누룩에서 분리한 국산 효모 종균(SC Y204와 Y283)으로 빚은 찹쌀막걸리의 품질 특성

본 연구에 사용된 쌀은 2016년산 강화도에서 생산된 화선찰쌀을 광천유통(Suwon, Korea)을 통하여 구입하였고, 발효제인 쌀누룩은 농촌진흥청 발효가공식품과에서 보관한 산 생성능이 우수한 Aspergillus luchuensis 74-5(KACC 93235P) 종균을 Malto extract agar(Beton, Dickinson and company(BD), Sparks, MD, USA) 배지에 계대배양한 후, 4℃에 보관하면서 사용하였다. 2 종류의 효모는 강원도 평창군의 전통 발효식품들로부터 분리한 약산성에서 약알칼리성 pH 범위뿐만 아니라 저온에서 중온(20-35℃)까지 모든 영역에서 생육이 우수한 균학적 특성을 가지며 알코올 생성능이 우수하고 풍미가 뛰어난 알코올 발효용 효모는 S. cerevisiae Y204 (KACC No. 93237P)와 Y283(KACC No. 93238P)를 사용하였고 대조구는 양조산업에 많이 사용되는 수입산 S. cerevisiae Fermivin(Lallemand, Denmark)를 사용하였다(14). 그 외의 본 연구에 사용된 분석용 시약(Sigma-Aldrich Co., Louis, MO, USA)은 특급을 사용하였다.

A. luchuensis 74-5 종균으로 빚은 백국은 쌀 3 kg을 수세한 후, 1시간의 침지와 50분의 물 빼기 과정을 거쳐 1시간 증자한 후, 품온이 40℃가 되도록 방냉하였다. 식은 고두밥에 백국균(A. luchuensis 74-5, AL 74-5)을 0.1%(w/w) 접종하여 제국기(Mini 15, Yaegaki Food Co., Hyogo, Japan)에 넣어 배양하였다. 약 20시간 후, 뒤집기를 수행하여 품온을 약 38℃로 유지하였으며 입상한 후, 약 5시간 간격으로 뒤섞기를 반복하여 품온의 과열을 방지하였으며, 배양 2일(44 h)째 출국하여 45℃에서 1일 건조(DS-80-3, Dasol Scientific Co., Ltd., Hwaseong, Korea)한 후, 4℃에 저장하여 사용하였다.

A. luchuensis 74-5로 제조한 쌀누룩을 살균한 항아리에 넣고 3종류의 서로 다른 효모로 찹쌀막걸리를 제조하였다. 쌀누룩 300 g에 탕수한 담금수 600 mL(가수량 200%)를 넣고 S. cerevisiae Y204와 Y283 및 S. cerevisiae Fermivin 종균(0.01%)으로 2일간 발효시켜 밑술을 만들었다. 밑술의 술덧 전량에 고두밥 300 g과 탕수한 담금수 600 mL를 넣고 알코올 생성능이 우수한 2종류의 국산 효모종균을 다양한 온도(15℃, 20℃, 25℃) 조건에서 발효기간에 따른 차이를 보기 위하여 8일간 발효하였으며 2일 간격으로 각각의 막걸리 시료를 채취하여 품질 특성을 분석하였다.

제조한 찹쌀막걸리의 pH는 술덧 30 mL를 취하여 pH meter(Orion 3 star, Thremo scientific Co., MA, USA)로 측정하였다. 적정산도 측정은 시료 15 mL를 취하여 여과지로 여과한 검체 10 mL를 100 mL 삼각플라스크에 취한 다음, 0.5% phenolphthalein(Sigma-Aldrich, San Fransisco, CA, USA) 지시약을 2-3 방울 떨어뜨리고 0.1 N NaOH로 적정될 때까지 중화 적정하였으며 소비된 NaOH 양에 0.009를 곱하여 lactic acid의 양으로 환산하여 막걸리 시료 중의 총산을 측정하였다(15). 아미노산도는 여과지로 여과한 검체 10 mL에 0.5% phenolphthalein 지시약을 2-3방울 떨어뜨린 다음, 0.1 N NaOH로 적정한 다음, 중성포르말린 용액 5 mL을 넣어 혼합하고 0.1 N NaOH로 적정하여 담홍색이 될 때까지 소비된 0.1 N NaOH의 mL로 표시하였다(16).

당도 측정은 당도계(T400321 model, Atago Co., Tokyo, Japan)를 사용하였으며, 당도 측정용 시료는 찹쌀막걸리 술덧을 원심분리(8,000 rpm, 15분, 4℃, KUBOTA 6200, Kubota Co., Ltd., Tokyo, Japan)한 상등액을 사용하였다.

발효 술덧 내의 알코올 함량은 찹쌀막걸리 술덧을 부직포로 조여과하여 얻어진 여액 100 mL에 증류수 100 mL를 넣어 혼합한 후 증류하였다. 증류액을 약 80 mL 받은 다음 증류수를 넣어 100 mL로 정용하고 증류액의 온도를 15℃로 보정한 다음, 주정계를 이용하여 측정하였다(17).

각각의 술덧 10 mL을 취하여 0.2 μm membrane filter (Millipore Co., Cork, Ireland)로 여과한 후, 유기산을 분석하였으며 HPLC(LC-20A Prominence, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하고, 칼럼은 TSK gel ODS-100V 5 μM(4.6×25 cm, TOSOH Co., Nanyo, Japan), 이동상은 8 mM perchloric acid를 사용하였으며 유량은 1.0 mL/min, 주입량은 10 μL, 측정은 UV(440 nm)를 사용하여 유기산을 분석하였다.

제조한 찹쌀막걸리의 다중 향기성분 분석은 0.5 mL을 10 mL Vial(Ls-Phs-Psck GmbH, Langerwehe, Germany)에 넣고, 40℃에서 30분간 500 rpm으로 교반하여 전자코(Fast GC based HRACLES flash Electronic nose. Alpha Mos, AMcombi PAL, Toulouse, France)를 이용하여 측정하였다. 시료분석에는 2개의 칼럼이 부착된 HRACLES E-nose(DB5 apolar and DB1701 Slightly polar)와 flame ionization detecter(FID)로 검출하였다. 주입량은 syringe type(5.0 mL­HS)으로 칼럼 온도가 25℃로 유지된 상태에서 칼럼 헤드압력 1.0 psi로 주입하였다. 분석 시 주입기의 온도는 200℃, detector 200℃로 하고 주입기 압력은 1.0 psi, 검출기 압력을 39.0 psi로 하였다. 검출된 피크에 따라 차이를 0.900 이상과 RSD 20% 미만의 sensor를 선택하여 alpha Mos software를 이용하여 판별 분석법(Discriminant Function Analysis)과 SIMCA(Soft Independent Modelling of Class Analogy) method로 나타냈다. 시료분석 전 Kovats(Custom Alkanes Blend Standard)를 이용하여 탄소의 단쇄에서 장쇄(C₆-C₁₆)까지의 피크 값을 얻어 Standard로 이용하였다.

통계처리는 SAS(Statistical Analysis System, v7.1, SAS Institute, INC., Cary, NC, USA)에 의한 분산분석(ANOVA)에 의해 검증하였으며, 유의성 비교는 Ducan’s multiple range test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.

효모 종균별 발효온도와 발효기간에 따른 찹쌀막걸리의 술덧 pH 변화를 Table 1에 나타내었다. 본 연구에 사용된 S. cerevisiae Y204와 Y283은 대조구보다 15℃와 20℃에서 초기 담금 pH 3.23-3.72이었는데, 발효 2일째 pH 3.32-3.63의 감소를 보이다가 6일째에 증가하는 양상을 보였다. 초기 pH 감소는 술덧에 생육하는 미생물 작용의 탈아미노산에 의한 유기산 형성과 효모 증식으로 인한 인산 소비와 암모니움 이온 흡수의 영향이고, 발효 6일째 약간의 pH의 증가는 발효가 진행됨에 따라 생성된 유기산과 알코올이 서로 반응하여 ester와 같은 향미 형성 등에 이용된 것으로 보인다(18). 그러나 25℃에서는 각각의 효모 종균으로 빚은 찹쌀막걸리 술덧의 pH는 담금 직후에 가장 낮은 pH 3.11-3.65를 나타내다가 발효기간이 길어지면서 약간씩 증가하는 추세를 보였다(p<0.05). 이는 높은 발효온도에서 유기산을 생성하는 젖산균의 번식이 왕성해지고 활성이 강해 pH가 낮다(19)가 시간이 지나면서 효모가 많은 알코올을 생성하는 동시에 불포화지방산 및 sterols를 많이 생성하기 때문이라고 생각된다(20). 이러한 결과는 Jin 등(21)이 진양주의 발효온도에 따른 품질 평가에서도 보고한 바 있다. 발효 기간에 따른 pH 변화는 당화효소 또는 단백질 분해 효소의 작용으로, 원료미의 맛 성분 용출 등으로 막걸리 주질과 맛, 물리적 및 미생물학적 안정성에 영향을 준다. 이는 효모의 성장과 전분질의 완충 능력을 자극하기 때문에 발효 및 알코올 변화의 지표로 이용되기도 한다. 본 연구에서 온도와 발효기간에 따른 찹쌀막걸리의 술덧 pH 변화는 전반적으로 3.11-3.82로 매우 낮은 수준을 나타내므로 적정산도나 알코올 함량의 증가를 예측할 수 있었다.

효모 종균별 발효온도와 발효기간에 따른 찹쌀막걸리 술덧의 적정산도 변화를 Fig. 1A에 나타내고 있다. 담금 직후, 산도는 발효온도별(15℃, 20℃, 25℃) 각각 0.5-0.6%, 0.5-0.8%, 0.6-0.9% 나타냈다. 2종류의 효모 Y204와 Y283은 각각의 온도에서 발효 2일째부터 산도의 증가를 보였다. 효모 Y283의 산도는 15℃에서 8일째 0.96%로, 20℃에서는 4일째 1.02%로 증가하면서 8일째 1.07%로 증가하였고, 25℃에서는 2일째 1.11%로 최고의 증가를 보였다. 이는 Table 1에 나타낸 것처럼 찹쌀막걸리 발효시 pH가 감소하는 시점에 산도가 증가하는 상관관계를 나타내고 있다. 한편, 대조구로 사용한 수입산 효모(Fermivin)와 Y204의 산도는 20℃와 25℃의 발효 2일째 0.95-0.96%의 증가 추세로 약간의 변화와 함께 8일째까지 산도를 유지하였다. 15℃에서 대조구인 Fermivin 효모와 Y204의 산도는 발효기간에 따라 서서히 증가해 6일째 0.97%로 최고 산도를 나타냈지만 8일째는 0.92%로 감소하였다. 이러한 결과는 Kang 등 (22)의 연구에서 막걸리의 발효에 따른 총산을 측정한 결과, 발효온도와 발효기간에 따라 점차적으로 증가한 결과와 유사하였다. 본 연구에서 찹쌀막걸리 담금 직후의 산도 변화는 산 생성능이 우수한 토착 종균 A. luchuensis 74-5(KACC 93235P)로 제조한 쌀누룩의 영향으로 여겨진다. 술덧의 알코올 발효가 진행되면서 젖산이나 효모 발효로 생성되는 유기산의 영향으로도 총산 양이 증가되며 생성된 유기산이 알코올 등과 결합하여 향미 성분을 만들고 발효 후기에는 향미성분들이 감소되어진다. 특히, 생성된 산도는 발효주 제조 시 발효과정을 모니터링 할 수 있는 가장 중요한 지표이며, 효모 Y283이 Y204와 대조구(Fermivin)보다 발효 효과가 유의적으로 크게 나타남을 알 수 있었다(p<0.05).

Fig. 1. Changes in total acidity and amino acidity of glutinous rice-Makgeolli according to different fermented starters during fermentation temperature (15℃, 20℃, and 25℃) and period. Data are presented as the mean for 3 independent experiments. Error bars indicate SD (p<0.05).●, S. cerevisiae Fermivin; ◼, S. cerevisiae Y204; ▲, S. cerevisiae Y283.

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Fig. 1B의 아미노산도는 원료에 포함된 단백질이 acidic protease와 기타 peptidase 등의 분해효소 작용에 의해 유리되는 아미노산을 측정한 수치로서, 분해된 아미노산은 배양 중 효모의 영양원으로 이용되어 고급 알코올 및 에스테르 등의 향기성분으로 분해되기 때문에 적당량의 유리 아미노산은 주류에 다양한 맛을 부여하여 기호도에 긍정적인 영향을 준다. 종균별 제조한 찹쌀막걸리의 아미노산도는 온도와 발효시간이 증가함에 따라 대조구로 사용한 시판 효모인 Fermivin과 토착 효모 Y204와 Y283은 각각 1.53-2.87%, 1.39-2.78%, 1.76-3.33%로 증가하는 경향을 보였다. 전반적으로 발효초기인 2일째 급격히 증가하였고 사용한 종균에 따라 증가 패턴의 변화를 보였다. 특히, 효모 Y283에 의한 아미노산도 증가가 유의적 차이를 나타내었다(p<0.05). 발효온도 25℃를 제외하고는 발효 종료일까지 증가함이 완만하게 유지되는 것은 Lee 등(23)이 보고한 결과와 비슷하다. 아미노산도가 3.0% 이하가 되면 발효주에서 느끼한 맛은 없을 것으로 보고하고 있다(24).

효모 종균별 발효온도와 기간에 따른 찹쌀막걸리 술덧의 당도 변화를 Fig. 2A에 나타내었다. 찹쌀막걸리 담금 초기 당도 함량은 발효온도(15℃, 20℃, 25℃)에 따라 12.07-13.77 °Brix, 10.33-15.63 °Brix, 11.10-16.73 °Brix로 나타났다. 3종류의 발효온도에서 대조구로 사용한 효모 Fermivin과 토착 효모 Y204, Y283은 발효 2일째 14.43-21.10 °Brix, 14.07-19.93 °Brix, 21.10-24.77 °Brix로 최고의 당도 함량을 나타냈다. 이후 알코올이 생성되면서 당 함량은 감소하기 시작하여 발효가 종료되는 8일에는 12.73-20.27 °Brix, 12.87-13.80 °Brix, 11.60-13.40 °Brix로 각각 나타났다. 알코올 발효 2일째, Y283 효모종균은 대조구인 수입산 효모(Fermivin)와 Y204 효모에 비해 당도가 높았으며 이들 간의 유의적 차이를 나타냈다(p<0.05). 종균별 제조한 찹쌀막걸리는 발효 2일까지 당도 함량이 계속 증가하다가 그 이후부터는 술덧의 전분질이 당화 amylase 작용으로 당분으로 분해됨과 동시에 효모의 영양원이나 발효 기질로 이용될 뿐만 아니라 발효 후기에는 당도 함량이 감소되는 것으로 생각된다(25). 한편 Yang과 Eun(24)은 총당 함량이 급격하게 감소할 때 술덧의 알코올 함량이 가장 급속하게 증가하는 시기라고 보고하였다.

Fig. 2. Changes in sugar and alcohol contents of glutinous rice-Makgeolli according to different fermented starters during fermentation temperature (15℃, 20℃, and 25℃) and period. Data are presented as the mean for 3 independent experiments. Error bars indicate SD (p<0.05).●, S. cerevisiae Fermivin; ◼, S. cerevisiae Y204; ▲, S. cerevisiae Y283.

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효모 종균별 발효온도와 기간에 따른 찹쌀막걸리의 알코올 함량 변화는 Fig. 2B에 나타내었다. 효모 종균별 찹쌀막걸리의 담금 초기 알코올 함량은 발효온도(15℃, 20℃, 25℃)에 따라서 0.6-0.7%, 0.7-3.8%, 0.8-5.4%로 나타났다. 효모 Y283은 발효15℃에서 발효 6일째, 20℃는 4일째, 25℃에서는 발효 8일째, 각각 16%, 17.50%, 16.53%로 최고의 유의적인 알코올 생산능을 보였다(p<0.05). 대조구인 수입산 시판 효모인 Fermivin과 Y204 효모는 발효 2일째부터 서서히 알코올 함량이 증가하여 각 발효온도(15℃, 20℃, 25℃)의 발효 종료시점인 8일 차의 알코올 함량이 Fig. 2B에 각각 10.40-11.07%, 15.13-16.90%, 16.03-17.67%로 최대치를 보였다. Fig. 2에 나타난 찹쌀막걸리 술덧의 당도 감소와 알코올 함량 증가 결과는 Yang과 Eun(26)이 보고한 것처럼 서로 상관관계를 보여 주고 있다. 한편 효모 Y283으로 담근 막걸리의 알코올 함량이 최고치 15% 이상을 나타낼 때, 당도 함량이 최고치에서 감소하기는 했지만 20 °Brix 이상의 함량을 나타내고 있다. 이는 효모 Y283이 Y204나 Fermivin에 비해 발효 후 단당류인 glucose와 fructose 및 이당류인 maltose 등의 잔당이 많이 남아 있는 것으로 여겨진다. Jang 등(27)과 Kim 등(28)의 보고에 의하면 주류에 사용되는 효모는 발효온도가 높아질수록 알코올 생산 속도가 빨라진다고 보고한 바 있다. 본 연구에서도 3종류의 효모로 찹쌀막걸리를 제조하였을 때, 20℃와 25℃의 발효조에서 생산된 알코올 함량이 15℃보다 높게 나타났다. 그러나 이들 효모 종균 중에서 Y283은 20℃와 25℃보다 낮은 온도(15℃)조건에서 알코올 발효가 잘 되는 것을 알 수 있다(Fig. 2). 15℃ 저온에서 발효 6일째 16.5%의 알코올을 만든 후, 발효 8일부터 감소하기 시작한 것으로 보아 Y283은 다른 효모보다 저온발효조건에서 알코올 생성능이 우수한 종균으로 여겨진다. 따라서 수입산 효모를 대체하기 위해서라도 Y283 효모는 막걸리뿐만 아니라 약주 제조에도 충분히 사용할 수 있을 것으로 여겨진다. 서로 다른 효모종균별로 빚은 찹쌀막걸리는 Kim 등(29)이 누룩에서 분리한 효모로 빚은 찹쌀 발효주보다 더 다양한 온도 스펙트럼에서 발효기간이 2배 단축되었고 알코올 발효능도 더 우수한 차이를 보임으로써 침체된 막걸리산업의 활성화에 기여 할 수 있다고 여겨진다.

효모 종균별 제조한 찹쌀막걸리의 유기산 분석 결과를 Table 2에 나타내었다. 발효과정에서 생성되는 유기산은 막걸리의 맛과 품질을 결정하는데 중요한 역할을 한다(30,31). 유기산은 술에서 산미를 내는 중요한 지표성분으로 막걸리의 맛을 높이는 역할도 하지만 acetic acid가 다량 존재하면 발효과정에서 알코올 산화로 초산발효단계로 진행되므로 주질을 저하시키는 요인이 되기도 한다(32). 막걸리 제조 시 생성되는 대부분의 유기산은 lactic acid, acetic acid, succinic acid 및 citric acid 등의 결과가 보고되었다(33). Table 2에 나타낸 것처럼 S. cerevisiae Y283을 비롯한 Y204와 대조구인 시판 효모(Fermivin)는 전반적으로 citric acid 함량이 가장 높았고, malic acid, lactic acid 순으로 나타난 것이 열처리하지 않은 막걸리의 품질특성(34)과 비슷하였다. 유기산 중 acetic acid, succinic acid, fumaric acid 및 propionic acid는 발효 초기 미량으로 감지되다가 발효온도가 높을수록, 또는 발효기간이 길어질수록 이들 유기산이 나타나지 않았다. 발효 종균인 Y283 효모로 빚은 찹쌀막걸리는 각각의 유기산 농도가 발효 2일째, 저온인 15℃에서 향미에 좋은 영향을 미치는 citric acid(540.98 mg/100 mL)와 부드러운 신맛을 내는 malic acid(105.92 mg/100 mL)가 가장 높게 나타났다. 이들 유기산 함량은 Y204 효모 종균에서는 발효 2일 차 두 번째로 높게 나타났고, 대조구인 수입산 효모인 Fermivin에서는 발효 4일 차 세 번째 함량을 나타내었다. 앞에서 언급한 알코올 함량과 비교한 결과, S. cerevisiae Y283 종균은 발효기간이 2일 단축됨으로써 S. cerevisiae Y204와 수입산 효모(S. cerevisiae Fermivin)보다 막걸리를 빚을 때, 부대비용 절감 등을 고려하면 높은 경제성이 높은 것으로 보였다.

효모 종균별 온도에 따른 찹쌀막걸리의 다중 향기패턴 분석을 Fig. 3에 나타내었다. 향기패턴을 구분하는 제1주성분 값의 기여율(proportion)은 92.71% 이었으며, 제2주성분 값의 기여율은 6.01%로 각각의 발효온도별 제조된 찹쌀막걸리의 향기패턴의 차이를 확인하였다. 발효 온도가 증가함에 따라서 향기패턴이 제1주성분의 값의 -80,000과 0 사이에 분포하였다. 저온인 15℃에서 발효한 3종류의 효모 종균별로 빚은 찹쌀막걸리는 발효 속도가 늦어 20℃와 25℃와의 향기패턴과는 거리가 많이 떨어져 있기에 서로 다른 향이라고 판단할 수가 있다. 20℃로 발효한 3종류 찹쌀막걸리(Fermivin, Y204, Y283)는 다른 온도(15℃, 25℃)보다 집약적이지가 않고 범위가 넓음을 알 수가 있었다. 따라서 15℃와 25℃에서 발효한 찹쌀막걸리보다 향기성분의 패턴 다양성을 알 수 있었으며, 15, 25℃에서 발효를 하였을 때, 20℃보다 더 일정한 향기패턴을 갖는 찹쌀막걸리를 얻을 수 있었던 것은 서서히 발효되는 낮은 온도의 안정성과 빠르게 발효되는 높은 온도의 안정성 때문인 것 같다. 25℃로 발효한 3종류의 찹쌀막걸리는 15℃와는 다른 향이라고 판단을 할수가 있었으며, 저온에서 발효한 찹쌀막걸리보다 y축에 가까이 집약된 패턴을 볼 수가 있다.

Fig. 3. Principal component analysis of changes in the pattern of multiple volatile components for glutinous rice-Makgeolli according to different fermented starters during fermentation temperature by electronic nose. A different colors was displayed by according to different fermentation temperatures. ●, S. cerevisiae Fermivin; ◼, S. cerevisiae Y204; ▲, S. cerevisiae Y283.

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