도축장으로부터 분리된 Shigella sonnei 특이적 박테리오파지의 특성 연구

실험에 사용한 균주(Table 1)는 American Type Culture Collection(ATCC), International Vaccine Institute(IVI), Bio-Resource Management for Pathogens National Culture Collection for Pathogens(NCCP), Department of Plant and Food Sciences(DPFS), College of Veterinary Medicine and Research Institute for Veterinary Science, Seoul National University(VMRI)에서 구입 혹은 제공 받아 사용하였다. 각각의 균주 배양을 위해 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories Inc., Sparks, MD, USA)를 사용하여 37℃에서 110 rpm, 16시간 동안 배양하였다. 원심분리(6,000 rpm, 5분) 후, 균체에 1 mL의 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4, Life technologies Co., Paisley, UK)를 첨가하였다. 위 단계를 3번 반복하여 순수 균주를 확보하였다. 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys Co., Ltd., Daejon, Korea)를 이용하여 640 nm에서 균주 현탁액의 흡광도를 측정하고 작성된 표준곡선을 활용하여 각각의 농도를 10⁸ CFU/mL로 하였다.

영천 ㈜삼세 도축장으로부터 채취한 2개의 도축 폐수 샘플 25 mL를 각각 TSB 225 mL와 1 mL의 S. sonnei ATCC 9290(10⁸ CFU/mL)에 혼합하여 37℃에서 160 rpm, 16시간 동안 배양하였다. 원심분리(8,000 rpm, 10분)한 후 상층액을 0.20 μm cellulose acetate filter(Advantec Tokyo Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 200 μL의 S. sonnei ATCC 9290(10⁸ CFU/mL)와 4 mL의 TA soft agar(4 g agar, 8 g nutrient broth, 5 g NaCl, 0.2 g MgSO₄, 0.05 g MnSO₄, 0.15 g CaCl₂/L)를 혼합하여 TSB 고형 배지(TSA, Difco Laboratories Inc., Sparks, MD, USA)에 부어 굳힌 후, 여과된 박테리오파지 10 μL를 TSB 고형배지 4곳에 분주하였다(dot assay). 희석한 박테리오파지 여과액 100 μL와 200 μL의 S. sonnei ATCC 9290(10⁸ CFU/mL)를 4 mL의 TA soft agar에 혼합하여 TSB 고형배지에 부어 굳힌 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다(plaque assay). 단일 plaque를 취하여 sodium chloride-magnesium sulphate buffer(SM buffer, 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, pH 7.5)에 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 위 단계를 2번 반복하여 단일 박테리오파지를 분리하였다. 분리된 단일 박테리오파지의 증식을 위해 3 mL의 TA broth에 1% S. sonnei ATCC 9290(10⁸ CFU/mL)를 혼합하여 37℃에서 190 rpm, 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 혼합액을 원심분리(6,000 rpm, 10분)한 후 상층액을 0.20 μm cellulose acetate filter로 여과하였다. 위 단계를 TA broth 양을 증가하면서 반복한 후 최종적으로 여과된 박테리오파지는 10%(w/v) polyethylene glycol과 1 M NaCl 용액을 혼합하여 4℃에서 16시간 동안 정치시킨 후 원심분리(8,000 rpm, 20분) 하였다. SM buffer로 pellet을 현탁한 후, CsCl 밀도 구배 초원심분리(22,000 rpm, 2시간)를 실시하였다. 생성된 박테리오파지 band를 회수하여 냉장 온도에서 6시간 동안 투석하였다. 정제된 박테리오파지의 최종 농도는 plaque assay로 확인하였다.

분리·정제된 S. sonnei 특이적 박테리오파지 10 μL를 carbon-coated copper grid에 올려 4%의 phosphotungstic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 염색한 후 Transmission electron microscope(TEM, H-7100, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)으로 형태학적 특성을 관찰하였다.

정제된 S. sonnei 특이적 박테리오파지의 genomic DNA(gDNA)를 NORGEN^® bacteriophage DNA isolation kit(Norgen Biotek Co., Thorold, ON, Canada)로 분리·정제하였고, 정제된 gDNA의 농도는 picodrop(Picodrop Ltd., Hinxton, UK)으로 측정하였다. 정제된gDNA의 크기를 확인하기 위해 50 V에서 1.5시간 0.4% 아가로스 겔 전기영동(Takara Bio Ltd., Shiga, Japan)하였다. DNA ladder (GeneRuler High Range DNA ladder, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)로 gDNA 크기를 결정하였다.

분리·정제된 S. sonnei 특이적 박테리오파지의 특이성 검토를 위해 28종의 식중독균을 각각 TSB에 배양한 후(10⁸ CFU/mL) dot assay법을 이용한 clear zone 생성 여부로 감염숙주 여부를 확인하였다.

정제된 S. sonnei 특이적 박테리오파지(10⁹ PFU/mL) 100 μL와 다양한 pH 범위를 가진 TSB 900 μL(pH 3, 5, 7, 9, 11)를 혼합한 후 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 온도 안전성 검토를 위해 박테리오파지(10⁹ PFU/mL) 100 μL와 SM buffer(pH 7.5) 900 μL를 혼합하여 다양한 온도(4, 22, 37, 45, 50℃)에 1시간 동안 반응시킨 후 배양하였다. 배양 후, plaque assay를 통해 역가를 측정하였다.

영천 ㈜삼세 도축장으로부터 수집된 도축 폐수 샘플에서 S. sonnei ATCC 9290에 대응하는 2개의 박테리오파지가 분리되었고, 분리된 두 개의 박테리오파지를 대상으로 dot assay를 수행한 결과 clear zone의 크기가 각각 1.88±0.15 cm, 1.83±0.05 cm로 확인되었다. 그 중 clear zone 크기가 크고 선명한(1.88±0.15 cm, Fig. 1A) 박테리오파지를 대상으로 plaque assay를 수행하여 단일의 박테리오파지를 분리하였고(Fig. 1B), 단일의 박테리오파지는 증식과정을 통해 최종적으로 2.0×10¹² PFU/mL 농도로 정제되었다. 정제된 단일의 박테리오파지를 S. sonnei 특이적 박테리오파지(S. sonnei-specific bacteriophage)로 명명하였다.

Fig. 1. Plaques formation of S. sonnei-specific bacteriophage using (A) dot assay and (B) plaque assay.

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S. sonnei 특이적 박테리오파지의 TEM 분석 결과(Fig. 2), 머리 너비와 길이는 각각 69.9±11.2 nm와 77.5±8.8 nm였으며, 꼬리 길이는 264.4±33.9 nm로 관찰되었다. 이십면체 머리와 비교적 긴 비수축성 꼬리를 가지고 있어, International Committee of Taxonomy of Viruses(ICTV)에서 제시한 분류방법에 따라 Caudoviridae 목의 Siphoviridae에 속함을 확인하였다(18). 기존의 연구결과에 의하면(Table 2), Jun 등(19)은 서울 홍제천 개울물로부터 Myoviridae로 분류되는 S. sonnei와 S. flexneri에 특이적인 한 개의 박테리오파지(pSs-1)를 분리하였고 머리 길이 98±4 nm, 꼬리 길이 120±7 nm로 보고하고 있다. 또한 Faruque 등(20)은 방글라데시 수도 다카의 강 2곳에서 71개의 강물 샘플로부터 Podoviridae로 분류되는 S. dysenteriae 특이적 박테리오파지(SF-9)를 분리하였고, 상당히 짧은 꼬리(TEM 이미지 분석 결과 5 nm로 추정)를 가짐을 확인하였다. 또한 Jun 등(21)은 서울 한강 물 샘플로부터 머리 길이와 꼬리 길이가 각각 73 nm와 103 nm인 Siphoviridae로 분류되는 Shigella spp. 특이적 박테리오파지 즉 pSf-1을 분리하였고, Strauch 등(22)은 설사 환자의 분변으로부터 머리 길이와 꼬리 길이가 약 65 nm와 약 26 nm로 상당히 짧은 꼬리를 가진 S. sonnei CB7888 특이적 박테리오파지를 분리하여 이를 Podoviridae로 분류하였다. 또한 Kim 등(23)은 Myoviridae로 분류되는 S. sonnei 특이적 박테리오파지(SP18)를 분리하였고, 머리 길이 110 nm, 꼬리 길이 50-110 nm로 보고하고 있다. 따라서 본 연구에서 분리된 S. sonnei 특이적 박테리오파지는 기존의 연구된 다수의 연구들과는 달리 Siphoviridae에 속하며 특히 꼬리의 길이가 Siphoviridae로 분류되는 pSf-1보다 거의 두 배 정도 길다는 점에서 기존에 보고된 Shigella spp. 특이적 박테리오파지와는 다른 형태학적 특성을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다.

Fig. 2. TEM image of S. sonnei-specific bacteriophage with magnification of 50,000×.

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앞의 실험방법으로 분리된 S. sonnei 특이적 박테리오파지를 0.4% 아가로스 겔로 전기영동 한 결과, 2.5 kb ladder를 size marker로 이용하여 약 25 kb DNA 크기의 band를 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 기존의 연구결과와 비교해 보면, S. sonnei 특이적 박테리오파지는 약 41 kb 크기인 S. dysenteriae 특이적 박테리오파지(SF-9)(20)와 약 51 kb 크기의 Shigella spp. 특이적 박테리오파지(pSf-1)(21), 그리고 약 63 kb 크기의 S. sonnei CB7888 특이적 박테리오파지와 비교적 비슷한 크기의 DNA를 갖고 있음을 확인 할 수 있었다. 이에 비해 약 160-250 kb 크기의 Shigella spp. 특이적 박테리오파지(pSs-1)(19), 약 167 kb 크기의 S. flexneri와 Escherichia coli O157:H7 특이적 박테리오파지(HY01)(24), 그리고 약 170 kb 크기의 S. sonnei에 특이적 박테리오파지(SP18)(25)보다는 그 크기가 훨씬 작음을 알 수 있었다. 유전자의 크기는 일반적으로 박테리오파지의 분류학상 특성과 상관관계가 있으며, 일반적으로 Siphoviridae과에 속하는 박테리오파지의 DNA 크기가 35-70 kb 임을 감안하다면(13), S. sonnei 특이적 박테리오파지는 상당히 작은 크기의 DNA를 함유하고 있음을 확인 할 수 있었고 이는 추가적인 유전자 염기서열 분석을 통해 박테리오파지의 신규성과 그 크기를 검증할 계획이다.

Fig. 3. Genomic DNA of S. sonnei-specific bacteriophage using 0.4% agarose gel electrophoresis. Lane M, 2.5 kb ladder; Lane 1, S. sonnei-specific bacteriophage.

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생물학적 수용체로서 요건을 검토하기 위해 43종의 균을 대상으로 S. sonnei 특이적 박테리오파지의 특이성 검토 결과, S. sonnei 특이적 박테리오파지는 S. sonnei ATCC 9290에만 특이적으로 반응하여 1.88±0.15 cm 크기의 plaque를 형성하였다(Table 1). 하지만, 10종의 Aeromonas hydrophila, 2종의 Bacillus cereus, 1종의 Bacillus subtilis, 1종의 Campylobacter jejuni, 4종의 Escherichia coli, 1종의 Klebsiella pneumoniae, 3종의 Listeria spp., 1종의 Pseudomonas aeruginosa, 13종의 Salmonella spp., 1종의 Staphylococcus aureus, 2종의 Vibrio spp., 1종의 Yersinia enterocolitica에서는 plaque를 형성하지 않았다. 또한, Shigella spp.의 다른 종 즉 S. boydii NCCP 11190, S. flexneri 2a strain 2457T에 대해 특이성을 나타내지 않았다. Jun 등(19)은 특이성 분석을 위해 9개의 Shigella spp.(4종의 S. sonnei, 3종의 S. flexneri, 2종의 S. boydii)를 대상으로 그 중에서 4종의 S. sonnei와 3종의 S. flexneri에 특이적인 박테리오파지를 분리하였다고 기술하였으나 이들 연구는 9종의 Shigella spp.만 제한적으로 사용하였으므로 그 한계를 가지고 있다. 따라서 본 연구에서 분리·정제된 S. sonnei 특이적 박테리오파지는 기존에 보고된 Shigella spp.에 특이적 박테리오파지보다 더욱 우수한 특이성을 갖는 박테리오파지임을 확인할 수 있었다.

생물학적 수용체로서 센서에 적용되는 박테리오파지는 다양한 환경에 노출되므로 정제된 S. sonnei 특이적 박테리오파지의 pH 및 온도 안정성은 무엇보다 중요한 특성 중의 하나이다(10). 따라서 본 연구에서 S. sonnei 특이적 박테리오파지를 다양한 pH(Fig. 4)와 온도(Fig. 5) 범위에 노출시켜 그 안정성을 검토하였다. Fig. 4에서 보듯이, S. sonnei 특이적 박테리오파지의 농도는 pH 3, 5, 7, 9 그리고 11에서 6.87±0.62 log PFU/mL, 5.94±0.54 log PFU/mL, 5.86±0.66 log PFU/mL, 6.93±0.73 log PFU/mL, 그리고 5.76±0.57 log PFU/mL로 각각 확인되었다. S. sonnei 특이적 박테리오파지의 농도는 pH 3과 pH 9에서 비교적 높게 확인되었으나, 전 범위(pH 3-11)에 걸쳐 유의적인 농도변화는 확인되지 않았다(p>0.05). Faruque 등(20)은 S. dysenteriae 특이적 박테리오파지(SF-9)의 pH 안정성 검토 결과 pH 6-9에서 안정함을 보여주었고, Lee 등(24)은 S. flexneri와 Escherichia coli O157:H7 특이적 박테리오파지(HY01)가 pH 4-11 범위에서 안정함을 보여주었다. 이에 비해 Jun 등(21)은 Shigella spp. 특이적 박테리오파지(pSf-1)가 pH 5-9에서 안정하였으나, pH 3과 pH 11에서는 그 농도가 거의 100% 감소함을 보여주었다. 따라서, S. sonnei 특이적 박테리오파지는 기존의 연구된 다른 Shigella spp. 특이적 박테리오파지보다 넓은 범위에서 우수한 안정성을 보여 주었다.

Fig. 4. pH stability of S. sonnei-specific bacteriophage.

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Fig. 5. Temperature stability of S. sonnei-specific bacteriophage. The letters (a-c) indicate significantly different means among the group at p<0.05.

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또한, 온도에 대한 안정성 검토 결과, 4-37℃ 범위에서는 안정적이었으나, 45℃에서는 그 농도가 4.25±0.20 log PFU/mL로 40% 이상 유의적으로 감소하였으며, 50℃에서는 0.10±0.00 log PFU/mL로 거의 98% 이상 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다(p<0.05). 본 연구의 결과는 Shigella spp. 특이적 박테리오파지(pSf-1)가 4℃, 20℃, 그리고 25℃에서는 안정적이었으나 30℃부터 그 농도가 유의적으로 감소하기 시작하여 65℃에서는 거의 100% 감소한다는 Jun 등(21)의 결과보다 높은 온도 안정성을 보여 주었다. 또한, S. dysenteriae 특이적 박테리오파지(SF-9)를 대상으로 한 실험결과 4-37℃에서는 안정함을 보여준 반면, 45℃에서 농도가 유의적으로 감소한다는 유사한 실험결과를 보여 주었다(20). 따라서, S. sonnei 특이적 박테리오파지는 비교적 넓은 범위의 pH와 온도에 안정함을 확인할 수 있었고, 새로운 생물학적 수용체로서 광범위한 pH와 온도를 갖는 다양한 식품에 적용 가능함을 잠재적으로 보여주었다.