기능성 식품소재 개발을 위한 야생 곰취잎 추출물의 생리활성

본 연구에 사용된 곰취 잎은 대구 팔공산 인근의 야산에서 자생하고 있는 상태의 야생 곰취 잎을 채취한 후 50℃ dry oven(FO-600M, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 건조하여 40 mesh로 분쇄하였으며, 분말은 4℃에서 저온 저장하며 시료로 사용하였다. 추출물 제조는 열수 추출물의 경우 곰취 분말 1 g에 증류수 200 mL를 가하고 가열교반기를 사용하여 약 1시간정도 100 mL가 될 때까지 가열하여 끓인 후 4℃에서 120 rpm으로 24시간 동안 교반 추출하였다. Ethanol 추출물은 곰취 분말 1 g에 100 mL의 60% ethanol을 추출용매로 가하여 에탄올이 증발하지 않게 마게를 덮어 밀봉한 후 24시간 동안 4℃에서 120 rpm으로 교반 추출하였다. 추출액은 Whatman No.1 filter paper(Whatman Inc., Piscataway, NJ, USA)로 여과한 후 ethanol을 제거하기 위하여 rotary vacuum evaporator(Buchi Co., Uster, Switzerland)으로 농축하여 시료로 사용하였다.

Total polyphenol 화합물 정량은 Folin과 Denis의 방법(8)에 준하여 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent(Junsei, Tokyo, Japan) 0.5 mL를 섞어 Na₂CO₃ 1 mL를 가하여 1시간 동안 암실에 방치한 후, UV-visible spectrophotometer (Optizen 3220UV, Mecasys Co., Daejeon, Korea)을 이용하여 725 nm의 파장으로 흡광도를 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.

각 추출물의 생리활성의 측정은 생리활성 물질로 알려져 있는 phenolic 농도를 측정한 후 농축 및 희석 과정을 통하여 phenolic 농도를 50-200 μg/ml로 농도구간은 4구간으로 조절하여 실험하였다.

2,2'­Azinobis­(3­ethylbenzothiazoline­6­sulfonic acid) radical cation decolorization(ABTS)의 측정은 Fellegrin 등의 방법(9)에 준하여 측정하였고, 저해율(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다. Antioxidant protection factors(PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법(10)에 준하여 측정하였으며, PF는 (반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)의 비로 나타내었다.

Hyaluronidase(HAase) 저해활성은 Dorfman과 Ott의 방법(11)에 준하여 측정하였다. 반응구는 시료 0.5 mL에 20 mM Sodium phosphate buffer(pH 6.9)에 녹인 HAase(1,000 U/mL) 0.5 mL을 혼합하여 38℃에서 5분간 반응시키고 0.3 M phosphate buffer(pH 5.3)에 녹인 기질(4 mg/mL) 0.5 mL을 넣어 다시 38℃에서 45분간 반응시킨 후 0.04 M acetate buffer(pH 3.75)에 녹인 알부민용액 5 mL을 첨가한 후 5분간 방치하고 600 nm에서 투과율을 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수 0.5 mL를 넣어 반응시켰으며, 저해율(%)은 (1-반응구의 투과율/대조구의 투과율)×100으로 계산하였다.

ACE 저해효과 측정은 Cushman과 Cheung의 방법(12)에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.3 M NaCl을 함유하는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 8.3)에 기질인 hippuryl-L-histidyl-Leucine(HHL, Sigma-Aldrich Co., Louis, MO, USA) 2.5 mM을 녹인 액 0.15 mL, ACE(0.25 unit/mL, Sigma-Aldrich Co.) 0.1 mL와 각 시료 용액 0.1 mL를 혼합하였으며, 대조구는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고, 1 N HCl 0.25 mL 첨가로 반응을 중지시킨 뒤 3 mL의 ethylacetate를 첨가하였다. Ethylacetate 층으로부터 용매를 증류시킨 잔사에 2 mL의 증류수를 첨가하여 추출된 hippuric acid를 spectrophotometer (Optizen 3220UV, Mecasys Co.)를 사용하여 280 nm 파장에서 흡광도를 측정한 후 hippuric acid 표준곡선으로부터 생성량을 환산하였다. 저해율(%)은 (1-반응구의 hippuric acid 생성량/대조구의 hippuric acid 생성량)×100으로 계산하였다.

Astringent 효과 측정은 Lee 등의 방법(13)에 준하여 측정하였다. 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.5) 100 mL에 hemoglobin 5 g을 첨가하여 5% hemoglobin 용액을 제조하였다. 반응구는 5% hemoglobin 용액 1 mL와 시료 1 mL, buffer 1 mL를 혼합하여 VS-6000N 원심분리기(VISION SCIENTIFIC, Daejeon, Korea)를 이용하여 2,000 rpm으로 30분간 원심분리하였으며, 대조구는 시료 대신 증류수 1 mL를 첨가하여 원심분리하였다. 그 후 상등액 2 mL를 취하여 spectrophotometer(Optizen 3220UV, Mecasys Co.)를 사용하여 576 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 침전율을 계산하였다. 침전율(%)은 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리는 IBM SPSS statistics ver. 22 for windows(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였고 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 시료간의 유의차를 p<0.05 수준으로 비교 분석하였다.

Total polyphenol compounds(TPC)는 식물체의 2차 대사산물로서 다양한 식물군에서 약 8,000개의 물질이 분리 정제되어 그 구조가 밝혀져 있다. 식물체는 phenylpropanoid pathway를 통해 생성된 물질들을 이용하여 여러 가지 유도체들을 생성하게 된다. 일반적으로 TPC는 식물들이 자외선으로부터 방어, 병원체에 대한 면역 등을 위하여 생성하는 물질이지만 최근의 연구에 의하면 인체 내에서 항산화, 암세포 생장 억제, 심혈관계 질환 완화 등 다양한 생리활성 효과를 가지는 것으로 보고되었다(14,15). 본 연구에서는 이러한 생리활성 효과를 가지는 TPC를 추출하는 최적조건을 찾아보고자 하였다. TPC의 양은 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 환산하였다. 다양한 용매를 이용하여 추출한 결과 Fig. 1A에서와 같이 열수 추출물에서 14.42 GAE mg/g으로 가장 높은 추출 수율을 나타내었고 acetone, ethyl acetate, methanol, butanol, ethanol 순으로 추출 수율이 감소하는 양상을 나타내었다. 곰취 추출물을 식품 소재로 사용하기 위하여 인간에게 해가 없는 것으로 알려진 물과 ethanol을 추출 용매로 선택하였고, 추출 시간에 따른 추출수율을 알아보기 위하여 3시간 간격으로 추출한 결과 Fig. 1B에서와 같이 열수 추출물은 추출 시간이 증가함에 따라 추출수율이 증가하는 결과를 나타내었으며 ethanol 추출물은 시간에 따른 유의적 차이는 나타나지 않았다.

Fig. 1. Content of phenolics in various solvents (A) and extraction time (B) of water and 60% ethanol extracts from wild Ligularia fischeri. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by Duncan’s multiple range test.

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ABTS와 potassium persulfate가 16시간 이상 반응하여 생성된 ABTS+ free radical은 짙은 청록색을 나타내지만 항산화 물질과 만나면 무색으로 탈색되는 성질을 가지고 있다. ABTS 라디칼 소거능은 이러한 원리를 이용하여 항산화 효과를 측정할 수 있는 방법으로, 가장 널리 사용되는 항산화 효과 측정 방법 중 하나이다(16). 곰취 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig 2A에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 98.64-99.84%의 라디칼 소거능을 나타내었고, 60% ethanol 추출물은 95.14-98.96%의 라디칼 소거능을 나타내었다. positive control로 사용한 BHT는 50-200 μg/mL의 농도에서 30.33-84.9%로 곰취 추출물보다 낮은 라디칼 소거능을 나타내었다. Song 등(17)은 조릿대 열수, 에탄올 추출물이 각각 500 μg/mL 농도에서 60.89%, 61.77%의 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다고 보고한 결과와 비교하였을 때, 곰취의 ABTS 라디칼 소거능이 더 우수하다고 판단되었다.

Fig. 2. ABTS cation radical decolorization (A) and antioxidant protection factor (B) as anti-oxidative activities of water and 60% ethanol extract from wild Ligularia fischeri. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by Duncan’s multiple range test.

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PF는 β-carotene linoleate system을 이용한 항산화 효과 측정방법이다. β-Carotene linoleate system은 불포화 지방산의 산패 과정에서 생성된 free radical이 β-carotene을 산화시켜 β-carotene의 특유의 색을 탈색시키게 되는데, 이 과정에서 산화된 β-carotene은 free radical의 연쇄 산화반응을 중단시켜 free radical의 반응성을 잃게 만든다. PF는 이러한 원리를 이용하여 지용성 물질의 항산화 효과를 측정하는데 널리 사용된다(18). 곰취 추출물의 PF를 측정한 결과, Fig. 2B에서와 같이 열수추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 0.59-1.02 PF를 나타내었고, 60% ethanol 추출물에서는 0.30-0.74 PF를 나타내었다. 열수 추출물의 경우 50-200 μg/mL의 농도에서 농도가 증가함에 따라 PF가 유의적으로 증가하였으나, 60% ethanol 추출물의 경우 농도가 증가함에 따라 PF가 유의적으로 감소하는 결과를 나타내었다. 이는 60% ethanol 추출물이 지용성 물질에 대한 항산화 효과를 나타내지 못하며, TPC의 농도가 높아짐에 따라 sample의 색 또한 진하게 나타나 발생한 결과로 판단되었다. Positive control로 사용한 BHT는 같은 농도에서 1.01-1.16 PF를 나타내었다.

Hyaluronic acid(HA)는 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)을 이루는 거대분자로, 세포 내부와 혈관, 폐 등에도 존재한다. 일반적으로 고분자의 HA는 염증을 예방하며 상처 치유와 혈관신생, 세포 분화에 관여 한다고 알려져 있으나, hyaluronidase(HAase)등에 의하여 저분자로 분해된 HA는 그 수가 적을 경우에는 염증에 관여하는 cytokine류의 발현을 증가시키며, 저분자 HA가 많아질 경우 급성 염증성 피부염을 일으키고 혈관신생 억제에 관여한다(19,20). 이러한 HAase의 활성을 억제 혹은 조절하여 염증의 원인이 되는 저분자 HA의 생성을 조절할 수 있다. 곰취 추출물의 HAase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 3에서와 같이 열수 추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 4.66-35.00%의 저해효과를 나타내었으나, 60% ethanol 추출물은 저해효과를 나타내지 않았다. Positive control로 사용한 vitamin C는 50-200 μg/mL의 농도에서 22.34-59.03%의 저해 효과를 나타내었다. An과 Kim(21)은 온청음 열수 추출물이 440 μg/mL의 농도에서 50%의 HAase 저해 효과를 나타낸다고 보고하였는데, 이와 비교하였을 때 곰취 열수 추출물의 HAase 저해 효과가 더 우수하다고 판단되었다.

Fig. 3. Inhibitory activity against hyaluronidase of water and 60% ethanol extract from wild Ligularia fischeri. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by Duncan’s multiple range test.

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인체 내의 혈압조절 시스템중 하나인 RAAS(Renin-angiotensin-alodosterone system)는 체액내의 물질들을 이용한 혈압조절 시스템이다. 동맥 내의 혈류량이 감소하여 혈압이 감소하면 신장의 사구체에서 레닌(renin)이 분비된다. 레닌은 혈장내의 angiotensiogen을 활성화시켜 angiotensin I로 전환시키고, angiotensin I은 angiotensin converting enzyme의 작용을 받아 angiotensin Ⅱ로 전환된다. Angiotensin Ⅱ는 angiotensin Ⅱ type 1 수용체(AT1)와 결합하여 부신피질을 자극시키고 알도스테론(aldosterone)의 분비를 촉진한다. 분비된 알도스테론은 신장에서 나트륨 이온의 재흡수를 촉진하여 결과적으로 혈압을 상승시킨다(22,23). 이 과정에서 중요한 역할을 하는 것이 ACE로, ACE의 활성을 저해하는 것을 통하여 급격한 혈압 상승을 억제할 수 있다. 곰취 추출물의 ACE 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 4에서와 같이 열수 추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 0-64.24%의 ACE 저해 효과를 나타내었으며, 60% ethanol 추출물의 경우 46.12-69.64%의 ACE 저해 효과를 나타내었다. Positive control로 사용한 captopril은 50-200 μg/mL의 농도에서 40.32-70.96%로 150 μg/mL의 농도까지는 곰취 60% ethanol 추출물 보다 낮은 ACE 저해 효과를 나타내었고 200 μg/mL의 농도에서는 비슷한 저해 효과를 나타내었다. Kwon과 Youn은(24)이 모링가를 1:10의 비율로 추출한 물 추출물과 ethanol 추출물이 각각 34.81%와 27.68%의 ACE 저해 효과를 나타낸다고 보고한 결과와 비교하였을 때, 야생 곰취 추출물의 ACE 저해 효과가 더 우수하다고 판단되었다. 또, 현재는 사용량이 줄었으나, 실제로 고혈압 환자에게 사용하는 약물인 captopril과 비교하였을 때, 곰취 추출물의 ACE 저해 효과의 우수성이 충분히 입증되어 향후 고혈압 예방 및 치료를 위한 식품소재로서 활용이 가능할 것이라 판단되었다.

Fig. 4. Inhibitory activity against angiotensin converting enzyme of water and 60% ethanol extract from wild Ligularia fischeri. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by Duncan’s multiple range test.

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Astringent는 ‘수렴’의 의미를 포함하고 있는 단어로 ‘한곳으로 모이는’, ‘뭉치는’이라는 뜻을 가지고 있다. Astringent의 원리는 식물체 내에 존재하는 polyphenol compounds와 flavonoids가 단백질과 같은 거대분자에 작용하여 서로 뭉치거나 가교결합을 형성하게 만든다. 이러한 원리를 피부에 적용시키면 식물체에 포함되어있는 polyphenol compounds와 flavonoids가 모공 주변의 단백질들 사이에 가교결합을 형성하도록 하여 모공을 수축하는 효과를 기대할 수 있다(25). 직접적으로 동물실험이 불가능했기 때문에 시험관 내에서 hemoglobin을 이용하여 추출물의 astringent를 간접적으로 확인할 수 있었다. 곰취 추출물의 astringent 효과를 측정해본 결과 Fig. 5에서와 같이 열수 추출물은 50-200 μg/mL의 TPC 농도에서 15.68-26.92%의 astringent 효과를 나타내었으나, TPC 농도가 증가함에 따라 감소하는 결과를 나타내었다. 60% ethanol 추출물의 경우 같은 농도에서 49.48-86.84%의 astringent 효과를 나타내었으며, TPC 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었다. Positive control로 사용한 tannic acid는 50-200 μg/mL의 농도에서 41.98-84.53%의 astringent 효과를 나타내어 곰취 60% ethanol 추출물보다 낮은 효과를 나타내었다. Lee 등(26)은 층꽃나무 ethanol 추출물이 50-200 μg/mL의 농도에서 15-50%의 astringent 효과를 나타낸다고 보고하였는데, 위의 결과와 비교하였을 때 곰취 추출물의 astringent 효과가 매우 우수하다고 판단되었다.

Fig. 5. Astringent effect of water and 60% ethanol extract from wild Ligularia fischeri. Values with different alphabet in the column were significantly different among group at p<0.05 level by Duncan’s multiple range test.

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