고수 종자 추출물의 산화방지 및 유지 산화안정성 효과

모르코산의 고수 종자를 분쇄기를 이용하여 곱게 분쇄하여 시료의 10배에 해당하는 양의 80% 에탄올을 용매로 사용하였다. 그 후 shaker(RS-1, JEIO TECH, Daejeon, Korea)를 사용하여 280 rpm의 속도로 50 분간 실시 후 교반기를 이용하여 4시간 진탕하여 추출하였다. 이 후 여과지(Whatman No.2, Buckinghamshire, England)로 여과하여 40℃ water bath에서 rotary vacuum evaporator(BŰCHI, Zollikofen, Switzerland)를 이용하여 감압농축을 실시하고 동결건조(BFD85-F8, IlshinBiobase, Seoul, Korea)하여 용매를 제거하였다. 고수 종자 에탄올 추출물의 수율은 10.1%였으며, 얻어진 추출물은 -20℃에서 냉동 보관하여 사용하였다.

고수 종자 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 다음과 같이 측정하였다. 0.1 mM DPPH(Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액이 되도록 메탄올(Daejung, Siheung, Korea)로 제조하여 사용하였다. 제조된 용액 0.75 mL를 각 농도별로 희석한 시료 용액 0.25 mL를 넣어 30분간 암소에서 반응시켜 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 517nm에서 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다(12). 대조군은 메탄올을 이용하여 추출시료용액과 동량 처리하여 같은 과정으로 실시하였다.

ABTS 양이온 라디칼 소거능은 7 mM ABTS(Sigma Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate(Sigma Aldrich Co.)를 증류수에 용해하여 1:1(v/v)로 혼합한 용액을 12시간 방치하여 ABTS 양이온 라디칼을 형성하였다. 그 후 734 nm 파장에서 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)을 이용하여 흡광도가 0.700±0.050이 되도록 에탄올을 이용하여 적정농도로 희석하였다. 이를 0.95 mL와 각 농도별로 희석한 시료 0.05 mL를 넣어 암실에서 6분간 반응 시켰다(13). 대조군은 시료용액과 동량의 에탄올을 이용하여 같은 과정을 실시하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

300 mM sodium acetate(Sigma Aldrich Co.)을 증류수에 용해시켜 acetic acid(Daejung)로 pH 3.6으로 조정하였다. 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(Sigma Aldrich Co.)은 40 mM HCl(Daejung)로 용해하였다. 또한 20 mM FeCl₃(Sigma Aldrich Co.)은 증류수에 용해하여 사용하였으며, 제조한 각각의 용액을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 후 37℃에서 15분간 평형시켜 FRAP reagent를 제조하였다. 제조한 용액 0.9 mL와 각 농도별로 희석한 시료 0.03 mL를 넣어 준 후 암실에서 30분간 반응시켰다(14). 그 후 593 nm 파장에서 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)로 흡광도를 측정하였다. FRAP 환원력은 표준물질로 ascorbic acid(Sigma Aldrich Co.)를 이용하여 농도별로 증류수에 녹인 후 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

Folin-Denis법을 이용하여 고수 종자 에탄올 추출물의 총 페놀함량을 측정하였다. 적정 농도로 희석한 시료 용액 0.05 mL와 증류수 0.8 mL를 섞은 후 Folin-Denis' reagent(Sigma Aldrich Co.) 0.05 mL 를 첨가하여 혼합한 후 5분간 반응 시켜 포화된 sodium carbonate(Sigma Aldrich Co.) 0.1 mL를 첨가하여 30분간 정치하였다(15). 그 후 725 nm 파장에서 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)로 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid(Sigma Aldrich Co.)를 증류수에 용해하여 각 농도별로 희석하였으며, 이를 가지고 검량곡선을 작성한 후 정량하였다.

고수 종자 에탄올 추출물을 75 mM 인산완충용액에 일정 농도로 용해하여 시료로 사용하였다. 100 nM fluorescein salt를 시료와 동일한 buffer에 녹여 37℃ 항온수조에서 평형시켜 사용하였으며, peroxy radical을 생성시키는 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihychloride(AAPH)는 300 mM이 되도록 동일한 완충용액을 이용하였다. 시료는 50 μL, fluorescein salt는 150 μL, AAPH는 50 μL를 넣은 후 형광물질의 발광정도를 37℃ 온도를 유지하여 493 nm에서 전자가 여기되며, 515 nm 파장에서 방출되게 측정하였다(16). 표준물질로 trolox(Sigma Aldrich Co.)를 75 mM phosphate buffer에 녹여 fluorescence microplate reader (Gemini XPS, Molecular devices, San Jose, CA, USA)에서 측정하였다.

고수 종자 에탄올 추출물을 소량의 dimethyl sulfoxide (Daejung)에 완전히 녹인 후 옥수수유에 100 ppm이 되도록 첨가하였다. 대조군으로는 동량의 dimethyl sulfoxide가 처리된 옥수수유를 사용하였다. 이를 dry oven(GISICO, Seoul, Korea)에서 3, 6, 9시간 동안 100±5℃의 열로 산화시켰다. 잔열로 산화되는 것을 방지하기 위해 산화된 후에 -20℃에서 보관하며 실험하였다.

산화된 시료 100 mg을 isooctane(Daejung) 25 mL에 분산시켜 흡광도 값이 적정범위로 들어오도록 isooctane을 이용하여 희석하였다(17). 그 후 UV/VIS-spectrometer(Mega-U600, Scinco)로 233 nm파장에서 석영셀을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

ρ-AV는 산화된 시료 100 mg을 25 mL의 isooctane (Daejung)에 분산시켜 준비한다. 0.25% ρ-anisidine(Kanto chemical, Tokyo, Japan)이 되도록 acetic acid에 제조하여 시료 1 mL와 제조된 용액 0.2 mL를 넣어 암실에서 15분간 반응시켜(18) UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)로 350 nm 파장에서 석영셀을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

모든 실험은 3반복 실시하여 결과를 얻었으며, 이는 SPSS program(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 t-test 및 one-way ANOVA로 분석하였고, 사후검정은 Duncan’s multiple range test를 이용하였다. 상관관계지수는 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

고수 종자 에탄올 추출물을 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도로 제조하여 측정하였다. 그 결과는 Fig. 1과 같다. DPPH 라디칼 소거능은 각각 24.40, 54.97, 80.66%로, ABTS 양이온 라디칼 소거능은 각각 8.89, 16.8, 34.25% 농도 의존적으로 소거능이 증가하였다. Wangensteen 등(19)의 연구에 의하면 고수 잎과 종자의 에탄올 추출물의 DPPH 소거활성을 IC₅₀으로 나타내었을 경우 각각 389, 510 μg/mL로 나타났다고 보고하였다. 이와 비교하여 본 연구를 IC₅₀으로 나타내었을 경우 536.62 μg/mL로 나타나 유사한 결과를 보였다(data not shown). Shahwar 등(20)은 고수 잎과 종자의 메탄올 추출물의 DPPH 소거활성을 살펴본 결과 500 μg/mL 농도에서 각각 72.19, 64.4%의 활성을 보였다고 보고하였다. 이러한 차이는 추출 용매의 차이로 사료된다. Wang 등(21)은 고수 종자 오일을 에탄올에 1 mg/mL 농도로 녹인 시료는 19.7% ABTS 양이온 라디칼소거활성을 보였다고 보고하였다. 이는 오일을 추출한 후 사용하여 에탄올 추출물을 사용한 본 연구와의 차이가 발생한 것으로 사료된다.

Fig. 1. Radical scavenging activities of coriander seeds ethanol extract. Different letters are significantly different at p<0.05 among different treatment concentration of each group.

Download Original Figure

고수 종자 에탄올 추출물의 FRAP 환원력과 총 페놀함량은 Table 1과 같다. FRAP 환원력의 결과 284.1 μM ascorbic acid equivalent/g extract로 나타났으며, 총 페놀함량은 31.9 μM tannic acid equivalent/g extract로 나타났다.

Wangensteen 등(19)의 연구에 의하면 총 페놀함량을 gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었을 경우 잎과 종자의 에탄올 추출물은 각각 0.15, 0.36 GAE/100 g extract로 나타났다고 보고하였으며 Farah 등(7) 역시 고수 잎, 종자의 에탄올 추출물을 연구한 결과 각각 0.83, 0.72 g gallic acid equivalent/100 g extract로 나타났다고 보고하였다. 추출용매를 메탄올로 사용한 연구를 비교하여 보면 Shahwar 등(20)의 연구는 표준물질로 ascorbic acid를 이용하여 총 페놀함량을 비교 시 고수 잎과 종자 추출물의 경우 각각 30.25, 29.21 mg/mL로 보고하였으며, 또 다른 연구인 Deepa 등(22)은 고수 종자 추출물의 총 페놀함량은 gallic acid equivalent(mg/g)로 환산하였을 때 1.36 mg/g 로 나타났으며, FRAP 환원력은 ascorbic acid equivalent(mg/g)로 나타내었을 때 7.53 mg/g로 보고하였다. 고수의 잎과 종자에 대한 추출물의 총 페놀함량에 대한 연구는 많이 보고되어 있으며 추출 용매와 동일 용매를 사용하여도 추출된 시간 등의 조건 차이로 결과의 차이가 발생한 것으로 보인다.

Fig. 2A는 시간에 다른 fluorescein의 감소된 양을 고수 종자 에탄올 추출물 6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 희석하여 나타낸 것으로 농도의존적인 경향을 보였다. Fig. 2B는 blank area under the curve(AUC)에 대한 고수 종자 에탄올 추출물의 AUC를 나타낸 것으로 대조군에 비해 trolox 50 μM은 3.12배, 고수 종자 에탄올 추출물은 4.40배 항산화력을 보였다. 또한 trolox를 이용하여 표준곡선을 작성하여 1,135.1±28.5 μM trolox equivalent/g extract으로 나타났다(data not shown). Zheng과 Wang(23)은 베트남 고수를 인산완충용액을 이용하여 추출한 후 ORAC 분석한 결과 22.3 μmol of trolox equivalents/g으로 보고하였다. Karthiga와 Jaganathan는(24) 건조되지 않은 curry leaves에서 ORAC assay 분석 결과 52.5 μmol trolox equivalents/g으로 나타났다고 보고하였다. 본 연구 결과와 비교하면 추출물의 형태로 측정되어 차이가 발생한 것으로 사료된다.

Fig. 2. Effect of coriander seeds ethanol extract on fluorescein elimination induced by AAPH. A, Time course of the reaction of fluorescein with AAPH in coriander seeds ethanol extract at different concentration. B, relative area under the curve of control, trolox 50 μM, and coriander seeds ethanol extract 100 μg/mL in ORAC assay. Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p<0.05.

Download Original Figure

고수 종자 에탄올 추출물의 산화방지 측정 및 총 페놀 함량(TPC)의 상관관계를 분석한 결과는 Table 2와 같다. TPC와 DPPH 라디칼 소거능은 r=0.797(p<0.05), ABTS 양이온 라디칼 소거능은 r=0.919(p<0.01), FRAP 환원력은r=0.894(p<0.01)로 모두 유의적인 상관관계를 나타내었다. 본 연구 결과에서 TPC가 증가할수록 산화방지에 효과가 있는 것으로 나타났다. Ramkissoon 등(23)은 TPC와 DPPH의 상관관계를 coriander, turmeric scallion, pepper mint, onion, pasley, ginger, curry leaves를 비교하였을 때 r=0.8로 양의 상관관계를 보였다고 보고하였으며, TPC와 FRAP 환원력을 비교하였을 때는 낮은 상관성을 보였다고 보고하였다. Sreeramulu 등(26)의 연구를 살펴보면 고수 잎 등 일반적으로 소비되는 식물성 식품의 항산화 효과에 대한 연구로 가열 처리하지 않은 시료의 TPC와 DPPH의 상관관계는 r=0.935(p<0.001), TPC와 FRAP 환원력은 r=0.955(p<0.001)로 분석되었다.

Fig. 3. Change in conjugated dienoic acid in bulk oil with 100 ppm coriander seeds ethanol extract at 100℃. Different letters are significantly different among different treatment time of each group at p<0.05 . * and ** are significantly different between control and coriander seeds ethanol extract at p<0.05 and p<0.01, respectively.

Download Original Figure

Fig. 4. Change in ρ-anisidine value in bulk oil with 100 ppm coriander seeds ethanol extract at 100℃. Different letters are significantly different among different treatment time of each group at p<0.05. * and ** are significantly different between control and coriander seeds ethanol extract at p<0.05 and p<0.01, respectively

Download Original Figure

100℃에서 3, 6, 9시간 산화시킨 결과 대조군의 경우 각각 0.58, 0.71, 0.82%로 나타났으며, 고수 종자 에탄올 추출물이 100 ppm 농도로 첨가된 시료군의 경우 각각 0.53, 0.67, 0.75%로 나타났다. 9시간 CDA의 양은 대조군에 비해 시료군은 8.27% 감소하여 생성되었다. Mohamed 등(27)은 고수 종자 오일을 추출하여 옥수수유와 1:9, 2:8(w/w)로 혼합 후 60℃에서 0, 5, 10, 15일간 산화시킨 결과 대조군에 비해 유의적으로 고수 종자 오일의 양이 많을수록 산화생성물의 양이 적었다. 고수 종자에서 오일을 추출하여 포함한 경우 더 우수한 산화안정성을 갖는 것으로 보인다.

100℃에서 3, 6, 9시간 산화시킨 결과 대조군의 경우 각각 39.78, 40.85, 76.55로 나타났으며, 100 ppm 농도로 첨가된 시료군의 경우 각각 28.52, 37.0, 45.30으로 나타났다. 9시간 산화된 생성물의 양은 대조군에 비해 시료군은 40.82% 감소하여 생성되었다. Farah 등(10)은 고수 종자 메탄올 추출물을 100 ppm 농도로 첨가한 유지를 60℃에서 7일간 산화시킨 결과, 대조군은 41.09, BHT를 첨가시킨 군은 25.08, 고수 추출물을 첨가한 군은 33.06으로 나타났다고 보고하였다. 대조군에 비해 고수 추출물 첨가군이 19.54% 생성을 감소시켜 본 연구와의 차이가 나지만 온도와 시간 등의 조건차이로 사료된다. 하지만 대조군에 비해 산화생성물의 양은 감소시켜 산화안정성에 긍정적인 영향을 주는 것으로 판단된다.