저장 생강 유래 부패 곰팡이 Fusarium oxysporum에 대한 식물 추출물의 항진균 활성

2010년 10월 충남 서산에서 수확한 생강을 온도 12±0.5℃, 습도 95±2℃ 조건에서 4개월 저장 후 부패하지 않은 생강과 부패가 발생한 생강 10종 이상을 선택하여 절단한 후 골고루 혼합하여 시료로 사용하였다.

생강의 진균류 확인을 위하여 시료 25 g을 취한 뒤 225 mL의 멸균된 0.85% saline을 넣고 Stomacher® 400 circulator (Seward, Inc., London, England)로 160 rpm에서 2분간 균질화 시킨 후 1 mL씩 취하여 9 mL의 0.85% saline에 단계별 희석하였다. 각 단계별 희석액 100 μL를 tartaric acid를 넣어 pH를 3.5로 조정한 potato dextrose agar(PDA, Merck, Darmstadt, Germany)에 접종 후 도말하였다. 플레이트는 25℃에서 5-7일간 배양한 후 발생한 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 진균수로 하였다. 진균류의 동정은 생강으로부터 분리된 진균류 중 형태학적 차이를 보이는 우점 진균 10종을 선발하여 TS-5.8S rDNA sequencing 을 이용하는 유전학적 방법으로 동정하였다. 각 균주의 chromosomal DNA는 균체를 saline solution(0.8% NaCl, 0.0125% tween 20)에 현탁 후 원심분리를 통하여 균사체를 획득한 다음, 얻어진 균사체에 lysis buffer(0.05M EDTA (pH8.0), 0.3% SDS)를 넣고 10분간 방치하였다. 상등액을 취하여 멸균된 glass bead를 이용하여 균사체를 파쇄한 다음, 원심분리(14,000 rpm, 3분)하고, 상등액을 취하여 동일 부피의 isoprophanol을 가하여 genomic DNA를 침전시켰다. 원심분리에 의해 얻어진 genomic DNA는 70% ethanol로 세척하고, 얻어진 genomic DNA에 미량의 멸균수를 첨가한 다음 60℃에서 1시간 처리 후 PCR에 사용하였다. PCR을 위해서 ITS-5.8S rDNA sequencing에 사용하는 universal primer인 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3')와 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') primer를 사용하여 수행하였다. 증폭된 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing kits(Applied Biosystems Co., Foster City, CA, USA)를 사용하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer(96 capillary type)를 통해 염기서열을 분석하였으며, 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였고, sequence의 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교 분석하였다.

생강의 부패에 관여하는 진균을 선발하기 위하여 선정된 우점 진균 10종을 Potato Dextrose Broth(PDB, Merck, Darmstadt, Germany)에 접종하고 35℃에서 3일간 배양하였다. 각각의 배양액 100 μL를 건강한 생강의 표면에 접종 한 후 30℃에서 저장하면서 생강 조직의 괴사를 발생시킨 진균을 생강 부패 유도 진균으로 선발하여 항진균 활성 평가를 위한 시험균으로 사용하였다.

실험 재료는 항균력이 있다고 알려져 있으며 현재 한약재로 사용 중이거나 식용이 가능한 가자(Terminariae Fructus), 감초(Glycyrrhizae Radix), 계피(Cinnamomi Cortex), 민들레(Taraxacum Platycarpum), 복분자(Rubi Fructus), 소목(Caesalpiniae Lignum), 육두구(Myristicae Semen), 정향(Caryophylli Flos), 지유(Sanguisorbae Radix), 초두구(Alpiniae Katsumadaii Semen), 황금(Scutellariae Radix), 황초(Astragalus membranaceus) 등 식물 추출물 12종을 선정하였다. 선정된 식물 추출물은 한국식물추출물 은행으로부터 분양 받은 에탄올 추출물을 본 실험에 사용하였다. 항진균 활성 평가는 CLSI 방법(20)에 제시된 방법을 참고하여 수행하였다. 부패한 생강으로부터 분리된 Fusarium oxysporum을 PDA에 접종하여 35℃에서 3일간 배양한 후 균체에 0.85% 멸균 생리적 식염수 1 mL를 떨어뜨리고 피펫으로 균체와 잘 혼합하였다, 그 위에 Tween 20을 한 방울 떨어뜨린 후 혼합한 균액을 1.5 mL 멸균 튜브에 담고 15분간 방치하였다. 상층액을 취하여 15초간 vortexing 한 다음 530 nm에서 흡광도가 0.15-0.17가 되도록 0.85% saline으로 조정하여 균수가 6 log CFU/g 수준이 되도록 하였다. 멸균한 면봉에 시험액을 묻힌 후 Muller-Hinton agar(MHA, Hanil-KOMED, Seongnam, Korea) 표면에 고르게 도말하고, 5분간 방치하여 표면이 마르게 하였다. 멸균된 paper disc(8 mm)에 DMSO에 용해시킨 12종의 추출물은 50% dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 20 μg/disc 농도가 되도록 점적하여 흡수시킨 다음, 35℃에서 3일간 배양하여 clear zone 생성 유무로 항균활성을 측정하였다.

Paper disc assay를 통한 항진균 활성을 보인 식물 추출물 3종(계피, 민들레, 정향)을 대상으로 선발 곰팡이에 대하여 최소억제농도를 측정하였다. 항균활성 평가와 동일한 방법으로 제조한 균액을 MHA agar에 도말한 후 5분간 방치하여 표면이 마르게 한 후 멸균된 paper disc(6 mm)를 배지 위에 놓았다. 3종의 추출물은 20, 10, 5, 2.5, 1.25 μg/disc 의 농도로 paper disc에 흡수시킨 후 35℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후 균 증식이 나타나지 않는 농도를 최소저해농도(MIC)로 결정하였다.

본 연구의 결과는 실험의 결과값을 평균±표준편차로 나타냈고, 각 실험군간의 비교 분석은 SPSS 12.0 프로그램을 이용하여 Duncan의 다중검정법(Duncan’s multiple range test)으로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

생강에 포함된 다양한 종류의 곰팡이 균주를 분리하기 위하여 10-12℃에서 4개월간 저장 한 후 부패가 일어 나지 않은 생강과 부패 현상을 보이는 생강을 수집하였다. 수집된 생강 시료로부터 곰팡이를 분리하기 위하여 PDA에 도말하여 25℃에서 배양한 결과, 저장 초기의 곰팡이와 효모가 4.5, 3.0 log CFU/g 이었던 것과 비교하여 부패가 나타나지 않은 생강 시료의 곰팡이와 효모는 증가하지 않았으나 부패 현상을 보이는 생강 시료의 곰팡이와 효모는 증가한 것으로 나타났다(Table 1). 부패가 나타나지 않은 대조군의 경우 저장 후 곰팡이가 4.1 log CFU/g로 저장 초기와 비교하여 증가하지 않았고, 부패가 나타난 생강 시료의 곰팡이수는 각각 5.2, 6.4 log CFU/g으로서, 초기 곰팡이 수와 비교하여 약 1-2 log CFU/g 증가하였다. 효모의 경우에도 곰팡이와 비슷한 경향으로 대조군이 3.5 log CFU/g인 반면, 부패한 생강의 효모는 5.0, 6.2 log CFU/g으로 나타났다. 이와 같은 결과는 10℃에서 70일간 저장 한 생강 시료에서 곰팡이 증가가 나타나지 않았다는 Mishra 등(21)의 연구와 유사한 경향을 보였다. 본 연구 결과에서 부패하지 않은 생강 시료와 부패한 생강 시료의 곰팡이수는 약 1.5-2 log CFU/g 차이가 있는 것으로 나타났고 저온에서 장기간 저장 시 부패 현상에 관여하는 병원균을 분리하기 위하여 부패 현상이 없는 생강과 부패한 생강으로부터 형태학적 차이를 보이는 곰팡이를 분리하여 동정하였다.

생강 저장 시 우점하는 곰팡이와 부패에 직접적으로 관여하는 곰팡이를 확인하고 선발하기 위하여 건강한 생강과 부패한 생강 시료로부터 확인된 곰팡이를 PDA에 순수 분리한 후 형태학적, 배양학적 특징이 구분되는 10종의 곰팡이를 선정하였다(Fig. 1). 분리된 각각의 곰팡이를 ITS-5.8S rDNA sequencing를 이용하여 분석한 후 ITS 영역의 염기서열을 NCBI의 GenBank에 수록된 DNA 염기서열 database에 검색한 결과, 저장 후 부패가 발생하지 않은 생강으로부터 분리된 NS1, NS2, NS3, NS4는 phylogenetic tree 상에서 97% 이상의 매우 높은 상동성을 나타내어 Hypocrea virescentiflava, Fusarium oxysporum, Acremonium strictum에 속하는 균주임이 확인되었다. 반면 부패한 생강으로부터 분리된 곰팡이의 ITS 염기서열은 S1, S2가 F. oxysporum과 70%의 상동성을 나타냈고 S4는 Fusarium solani와 92%의 상동성을 S5는 Cadophora fastigiata의 염기서열과 97%의 높은 상동성을 나타내었다(Fig. 2). 생강의 뿌리 썩음병을 일으키는 주된 원인균은 Pythium myriotylum이지만 F. solani와 F. oxysporum 역시 생강의 뿌리썩음병과 시들음병에 직접적으로 관여하는 병원균으로 알려져 있다. 특히 F. oxysporum은 미국(22), 인도(23), 호주(24) 등과 같은 생강을 생산하는 많은 국가에서 뿌리썩음병을 일으키는 주된 병원균으로 보고 되어있고, 토양에 다수 존재하고 있기 때문에 수확 후 가공 처리에 의해 발생되는 표면 상처 부위를 통해 토양 내 F. oxysporum가 유입되고 이로 인하여 표면이 괴사되는 현상이 나타난다고 알려져 있다. 일반적으로 P. myriotylum은 30℃ 이상의 환경에서 부패병을 촉진한다고 알려진 반면(25) F. oxysporum은 16℃의 저온 환경에서도 부패병을 일으킬 수 있다고 보고되어 있고(26), 또한 Fusarium spp.의 경우 병원성보다는 부생성이 강한 진균으로 부패가 어느 정도 진행된 작물로부터 쉽게 분리 된다고 보고되었다(27). 따라서 본 연구에서 확인된 결과와 마찬가지로 장기간 동안 저온에서 저장된 생강의 부패에는 F. oxysporum이 우선적으로 작용하는 것으로 판단된다. 본 연구에서 생강의 병원성 검정 결과, 부패한 생강으로부터 분리된 F. oxysporum 접종 시 5일 후 균사가 하얗게 자라났고 이들 균사와 포자는 주변으로 점차 번지면서 급속히 확산되었다. 이는 Li 등(28)이 보고한 생강에 발생하는 마른썩음병의 병징과 일치하였으므로 부패한 생강으로부터 분리된 F. oxysporum을 항진균 활성 평가를 위한 최종 시험균으로 선정하였다.

Fig. 1. Diversity of the fungal colonies from non-spoilage and spoilage ginger after storage for 120 days. NS, non spoilage ginger; S, spoilage ginger.

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Fig. 2. Phylogenetic comparison of the ITS-5.8S rDNA region sequence of the this isolates with closely related strains and other species of dominant fungus from non spoilage ginger (A) and spoilage ginger (B) from GenBank. The tree was constructed based on the neighbor-joining analysis and confidence intervals in tree topology were estimated by bootstrap analysis with 1,000 replicates.

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부패 생강 분리주인 F. oxysporum 에 대한 식물 추출물 12종의 항진균 활성 탐색은 disc diffusion assay를 통해 측정하였다(Table 2, Fig. 3). 그 결과, 계피, 민들레, 정향, 초두구, 지유, 황금, 육두구, 가자, 복분자등이 F. oxysporum에 대해 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 그 중 계피의 clear zone이 22 mm로 가장 우수한 항진균 활성을 나타냈고, 다음으로 민들레가 15 mm, 정향이 14 mm로 우수한 항균 활성을 나타냈다. 그 외 초두구, 지유, 황금, 육두구, 가자, 복분자의 clear zone은 10.3-11.8 mm로 F. oxysporum에 항진균 활성을 보였다. Jeong 등(29)의 연구에 따르면 계피 추출물은 미생물의 증식 억제 기능을 가지며, 특히 곰팡이류의 증식을 효과적으로 억제한다고 보고하였으며 이는 계피의 구성요소 중 eugenol과 cinnamaldehyde가 높은 항균력을 함유하고 있기 때문이라고 보고하였다. 계피의 주요 성분 중 하나인 cinnamaldehyde는 항진균, 항균 특성 때문에 식품, 곡물, 식물의 post-harvest 관리 분야에서 많이 이루어지고 있고 특히 Botryodiplodia theobromae의 성장을 현저하게 감소시킴으로써 과일의 저장 중 부패를 감소시킨다고 보고된 바 있으며 또한 채소의 저장 중 부패를 야기하는 Erwinia cartovora 등의 부패균에도 효과가 있음이 밝혀진 바 있다. 이와 함께 국화과 역시 항균성이 높다고 보고되어 있으며, 특히 민들레 추출물은 높은 flavonoid와 phenolic acid를 함유하고 있고 이와 같은 성분이 미생물의 세포막에 침투하는 성질을 가지며 이는 세균의 세포막을 파괴시킴으로써 세포 성분이 유출되어 항균 활성을 나타낸다고 보고되고 있다(30,31). 그러나 민들레 추출물의 F. oxysporum에 대한 항균활성결과는 아직 보고된 바는 없으나 민들레 추출물이 가지고 있는 phenolic acid와 flavonoid 성분이 곰팡이의 세포막 손상과 성분 유출에 의한 항진균 활성에도 관여할 수 있는 것으로 사료된다. 정향은 향신료의 일종으로서 주성분인 eugenol은 곰팡이의 aflatoxin을 억제하고(32) Listeria monocytogenes와 Aeromonas hydrophila의 증식을 억제한다고 보고되었다(33). 그 외 약용식물인 지유와 황금 추출물 역시 Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, E. coli와 Salmonella typhymurium에 대하여 생육억제 효과를 보인다고 보고되었다(34,35). 지금까지 계피, 민들레, 정향 등 약용식물 추출물의 항진균 효과에 대한 연구는 미미한 편이므로 본 연구 결과를 통해, 생강의 저온 저장시 나타나는 시들음 또는 뿌리썩음병을 억제할 수 있는 천연 항균 물질로서 이용 가능성이 높다고 사료된다.

Fig. 3. Antifungal activity of natural plant extracts based on disc diffusion assay against Fusarium oxysproum isolated from stored ginger for 120 days. Symbols; No.1, Cinnamomum cassia; No.2, Taraxacum Platycarpum; No.3, Rubus coreanus Miquel; No.4, Terminalia chebula Retzius; No.5, Eugenia caryophyllata; No.6, Myristica fragrans; No.7, Sanguisorba Officinalis; No.8, Alpinia katsumadai; No.9, Scutellaria baicalensis.

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12종의 추출물의 항진균활성을 평가한 결과 계피, 민들레, 정향 추출물의 항균활성이 높은 것으로 확인되었고 이들 3종의 식물 추출물의 항진균 효과를 보다 정확하게 평가하기 위하여 최소억제농도 확인을 통하여 항진균활성을 정량적으로 분석하였다(Table 3). F. oxysporum에 대하여 민들레 추출물이 2.5 μg/disc로 가장 낮은 농도에서 곰팡이 분리주의 생장을 억제하였고, 계피와 정향은 10 μg/disc의 농도에서 억제활성이 있음이 확인되어 민들레에 의한 F. oxysporum 억제 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 민들레 추출물은 Bacillus subtilis, Pseudomonas flourescens, L. monocytogenes와 S. aureus의 성장을 억제한다는 보고(36,37)가 있고 특히 2 mg/mL 농도에서 L. monocytogenes와 S. aureus를 95% 이상 억제하는 효과가 있다고 보고하였으나 민들레 추출물에 의한 항진균 효과에 대한 보고는 없었다. 따라서 본 연구 결과를 통해 민들레 추출물은 식물 병원균인 F. oxysporum에 대한 항진균 활성이 우수하다고 할 수 있으며 F. oxysporum에 의해 발생되는 시들음병과 뿌리썩음병의 발생을 억제시킬 수 있는 천연 항균제로서의 적용 가능성을 기대할 수 있다고 판단된다. 계피 또한 Aspergillus niger에 대해 우수한 항진균 활성을 보여 천연 방부제로서 활용할 수 있다고 보고되었고(19) Mvuemba 등(38)의 연구에서는 150 mg/mL의 농도에서 A. niger와 Fusarium sambucinum등의 mycelia 형성을 억제하였다는 보고하였는데 본 연구에서는 500 μg/mL 수준에서 F. oxysproum을 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 사용한 균주의 차이로 생각되며 이와 함께 항진균성 물질을 추출할 때 용매 농도 및 용매의 종류에 따라 항진균력에 차이가 있기 때문이라고 사료된다. 본 연구에서 정향 추출물 또한 F. oxysporum에 대하여 우수한 항균 효과를 보였는데, 이는 Sharma 등(39)의 연구 결과에서 정향 추출물 12.5 mg/mL에서 F. oxysporum의 성장 억제에 높은 활성을 보였다는 보고와 Sukatta(40)의 연구에서 포도의 부패를 일으키는 Rhizopus stolonifera에 대해 정향 추출물이 항균 활성을 보였다는 결과와 유사하게 나타났다. 이와 같은 결과를 통하여 민들레, 계피, 정향 추출물이 식물부패 원인균인 F. oxysporum에 대해 우수한 항균활성을 나타내 항균제제로 활용할 가능성이 있다고 판단된다.