 그람 양성균인 Listeria grayi와 그람 음성균인 Escherichia coli가 사용되었다. Disc diffusion method법(11)을 이용하여 식물 추출물의 항균 활성을 검증하였다. 디스크 확산법을 실험하기 하루 전에 각각의 균주를 각 배지 5 mL에 24시간 동안 200 rpm으로 배양한 후 사용하였으며, 균수를 1×10⁶ cfu/mL로 보정하여 실험을 진행하였다. 고체배지에 배양한 액상 균주를 골고루 도말한 후 직경 8 mm의 paper disk에 식물 추출물을 절대 농도로 1 mg이 되도록 처리하여 완전히 흡수시킨 후 이 paper disk를 고체배지에 놓고 37℃ incubator에서 16시간 배양시켜 시료를 처리한 paper disk 주위의 inhibition zone(clear zone)의 직경을 측정하여 비교 분석하였다.

식물계에 널리 분포되어 있는 페놀성 화합물은 분석이 간편하여 초기 모니터링 실험으로 많이 사용되고 있으며 페놀성 화합물 함량이 높을수록 항산화, 항균, 항암작용 등의 다양한 생리 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(12). 페놀성 화합물 중 대표적인 유효물질로 탄닌 성분을 꼽을 수 있으며 이들의 유익한 효능을 확보하기 위해 실험을 진행하였다. 본 실험에서 사용된 식물 추출물의 총 페놀 함량(TPC, total phenolic contents)의 분석 결과는 Fig. 1에 나타난 바와 같다. 분석된 열수추출물의 TPC는 0.33-0.63 GAE mg/g의 범위를 나타내었는데 그중 옻나무(케브라쵸) 열수추출물이 0.63 GAE mg/g 으로 다른 추출물에 비해 높은 수준으로 분석되었다. 그리고 효소추출물의 TPC는 0.52-0.78 GAE mg/g의 범위를 나타내었는데 옻나무(케브라쵸) 효소추출물이 0.78 GAE mg/g으로 열수추출물과 마찬가지로 가장 높게 나타났다. 두 추출 조건을 비교해 볼 때 100℃ 열수추출물 보다 저온 효소 추출물에서 높은 수준의 총 페놀성 화합물이 검출되어졌다. 일반적으로 천연 식물에 함유된 페놀 화합물은 유해한 라디칼에 전자를 공여하여 라디칼을 제거함으로써 체내의 산화적 스트레스를 경감시켜 주는데, 페놀 함량과 항산화 활성은 양의 상관관계를 나타낸다.

Fig. 1. Total phenolic contents of various plants. Open bars are hot-water extracts and dark gray bars are enzyme extracts. Data are expressed as mean±SD of triplicate experiments.

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DPPH는 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(13). 열수추출 및 효소반응 추출에 의해 얻어진 식물추출물의 전자공여능을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. DPPH 라디칼 소거활성은 라디칼을 50% 소거하는데 필요한 물질의 농도로 나타낼 수 있으며 이 농도는 낮을수록 우수한 활성을 가진다. 열수추출에 의해 얻어진 소재에서는 밤나무 껍질(체스넛) 추출물이 9.4 μg/mL, 아카시아(와틀) 12.91 μg/mL, 옻나무(케브라쵸) 15.4 μg/mL, 가자나무(미로발란) 21.5 μg/mL 순으로 나타났으며, 효소추출물은 가자나무(미로발란) 3.7 μg/mL, 밤나무 껍질(체스넛) 5.95 μg/mL, 옻나무(케브라쵸) 6.02 μg/mL, 아카시아(와틀) 6.58 μg/mL 순으로 4종 모두에서 우수한 활성을 나타내었다. 비교 물질로 주로 사용되는 ascorbic acid의 IC₅₀이 5-10 μg/mL 수준인 것을 감안해 볼 때 효소추출물의 DPPH 라디칼 소거능력은 상당히 높은 수준의 항산화력을 가지는 것을 확인하였다(14).

Fig. 2. DPPH radical scavenging activity of hot-water extracts (open bars) and enzyme extracts (dark gray bars) from various plants. The concentrations (IC₅₀) required to exert 50% of DPPH radical were tested. Data are expressed as mean±SD of triplicate experiments.

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ABTS⁺와 potassium persulfate를 암소에 방치하면 ABTS⁺ 라디칼이 생성되는데 추출물의 항산화력에 의해 ABTS⁺ 라디칼이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색된다(15). 이와 같이 ABTS⁺ 라디칼 탈색반응은 이미 생성된 자유라디칼의 제거 정도를 흡광도로 나타내어 ABTS⁺ 라디칼의 소거 활성능을 측정하는 방법으로 ABTS⁺ 라디칼 탈색반응이 1분 안에 종료되므로 단시간 측정할 수 있고, 소수성과 친수성 모두에 적용 가능하다(1). 각 식물의 열수추출물 및 효소추출물의 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나와 있는바와 같이 열수추출물 및 효소추출물 모두에서 DPPH 라디칼 소거능의 결과보다 저해 활성이 높게 나타났다. 이는 ABTS⁺ 라디칼이 DPPH 라디칼 보다 좀 더 강력한 산화물질이기 때문인 것으로 사료된다(16). 열수추출의 ABTS⁺ 라디칼 IC₅₀은 가자나무(미로발란), 밤나무 껍질(체스넛), 아카시아(와틀), 옻나무(케브라쵸) 추출물 순이였으며, 효소처리 추출물에서는 옻나무(케브라쵸), 밤나무 껍질(체스넛), 가자나무(미로발란), 아카시아(와틀) 순으로 모두 높은 수준의 항산화력을 나타내었다.

Fig. 3. ABTS+ radical scavenging activity of hot-water extracts (open bars) and enzyme extracts (dark gray bars) from various plants. The concentrations (IC₅₀) required to exert 50% of ABTS⁺ radical were tested. Data are expressed as mean±SD of triplicate experiments.

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Malondialdehyde(MA) 생성을 지표로 한 지질과산화물 분석은 가장 보편적이며 최종단계의 산화적 스트레스를 평가하는 방법으로 이용되고 있다(17). Fig. 4에서 4종의 식물 추출물에 대해 TBARS와 반응하는 TCA를 측정하여 지질과산화물 억제 효과를 평가하였다. 마우스의 간 조직에서 염화제2철(FeCl₃)에 의해 야기된 지질과산화물에 대한 억제력은 열수추출물과 효소추출물간의 차이는 크지 않았으며, 모든 실험군에서 지질과산화물을 억제하는 것으로 나타났으며 특히 처리 시료 중 아카시아 추출물(wattle, 0.1 mg/mL)이 무처리 대조군과 비교하여 37%, 34%로 지질과산화물 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

Fig. 4. Lipid peroxidation inhibition effect of hot-water extracts (open bars) and enzyme extracts (dark gray bars) from various plants. N. control is negative control without sample. Data are expressed as mean±SD of triplicate experiments.

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탄닌계 색소의 항균 효과를 알아보기 위하여 Escherichia coli, Listeria grayi을 이용하여 항균 활성을 측정해 본 결과는 Table. 2과 같다. 추출물 절대량 1 mg을 처리했을 때 E. coli 균에 대한 억제 효과는 열수추출물 및 효소추출물 모두에서 고르게 나타났으며, 특히 옻나무(케브라쵸) 효소추출물의 생육 저지환이 8 mm로 가장 크게 표현 되었다. 다른 추출물에서도 3 mm 내외의 뚜렷한 생육저지환이 유지되었다. Listeria grayi에서는 열수추출물을 처리한 테스트에서는 생육저지환이 존재하지 않았지만 효소처리 추출물에서는 옻나무(케브라쵸)를 제외한 나머지 색소에서 3 mm 내외의 뚜렷한 생육저지환을 나타내는 것으로 보아 상당한 수준의 리스테리아 저해능을 보유하는 것으로 판단된다.