죽력의 in vitro에서의 angiotensin-converting enzyme 저해효과와 마우스모델에서 혈행개선효과

담양산 대나무를 사용하여 죽력을 제조하는데 송산제약 에서 설치되어 있는 제조장치를 이용하여 죽력을 제조하였 고 또한 제조된 탄화한 대나무의 경우 대나무 숯으로 제조, 생산된 죽력을 여과하는 재료로 사용하였다. 죽력의 혈행 개선효과를 확인하기 위하여 positive control로 청국장을 사용하였는데 청국장은 노란콩을 5시간 침지한 다음, 12 1℃에서 15분간 증자한 다음, 42℃에서 48시간 발효하고, 이를 10배의 물추출을 12시간 후 filter paper(Whatman No.2)를 이용, 회전증발장치 R-200(BUCHI, Labortechnik, Postfach, Flawil, Switzerland)를 이용, 건조하여 사용하였다.

죽력의 생산은 송산제약에서 제작한 간접가열방식의 전 기로를 이용하여 제조하였다. Fig. 1에 도시되어 있는 것처 럼, 로 안으로 출입하는 밀폐형 철제상자에 쪼갠 솜대를 넣고서 밀폐한 후 상자 아랫방향으로 제작된 벨브를 로의 하부에 설치된 죽력 수집장치에 연결시키고 로에서 350-430℃로 가열하면서 공기의 양을 조절하여 10-12시간 을 대나무를 철제상사에서 탄화시킨다. 이때 발생하는 연 기를 하부로 연결된 벨브에서 죽력 수집장치로 포집되어 온도가 80-150℃정도에서 응축시켰으며, 바로 생산된 죽력 시료(bamboo juice)를 6개월 이상 냉소에서 숙성 기간을 거쳐 생산된 시료를 죽력(BCL I)으로 사용하였고, 여기에 탄화과정에서 발생한 대나무 숯을 정제과정의 활성탄으로 사용, 정제 공정으로 하였다. 본 연구에서는 위의 공정에 의해 제조되어 얻은 정제된 정제 시료를 기본으로 하여 취하였다. 정제죽력은 죽력원액에 활성탄(200-250 mesh로 조정) 10% (w/w) 혼합 후 120 rpm으로 30분간 저어준 후 12시간 정치 후 여과한 죽력액 3 L을 5 L 증류 flask에 넣은 후 상압증류장치를 이용하여 108℃로 증류하여 초류분과 후류분을 제거한 증류분을 죽력으로 사용하였으며 증류과 정을 조정 1.0 °Brix로 조정, 이를 원료 죽력(BCLⅡ)으로 사용하였다.

Fig. 1. Manufacturing process of BCL.

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죽력원액을 증류수에 5,000, 10,000, 15,000, 20,000 ppm 이 되도록 시험용액을 제조하였으며, 혈전용해능 시험은 Astrup과 Mullertz의 방법(23)을 일부 변형하여 수행하였다. 즉, 67 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)에 0.5% fibrinogen을 용해시킨 용액 10 mL와 1% agarose 10 mL를 첨가하여 혼합하고, thrombin(T6884, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 50 unit/mL로 0.2 mL를 첨가하여 만든 fibrin plate에 지름 5 mm의 구멍을 만들어 시험용액 20 μL를 주입하고 37℃에서 17시간 반응시켜 이때 생성된 투 명환의 면적을 계산하여 측정하였으며 대조구로는 정제된 혈전용해 효소인 plasmin(1.0 unit/mL)을 사용하여 용해 면 적의 상대적인 비율로 환산하였다.

ACE 활성 저해효과는 Cushman과 Cheung의 방법(24)을 변형하여 측정하였다. ACE enzyme은 rabbit lung acetone powder(Sigma-Aldrich) 1 g에 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 40 mL를 가하여 4℃에서 하루 동안 교반한 것을 10,000 rpm에서 4℃, 30분간 원심분리한 후 상등액을 microtube에 1 mL씩 분주하여 -20℃에 보관하면서 사용하였다. ACE 측정은 0.3 M NaCl-0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)로 녹인 12.5 mM HHL(Hip-Hip-Leu, Sigma-Aldrich) 기질 100 μL에 시료 10 μL를 첨가하고 sodium borate buffer 45 μL를 가한 후 37℃에서 5분간 반응시켰다. 5분간 반응 후 ACE enzyme 150 μL를 가하고 다시 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.5 N HCl 250 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 반응용액에 ethyl acetate 1.5 mL를 넣고 1분간 혼합한 후 상온에서 2,800 rpm, 10분간 원심분리 하여 상등액 1 mL를 취한 후 drying oven에서 140℃로 20분간 완전히 열풍건조하고 1 M NaCl 3 mL를 가하여 용해시킨 후 228 nm에서 흡광도를 측정하는 통상법과 ACE enzyme 과 sample을 먼저 반응시킨 후 기질을 나중에 첨가하는 방법으로 측정하였다.

$\text{ACE 저해율(\%) = }\frac{\text{Ec-Es}}{\text{Ec-Eb}}\text{ × 100}$

실험동물은 8주령(280 g)의 Sparague-dawley 계 암컷 흰 쥐를 이용하였고 남부대학교 동물실험윤리위원회의 승인 (승인번호: 201703)을 받은 후 실험을 실시하였다. 실험동 물은 specific pathogen-free 환경에서 사육된 Sprague-dawley 종 암컷 흰쥐 35마리를 (주)오리엔트바이오(Seongnam, Korea)로부터 구입하여 사용하였고, 환경에 적응시키기 위 해 실험 시작 전 1주일간 예비 사육하였다(25). 대조군 (control group), 고지방 대조군(high fat control group), 고지 방식이와 죽력 0.01% 투여군 및 고지방식이와 죽력 0.05% 투여군으로 총 4군으로 나누어 실험 하였다. 예비 사육한 실험동물을 난괴법(randomized complete block design)에 의 해 각 군당 8마리씩 분배하고 8주간 사육하였다. 실험동물 사육실의 조건은 온도 18-24℃, 습도 50-60%가 유지되도록 하였다. 식이의 구성성분은 AIN-76 식이조성을 기본으로 하고, 고지방 식이는 라아드를 통해 지방 함량을 총 열량의 40% 수준으로 증가시켰으며, 고지방 식이에 죽력 0.01% 투여군 및 고지방식이와 죽력 0.05% 투여했으며, 식이와 물은 자유 급식하였다. 가루 형태로 조제한 식이는 4℃에 냉장 보관하면서 매일 새로운 식이를 공급하였고, 체중은 일주일에 한번씩 측정하였다. 식이 섭취량은 매일 일정한 시각에 측정하였다.

혈액은 실험동물을 해부 전 24시간 절식 시킨 후 ether 마취하에서 개복한 후 대동맥에서 채취하였고, 혈청 중의 지질 농도는 실온에서 한 시간 방치 후 3,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 분석에 사용하였다. 혈청의 총 지질 (total lipid)의 함량은 혈청 20 μL에 phosphovanillin 시약을 첨가한 후 37℃에서 15분간 배양한 후 시료 무첨가구를 대조로 하여 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 콜레스테롤(total cholesterol) 함량은 총 콜레스테롤 측정용 kit시약(AM 202-k, Asan, Hwaseong, Korea)을 사용하였으 며, 중성지방(triglyceride) 함량은 중성지방 측정용 kit시약 (AM 157S-k, Asan), HDL-C(high density lipoprotein cholesterol) 함량의 측정은 HDL-C 측정용 kit시약(AM 203-k, Asan)으로 각각 측정하였으며, 혈중 함량은 표준검 량선에 의해 산출하였다.

혈류는 Micro Channel Array Flow Analyzer KH-6 (MC-FAN; MC Laboratory Inc., Tokyo, Japan)을 이용하여 채취한 혈액 100 μL를 주입하여 측정 하였다.

Ether 마취 후 개복하여 대동맥으로부터 채혈한 혈액에 3.2% sodium citrate용액과 1:9의 비율로 혼합한 뒤 1,100 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층의 platelet rich plasma(PRP)를 취하고, 3,000 rpm에서 10분간 더 원심분리 하여 상층에 혈장을 제거한 후 EDTA를 포함하는 washed buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5) 5 mL를 가하고 섞어주어 혈소판을 재현탁시켰다. 이 혈소판 을 다시 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후, 세척액을 버리고 혈소판을 위의 방법으로 한번 더 세척하였다. 세척 후 suspending buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose, 0.49 mM MgCl₂, 0.25% gelatin, pH 7.4)로 재현탁시켜 3,000 rpm, 10 분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer로 현탁시켜 washed platelet을 조제하였다. Washed platelet는 suspending buffer로 희석하여 혈소판 수가 5×10⁸/mL이 되도록 하였고, 응집유도제로 collagen을 2.5 μL를 가하여 5분간 반응시켜, Whole blood lumi-aggregometer(Model 560, Chronolog Corporation, Haverton, PA, USA) 를 사용하여 37℃에서 혈 소판 응집을 측정하였다.

실험결과는 3회 반복하여 평균±표준오차(mean±SD) 로 나타냈으며, SPSS(version 21, IBM Corp., New York, NY, USA) 통계프로그램으로 Student's t-test를 이용하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정하였고, one-way ANOVA 를 실시한 후 p<0.05의 유의수준에서 Duncan's multiple range test에 의하여 각 실험군의 평균치 간의 유의성을 검증 하였다.

Fibrin plate상에서 plasmin에 대한 각 시료의 투명환의 상대적 넓이를 비교하여 혈전용해활성을 측정하였다 (Table 1, Fig. 2). 청국장(대조군), 미정제 죽력(BCL I), 정제 죽력(BCL II)그리고 plasmin을 시료로 동일량의 단백질에 대한 활성을 비교한 결과 청국장추출물에서 2.56 unit이였 고, 미정제죽력에서 4.71 unit, 정제죽력에서 4.32 unit를 나 타내어 농도의 차이가 있지만 모두가 plasmin 1.0 unit 보다 유의하게 높은 활성을 보였고, 그 중 미정제 죽력이 가장 높은 활성을 나타내었다. Fig. 2B의 경우 죽력은 간접 탄화 과정을 거치면서 추출되는 용액으로 추출 완료후 이들의 pH가 3.0-4.3 에 이르러 혈전용해능이 용액산성화에 의한 효과인지를 확인하고자 pH를 NaOH 0.1 N용액으로 조정하 여 재측정하였더니 원액의 측정결과와 차이점을 발견하지 못하였다. 본 결과에서 미정제 죽력이 가장 우수한 혈전용 해능을 보였으나 미정제 죽력은 식품의약처에 따르면 식품 으로 허가된 주류에 한하여 식품첨가물로 허가되어 있고 일반식품으로는 불허하고 있다. 이는 미정제죽력에서 메탄올, 타르, 벤조피렌 등 일급발암물질이 함유하고 있어 식품으로 허가를 불허하고 있다(26). 본 연구에서는 정제과 정에서 일부성분의 유출로 활성이 떨어지지만 혈전용해 활성이 정제죽력에서도 유지되는 것을 확인하였다.

Fig. 2. Fibrinolytic activity of extracts from original samples(A) and (B) original samples of pH-adjusted to 5.0 by NaOH solution. 1, distilled water; 2, soybean Chungkukjang; 3, BCL I; 4, BCL II; 5, plasmin.

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청국장, 죽력원액(bamboo juice), 미정제 죽력 및 정제죽 력의 ACE 활성 저해 효과를 확인한 결과는 Table 2에 제시 한 바와 같이 나타났는데 죽력원액, 미정제죽력과 정제죽 력(BCL I, II)에서 각각 70.25, 69.01, 68.23%의 높은 억제효 과를 보였다. 대조군으로 사용된 청국장에서는 26.56%로 나타나 죽력에서 숙성과정이나 정제과정에서의 차이 없이 통계적으로 유의한 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다.

Angiotensin Ⅱ는 동맥혈관을 수축하여 혈압을 상승시키 고 부신에서 aldosterone 의 분비를 촉진하여 Na 및 수분의 재흡수를 촉진시킴으로 고혈압의 원인중 하나로 작용하고 있다(27). 이러한 angiotensin Ⅱ는 angiotensinogen이 renin 에 의해 분해된 angiotensin Ⅰ이 ACE에 의해 변환된 것이다 (23). 따라서 특히 청국장, 미정제 죽력을 비교하였을 때 ACE 활성 저해 효과를 보여 특히 동맥경화증, 혈전증 및 고혈압 예방 등의 혈관 관련성 질환 개선에 도움을 줄 것으로 기대되며, 기능성 식품 및 식재료로 사용하기 위하 여 유효성분 추적 등의 더욱 구체적인 연구가 필요한 것으 로 생각된다.

혈행개선과 관련한 세포수준에서 가능성을 확인하고 동 물수준에서 혈행개선 효과를 확인하고자 동물실험을 실시 하였다. Table 3는 고지방식이를 한 흰쥐에 정제죽력의 함 량을 달리한 식이의 조정을 표시하였고, Table 4에서는 정 제죽력의 함량을 달리하여 동물에 투여 후 혈청 중 triglyceride와 total-cholesterol 및 HDL-cholesterol의 농도 변화를 나타내었다. 8주간의 죽력정제물의 투여를 달리한 동물실험에서 투여 후 실험동물의 몸무게 변화나 먹이섭취 율이 모든 그룹에서 차이가 나타나지는 않았다(data not shown). 고지방식이군은 일반식이군(271.1 mg/dL) 에 비해 triglyceride의 함량은 314.4 mg/dL로 증가하였고, 고지방식 이+죽력 0.01%군은 301.5 mg/dL로 나타났으며, 고지방식 이+죽력 0.05%군은 289.2 mg/dL로 유의하게 중성지질이 감소되었다.

또한, 고지방식이군은 일반식이군(283.2 mg/dL)에 비해 total-cholesterol 함량은 327.2 mg/dL로 증가하였으며, 고지 방식이+죽력 0.01%군은 311.9 mg/dL로 나타났으며, 고지 방식이+죽력 0.05%군은 293.7 mg/dL으로 유의하게 totalcholesterol이 감소되는 경향을 보였다. HDL-cholesterol은 일 반식이군이 206.0 mg/dL로 가장 높은 값을 나타내었으며, 고지방식이+죽력 0.01%군 196.6 mg/dL, 고지방식이+죽력 0.05%군 189.2 mg/dL, 고지방식이군 162.2 mg/dL순으로 나타났고, 죽력첨가군 0.01%군과 0.05%군 간의 유의성은 없었다.

혈행 개선에는 혈액을 구성하는 혈장 및 혈구세포(혈소 판) 가 주로 관여하며, 이들은 혈류의 항상성을 유지시키며 혈관의 손상된 부위나 염증 부위에서 정상적인 지혈과 보호 작용을 유지함으로써 인체의 정상적인 기능을 유지한다 (14,15).

혈류의 흐름에 미치는 죽력의 영향을 검토해보기 위해 정상식이군, 고지방식이군과 고지방식이+죽력 0.01%군, 고지방식이+죽력 0.05%군의 혈액을 각각 채취하여 헤파린 처리 후, 시각적이고 정량적으로 혈액의 유동성을 인식하 여 혈액의 속도를 측정할 수 있는 micro channel array flow analyzer(MCFAN)를 이용하여 일정한 압력으로 혈액이 모 세관을 25, 50, 75, 100 μL 통과하는 시간을 측정하였다 (Table 5). 실험결과 정상식이군이 고지방식이군에 비해 빠 른 시간에 모세관을 통과하였다. 또한 고지방식이+죽력 0.05%군이 고지방식이군과 고지방식이+죽력 0.01%군보 다 모두 유의하게 빠르게 모세관을 통과하여 빠른 혈액 유동성을 나타내었다. 이상의 결과에서 고지방식이로 인한 지질대사의 영향으로 혈류의 모세혈관 통과속도가 다소 늦어졌으나 일정량의 죽력 추출물 투여에 의해 혈류의 속도 가 빨라짐을 볼 수 있어 혈류흐름을 개선하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 대나무 추출물인 죽력에서 주요물질에 대 한 연구는 대나무에서 유도되어진 lignocresol이 caspase-3 활동의 억제된 신경암세포에서 과산화수소에 대항하여 세 포사멸 억제효과를 보였다고 소개하고 있으며, 죽력 성분 중 2-methxoy-p-cresol이 그와 같은 효과를 보이는 것으로 생각되어지며, 이는 lignophenol이 높은 페놀성 기능을 나타 내며 in vitro 상에서 항산화 효과를 나타내는 p-cresol 유도 체이기 때문이라는 조사가 있었다(28).

죽력의 혈소판 응집 억제 효과를 검토해보기 위하여 washed platelet을 분리하고 collagen 2 μg으로 혈소판 응집 을 유도하였다. 죽력 추출물의 항혈소판 응집에 미치는 영 향을 검토한 결과(Table 6), 고지방식이군의 경우 대조군인 일반식이군에 비해 혈소판 응집이 증가한 반면 고지방식이 +죽력 0.01%군과 고지방식이+죽력 0.05%군은 고지방식이 군에 비해 혈소판응집이 억제되는 것으로 나타났다. Amplitude(%)는 혈소판 응집율을 나타낸 것으로 수치가 작을수록 시료의 항혈소판 응집효과가 큰 것을 의미한다. Amplitude(%)의 경우, 고지방식이군은 일반식이군과 비교 하였을 때 121.27로 증가하였으나 고지방식이+죽력 0.01% 군, 고지방식이+죽력 0.05%군은 응집율이 각각 102.44%와 101.26%로 유의하게 감소하는 경향이 나타났다.

Slop(Ω/min)은 혈소판 응집에 대한 기울기로 ohm 수치가 클수록 collagen 응집제로 인해 혈소판의 응집이 급격하게 이루어진 것을 의미하는데 고지방식이군은 일반식이군 (139.40 Ω/min)과 비교하였을 때 151.38 Ω/min으로 증가하 였으나 고지방식이+죽력 0.01%군, 고지방식이+죽력 0.05% 군에서 역시 149.46 Ω/min와 140.14 Ω/min으로 유의하게 감소하는 경향이 나타났다. Lag time(sec)은 혈소판 응집이 일어나는 반응시간으로 반응시간이 짧을수록 collagen 응 집제로 인해 혈소판의 응집이 급격하게 이루어진 것을 의미 한다. 고지방식이군은 일반식이군(36.56 sec)과 비교하여 24.27 sec로 감소한 것에 반해 고지방식이+죽력 0.01%군, 고지방식이+죽력 0.05%군은 고지방식이군에 비하여 응집 시간이 28.62 sec와 30.12 sec로 증가하여 응집이 지연되는 결과를 나타내었다.