표준화된 고려엉겅퀴 추출물의 아질산염 소거능 및 항염증효과

본 연구에 사용한 표준화된 고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai) 시료는 ㈜하티(Hongcheon, Korea)로부터 제공받아 사용하였다. ㈜하티에서는 원료 표준화를 위하여 추출용매, 추출시간, 산지 및 수확시기별 지표성분의 함량을 비교분석하였으며, 강원대학교에서 ㈜하티가 제공한 추출물에 대하여 항비만 활성을 in vitro 수준에서 평가하여 지표성분 함량과 항비만 효능 결과를 바탕으로 최적의 추출조건을 확립하였다(14,16,17). 표준화된 시료를 제조한 공정은 다음과 같다. 원재료의 25배의 40% ethanol을 가하여 70℃에서 2시간 가압 순환추출 후, 60-100 mesh에서 여과를 거치고, 60℃ 이하에서 -0.8 kG 감압농축하여 -40℃에서 48-72시간 동결건조한 시료를 80 mesh로 분쇄하였다. 그 후, 제공받은 시료를 일정 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), penicillin-streptomycin (P/S), fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA 및 phosphate-buffered saline (PBS)는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

아질산염 소거능은 Kato 등(18)의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물 1 mL에 NaNO₂ 용액 1 mL을 가하고 0.1 M HCl을 가하여 pH를 1.2로 조정한 후 DW로 총량을 10 mL로 만든 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액 1 mL을 취하여 2% acetic acid 5 mL, Griess 시약(1% sulfanilic acid : 1% naphthylamine=1:1) 0.4 mL을 가하여 잘 혼합한 후 실온에서 15분 동안 반응시키고 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 Griess 시약 대신 증류수를 0.4 mL을 가하여 동일하게 행하였고 다음과 같은 계산식을 사용하여 계산하였다.

RAW 264.7 대식세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockwille, MD, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 10% FBS, 1% P/S가 함유된 DMEM 배지에서 CO₂ incubator (MCO-20AIC, Sanyo, Osaka, Japan) (37℃, 5% CO₂)에서 배양되어 각 실험에 사용하였다.

RAW 264.7 대식세포에 대한 고려엉겅퀴 추출물의 세포 독성평가는 Kim 등(19)의 방법에 따라 XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다. 세포를 1×10⁵ cell/mL로 96 well plate에 분주하고 고려엉겅퀴 추출물을 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 처리 후 24시간 배양시킨 후 XTT 시약을 첨가한 후 CO₂ incubator (MCO-20AIC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 4시간 반응시켜 microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450, 690 nm에서 흡광도 값을 측정하여 값을 빼준 후 다음 식으로 계산하였다.

NO 생성능 평가는 Bae 등(20)의 방법을 수정하여 측정하였다. 세포 배양액의 NO 함량은 sodium nitrite(NaNO₂)로 표준곡선을 그려 계산에 사용하였다. 세포를 1×10⁵ cell/mL로 96 well plate에 분주하고 0.1 μg/mL LPS가 첨가된 배지에 1 μM indomethacin과 농도별 고려엉겅퀴 추출물(50, 100, 200 μg/mL)을 각각 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-20AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 24시간 배양시킨 후 배양액 100 μL를 다른 96 well plate에 옮긴 후 Griess reagents (0.1% NEDHC (N-1-(naphthyl)-ethylene diamide; sulfanilanide in 5% H₃PO₄) 100 μL을 새롭게 옮긴 배양액과 섞어준 후 실온에서 10분간 반응시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포를 1×10⁵ cell/mL로 100 pi dish에 분주하고 0.1 μg/mL의 Lipopolysaccharide (LPS)가 첨가된 배지에 1 μM indomethacin, 40 mM 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR), 농도별 고려엉겅퀴 추출물(50, 100, 200 μg/mL)을 각각 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-20AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 24시간 배양시켰다. 그 후 PBS로 2회 세척 후 TRIzol™ Reagent 1 mL 첨가하여 harvest 후 RNA 추출 후, 역전사중합효소(reverse transcriptase)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 만들고 합성된 cDNA와 primer로 RT-PCR (C1000^TM Thermal Cycler, Bio-Rad, Foster City, CA, USA)을 이용하여 유전자의 발현 정도를 측정하였다. RT-PCR 결과물은 2% 한천(agarose) 겔에서 전기영동 후 UV에서 증폭된 DNA band를 Carestream MI SE 프로그램(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA)을 이용하여 band intensity로 수치화하여 나타내었다. 실험에 사용한 primer sequence는 Table 1과 같다.

아질산염 소거능 측정, XTT assay, NO 생성능 평가, RT-PCR은 SAS version 9.4 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하여 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.

아질산염 소거능 측정은 Griess 시약의 sulfanilamide와 N-1-naphylethylenediamine dihydrochloride가 NO₂와 반응하여 azo 화합물을 형성하게 되는데, 이 azo 화합물의 흡광도를 측정하는 방법이다. 고려엉겅퀴 추출물을 이용하여 아질산염 소거능을 측정한 실험 결과는 Fig. 1과 같다. 양성대조군으로 사용한 BHA의 경우 6.25, 12.5, 25 mg/mL의 농도에서 42.27, 71.92, 81.04%의 값을 나타내어 농도 유의적으로 소거능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 고려엉겅퀴 추출물 또한 마찬가지로 6.25, 12.5, 25 mg/mL의 농도에서 21.17, 49.58, 68.33%의 값을 나타내어 양성대조군과 같이 농도 유의적으로 소거능이 증가함을 확인할 수 있었다. Kim 등(21)의 연구에서 아질산염은 식육제품, 수산가공품 등에 독소생성억제, 발색 및 산패 방지의 효과를 위하여 첨가되는 것으로 과도하게 섭취할 시 독성을 나타내어 methemoglobin증과 같은 각종 중독 증상을 유발한다고 보고된 바 있다. 따라서 본 연구에서 고려엉겅퀴 추출물의 아질산염 소거능을 측정한 결과, 고려엉겅퀴 추출물이 생체 내에서도 효과적인 아질산염 소거작용을 통해 nitrosoamine 생성을 억제하는 아질산염 소거제로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 1. Nitrite scavenging ability of C. setidens extract and BHA. BHA:Butylated hydroxyanisole. Each value represents mean ± SD (n=3). ^a-f Means with different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.

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XTT 세포독성평가는 XTT와 PMS(phenazine methosulfate)를 섞은 시약을 세포 배양액에 첨가하게 되면 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의하여 XTT의 tetrazolium 링구조가 분해되어 노란색 formazan crystal을 형성하게 되는데, 이 노란색의 흡광도를 측정하는 원리이다. 고려엉겅퀴 추출물의 XTT 세포독성평가 실험 결과는 Fig. 2와 같다. 50, 100, 200 μg/mL의 농도에서 고려엉겅퀴의 세포독성평가를 진행한 결과 모두 control군과 비슷한 흡광도 값을 나타내어 50, 100, 200 μg/mL의 농도 모두에서 독성이 없는 것을 확인하였다.

Fig. 2. Effects of C. setidens extract on cell viability of RAW 264.7 cells. Cell viability was measured by XTT assay. Cells were treated with 50-200 μg/mL of C. setidens extract for 24 h. Each value represents mean±SD (n=3). ^a-f Means with different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.

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NO 생성능 평가는 대식세포의 대사산물인 nitrate(NO₃^-)와 nitrite(NO₂^-)의 생성농도를 확인할 수 있으며 이를 Griess reaction을 통해 확인한다. 질산환원효소를 이용하여 NO₃^-를 NO₂^-로 환원 시키고 Griess 시약을 이용한 발색반응으로 NO₂^-의 농도를 측정할 수 있다(22). LPS를 이용하여 자극을 준 RAW 264.7 대식세포에서의 고려엉겅퀴 추출물의 NO 생성능 실험 결과는 Fig. 3과 같다. 세포만 배양한 실험군에서 NO의 농도는 5.17±0.13 μM로 매우 낮게 측정이 되었고, LPS만 처리한 실험군에서의 NO의 농도는 71.45±1.67 μM로 통계적으로 대조군과 유의성을 보이며 증가하였다. 양성대조군으로 쓰인 indomethacin 1 μM을 처리한 군의 경우 47.26±4.22 μM로 NO 생성량이 LPS만 처리한 군에 비해 많이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 50, 100, 200 μg/mL 농도의 고려엉겅퀴 추출물을 첨가한 실험군에서의 NO 농도는 각각 65.01±1.52 μM, 58.33±1.29 μM, 51.74±2.58 μM로 측정되어 농도 유의적으로 NO 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. Soe 등(23)의 연구에서는 NO가 감염부위의 활성화된 대식세포에서 면역조절, 혈관확장, 신경전달 등의 역할이 있다고 보고한 바 있으며, Kim 등(24)의 연구에서 NO는 지속적인 염증의 진행에 의한 종양형성촉진, 면역반응촉진 등 여러 생물학적 반응에 관여하는 인자로 보고된 바 있다. 따라서 고려엉겅퀴 추출물의 NO 생성 억제능은 면역반응을 조절하여 염증관련 질환을 효과적으로 개선할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3. Effect of C. setidens extract on LPS-Induced NO production in RAW 264.7 Cells. IN:indomethacin. The cells were treated with 1 μM indomethacin, 50-200 μg/mL of C. setidens extract and 0.1 μg/mL LPS for 24 h. The amounts of NO were determined by Griess assay. Each value represents mean±SD (n=3). ^a-f Means with different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.

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COX-2는 염증관련 cytokine, 세균성 내독소, 자외선 등과 같은 여러 종류의 염증 매개체에 의해 발현되어 염증반응뿐만 아니라 각종 퇴행성 질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(25).

iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 한 번 발현되면 오랜 시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 이때 생성된 NO가 염증매개체의 생합성을 촉진시켜 염증 반응을 촉진시켜 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다(26,27).

IL-6는 림프구를 활성화시켜 항체의 생산을 증가시키는 cytokine으로 IL-6의 발현은 염증반응에서 항상 증가되고 있는 것으로 보고되고 있다(28).

TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되어지고 있으며, 정상조직에서도 발현되며 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되어 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에서 중요한 역할을 한다(29).

본 실험에서 고려엉겅퀴 추출물에 대한 COX-2, iNOS, IL-6, TNF-α의 발현정도를 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. COX-2는 LPS 단독 처리군에서 대조군보다 약 5배 증가하였으며 indomethacin 처리군과 고려엉겅퀴 처리군은 LPS 단독 처리군에 비하여 각각 36%, 55% 정도로 발현이 감소하였다. iNOS는 LPS 단독 처리군에서 대조군보다 약 7배 증가하였으며 indomethacin 처리군과 고려엉겅퀴 처리군은 LPS 처리군에 비하여 각각 69%, 84% 정도로 발현이 감소하였다. IL-6는 LPS 단독 처리군에서 대조군보다 약 8배 증가하였으며 AICAR 처리군과 고려엉겅퀴 처리군은 LPS 처리군에 비하여 각각 46%, 83% 정도로 발현이 감소하였다. TNF-α는 LPS 단독 처리군에서 대조군보다 약 8배 증가하였으며 AICAR 처리군과 고려엉겅퀴 처리군은 LPS 처리군에 비하여 각각 44%, 78% 정도로 발현이 감소하였다. 실험결과, COX-2, iNOS, IL-6, TNF-α에서 모두 LPS 단독 처리군에서는 발현양이 매우 증가하였으며 고려엉겅퀴 추출물을 처리한 실험군과 양성대조군을 처리한 실험군에서는 억제효과가 나타난 것을 통계적으로 확인하였다. 이는 LPS에 의한 염증 유도 시 COX-2, iNOS, TNF-α 등의 생산이 증가된다는 Lee 등(30)의 논문의 보고와 일치한다. 본 연구에서 고려엉겅퀴 추출물이 NO 생성을 저해한 실험결과로 볼 때, 고려엉겅퀴 추출물에 의한 NO 생성 저해가 전사단계에서 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로써 일어남을 시사한다. 이와 같은 실험결과로 볼 때, 고려엉겅퀴 추출물은 염증반응 관련 cytokine들을 효과적으로 저해하는 것으로 확인되어 mRNA 조절 기능을 통해 염증성 질환의 치료에 유의할 것으로 사료된다.

Fig. 4. C. setidens inhibits the mRNA expression of inflammatory mediators in RAW 264.7 cells. IN:indomethacin, AIC:AICAR. The cells were treated with 1 μM indomethacin, 40 mM AICAR, 100 μg/mL of C. setidens extract and 0.1 μg/mL LPS for 24 h. The mRNA expression of (A) COX-2, (B) iNOS, (C) IL-6, (D) TNF-α was measured by polymerase chain reaction. Expression levels were densitometrically quantified with normalization to the control. Each value represents mean±SD (n=3). ^a-d Means with different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.

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