저온 적응성 효모의 보존방법에 따른 균체의 생존율 및 발효특성

본 실험에서 사용한 균주는 선행 연구에서 선발된 효모 로 한국농업미생물유전자원센터(KACC)에 등록한 것으로 15℃에서 생육정도가 높은 Saccharomyces cerevisiae Y297 (KACC93244P, SCY297)를 사용하였다(13). 실험에 사용된 효모는 yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose 2%(YPD, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 액체배지에 배양 후, 20% glycerol을 첨가하여 -80℃에서 보관하여 사용하였다. 약주 제조에 사용한 백국은 ㈜조은곡식(경기도 화성시)에서 구 입하였고, 멥쌀은 2014년 9월 경기도 철원에서 재배된 오대 미를 사용하였다. 정제효소는 ㈜충무발효에서 구입하여 약 주제조에 사용하였다.

쌀 당화액은 멥쌀을 세척하고 약 2시간 동안 물에 침지한 후, 1시간 물 빼기를 하였다. 멥쌀을 1시간 동안 증자한 후에 냉각하였다. 멥쌀 6 kg을 기준으로 5 L의 플라스틱 통에 각각 고두밥 3 kg과 입국(Koji, Joeungoksik Co., Ltd, Hwaseong, Korea) 540 g 넣은 후, 물 4.5 L 첨가하여 잘 혼합하여, 40℃에서 3일간 발효한 후, 쌀 당화액으로 사용하 였다(Fig. 1). 쌀 당화액은 고압증기멸균기를 이용하여 12 1℃에서 15분간 멸균하였다.

Fig. 1. Schematic processing of rice saccharified medium.

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시험구로써 합성배지인 YPD(Con), 합성배지에 2% 효모 추출물(YPD+YE), 합성배지에 2% 펩톤(YPD+P), 합성배지 에 2% 덱스트로오스(YPD+D), 쌀 당화액(SM), 쌀 당화액에 2% 효모 추출물과 2% 펩톤을 각각 첨가한 액(SM+YE+P) 10 mL에 전배양액 SCY297 효모를 0.1% 접종하여 30℃에 서 24시간 진탕배양한 후, 생균수를 측정하였다.

쌀 당화액 배지(750 mL)에 SCY 297의 접종량은 전배양 액 30 mL으로 접종하였으며, 진탕배양기(WisdⓇWIS-20R, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea)로 25℃에서 48시 간 동안 120 rpm으로 배양하였다. 배양 후, 12,000 rpm, 7 min 조건에서 원심분리(VS-24SMTi, VISION SCIENTIFIC Co., Ltd., Hwaseong, Korea)를 하였다. 액체 제형은 효모 배양 농축액량을 300 mL로 하였으며, 각각의 부형제(α -lactose, trehalose, skim milk) 5%를 혼합 한 후, falcon tube에 40 mL씩 담아 25℃에 저장하였다.

동결건조 제형은 각각의 액체 제형(무처리, 5% 알파 락 토오스, 5% 트레할로오스, 5% 스킴 밀크)을 specimen cup(SPL life Science Co., Ltd., Pocheon, Korea) 용기에 90 mL씩 넣은 후, 초저온냉동고(ilShinⓇ DF8517, IlShinBioBase Co., Ltd., Yangju, Korea)에 24시간 보관하였다. 특히, specimen cup의 위 표면을 호일로 포장하여 공기가 통과할 수 있도록 하고 시료를 넣어 8일 동안 동결건조(-75℃)를 하였다. 동결건조 후, 시료는 25℃에 저장하였다.

송풍건조 제형은 각각의 액체 제형(무처리, 5% 알파 락 토오스, 5% 트레할로오스, 5% 스킴 밀크)을 specimen cup 용기에 40 mL씩 넣은 후, 용기의 위 표면을 랩핑 한 다음, 공기가 통할 수 있도록 구멍을 만들었다. 중력대류식 방법 으로 온도를 40℃에서 2일간 건조한 후에 25℃에 저장하였 다.

효모 균체의 생존율을 측정하기 위해, 건조 전 배양액 1.0 mL를 적절한 배수로 희석하여 YPD 고체배지에 100 μL를 분주하여 도말한 후, 30℃에서 48시간 배양하여, 형성 된 콜로니를 계수하여 colony forming unit을 대수함수(log CFU/mL)로 나타내어 초기 균수로 정하였다. 액체 및 건조 균체 또한 위와 같은 방법으로 균수를 측정하여 다음과 같은 방정식으로 각각의 생존율을 측정하였다(14).

$\text{생존율(\%) = }\frac{\text{액체 및 건조된 균수}\left({\text{N}}_{\text{t}}\right)}{\text{초기 균수}\left({\text{N}}_{\text{0}}\right)}\text{×100}$

멥쌀 1 kg을 씻어 2시간 동안 물에 담근 다음, 물 빼기와 증자를 각각 1시간 한 후, 냉각하였다. 2 L 용기에 고두밥과 입국 180 g, 정제효소(Choongmoo Fermentation Co., Ltd., Ulju, Korea) 1 g, 담금수 1.5 L를 넣은 후, 각각의 건조 효모(동결, 송풍 및 액체)를 쌀 당화액에 전배양하여 중량의 1%를 접종하여 20℃에서 14일간 발효하였다. 제조된 밑술 은 원심분리 후, 분석용 시료로 사용하였다.

pH는 시료 10 mL를 취하여 pH meter(FE20, Mettler Toledo, Switzerland)로 측정하였으며, 적정산도는 시료 5 mL에 1% 페놀프탈레인 지시약을 2-3방울 떨어뜨린 후, pH가 8.3이 될 때까지 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 acetic acid(%)로 환산하였다. 고형분 함량은 당도계 (ATAGO Pocket PAL-1, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용 하여 측정하였다. 아미노산도는 시료 10 mL에 1% 페놀프 탈레인 지시약 2-3방울을 가하고 0.1 N NaOH 용액으로 중화한 후 중성포르말린 용액 5 mL를 넣고 0.1 N NaOH 용액으로 담홍색이 될 때까지 적정하여 측정하였다(15). 알코올 함량은 시료 100 mL를 취하여 증류수 100 mL를 가한 후, 가열 증류를 통하여 80 mL의 증류액을 얻었다. 이를 증류수로 100 mL 정용한 다음, 비중계로 알코올 도수 (%)와 온도를 측정하고 국세청 보정표를 이용하여 환산하 였다(16).

실험 결과의 통계처리는 평균(mean)과 표준편차(SD)로 표시하였고 SPSS 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석을 사용하여 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test(DMRT)로 평 균 간 다중비교를 하였다.

본 연구에 사용한 저온 적응성 효모 SCY 297을 상업용 종균으로 만들기 위해서는 짧은 시간에 균수를 높이는 것이 중요하다. 미생물 배양에 널리 사용되는 합성배지(YPD)를 기준으로 쌀을 당화한 당화액, 그리고 일부 영양원을 첨가 하였을 때 효모 개체수가 증가하는 정도를 Table 1에 나타 내었다. 합성배지의 경우 5.59 log CFU/mL, 쌀 당화액은 5.86 log CFU/mL으로 쌀 당화액에서 효모 개체수가 높게 나타난 것을 알 수 있었다. 합성배지에 미생물 생육 영양원 인 효모 추출물, 펩톤, 덱스트린을 각각 2% 첨가하였을 때, 효모의 생육은 5.89, 5.97 및 6.04 log CFU/mL로 증가하 였다. 쌀 당화액에 효모 추출물, 펩톤을 첨가하여 배양한 결과, 6.14 log CFU/mL로 대조구인 합성배지보다 10%, 쌀 당화액보다 2% 높게 나타났다. 쌀 당화액이 합성배지보다 효모의 생육에 필요한 다양한 영양분을 함유한 것으로 보인 다. 특히, 쌀 당화액에 질소원을 첨가하면 효모의 생육이 더욱 촉진하는 것을 알 수 있었다. 현재, 국내에서는 쌀 당화액을 이용하여 효모를 상업적으로 배양하고 있진 않 다. 하지만 최근, 제빵에 사용되는 효모를 쌀을 이용한 발효 액제조에 사용하는 시도가 이루어지고 있다(17). 실험실 조건에서는 쌀을 이용한 발효액종이나 효모 발효액 제조가 가능하나, 산업적으로 대규모 생산하기 위해서는 원료의 경제성, 공정의 효율성 등에 대한 검토가 필요한 것으로 판단된다.

저온 적응성이 뛰어난 효모 SCY 297의 산업용 종균제로 제조하기 위하여 동결건조, 송풍건조, 액체 형태 등 다양한 제형 조건으로 25℃에서 15주간 저장에 따른 효모 생존율을 생균수로 측정하여 조사하였다. 또한 부형제 종류별(스킴 밀크, 알파 락토오스, 트레할로오스)로 각각 5%씩 첨가하여 SCY 297 효모의 생존율을 측정하였다. 동결건조 방법으로 효모를 제형화한 후, 저장 기간과 부형제 종류에 따른 생존 율 측정 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 부형제 무첨가 상태로 동결 건조한 경우, 4주 차 생균수는 5.99 log CFU/mL, 상대적 생존율은 95.6%로 높게 나타났다. 하지만 15주 차 생균수는 1.43 log CFU/mL, 상대적 생존율은 22.9%로 저장 기간이 오래될수록 효모의 생존율이 저하되었다. 부형제인 스킴 밀크를 사용하였을 때, 15주 차 생균수는 5.17 log CFU/mL, 상대적 생존율은 82.3%로 부형제 무첨가보다 약 4배의 높은 생존율을 나타내었다. 또한 알파 락토오스 및 트레할로오스 부형제 첨가시 상대적 생존율이 각각 73.9%, 79.9%로 나타 난 것으로 보아 부형제의 사용이 효모의 생존 율에 큰 영향을 미치는 것으로 확인하였다. 균주를 동결건 조 할 때, 세포벽 파괴 방지를 위해 부형제인 스킴밀크를 대부분 사용하며 이들의 농도는 5-10% 내외로 첨가한 것이 미생물 생존율 향상에 도움이 된다고 보고하였다(18). 또한 Abadias 등(9)은 부형제로 당 종류 중 갈락토오스, 락토오 스, 트레할로오스 및 라피노오스의 5-10% 농도에서 Candida sake 의 동결건조시 생존율을 높은 것으로 보고하 였다. 건조에 대한 생존율을 높이기 위해서는 균주마다 적 합한 당의 선정이 중요한 것으로 보여진다.

Fig. 2. Changes in the viable count (left panel) and survival rate (right panel) of freeze-dried formulation yeast cells stored at 25℃ for 15-week. 5% skimmed milk, α-lactose or trehalose was used as a protective agents for cold adaptive S. cerevisiae Y297, respectively. All data are expressed as the mean±SD (n=3).

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송풍건조 방법으로 효모를 제형화한 후, 저장 기간과 부 형제에 따른 효모 생존율 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 부형 제 무첨가의 경우, 4주 차 생균수는 5.97 log CFU/mL, 상대 적 생존율은 96.8%로 동결건조한 생균수와 차이가 없었다. 하지만 15주 차 생균수가 측정되지 않아 장기저장에 부적 합한 것으로 판단된다. 또한 알파 락토오스, 트레할로오스 부형제 첨가군에서도 효모가 생육되지 않아 송풍건조시 장기저장에 적합하지 않은 부형제로 판단된다. 부형제 중 스킴 밀크만이 15주 차에 생균수가 측정되어 5.11 log CFU/mL, 상대적 생존율은 82.3%로 나타났으며, 동결건조 에 의한 생존율과 유사하였다. Lee 등(18)은 S. cerevisiae D8 균주는 송풍 건조시 가장 높은 생존율에 영향 주는 부형 제로 트레할로오스(생존율 97.5%)이며, Hanseniaspora uvarum S6은 슈크로오스(생존율 92.6%)라고 보고하였다. 이는 효모 균주마다 가지는 특성의 차이와 제조조건에 따라 맞춤형 부형제가 필요한 것을 알 수 있다.

Fig. 3. Changes in the viable count (left panel) and survival rate (right panel) of air blast-dried formulation yeast cells stored at 25℃ for 15-week. 5% skimmed milk, α-lactose or trehalose was used as a protective agents for cold adaptive S. cerevisiae Y297, respectively. All data are expressed as the mean±SD (n=3).

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액체 방법으로 효모를 제형화한 후, 저장 기간과 부형제 에 따른 생존율 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 대조구로써 부형제 무첨가 액체 종균의 경우, 4주 차 생균수는 6.06 log CFU/mL, 상대적 생존율은 96.6%로 동결건조법 및 송풍건 조법에 의한 생균수와 차이가 없었다. 15주 차 생균수는 1.67 log CFU/mL, 상대적 생존율은 26.6%로 부형제 첨가 없이 효모의 장기저장은 어려운 것으로 나타났다. 하지만 부형제 를 첨가한 액체 제형의 경우, 사용한 3종류 부형제 모두 효모 의 생존율에 긍정적인 영향을 주는 것으로 나타났다. 15주 차 스킴 밀크의 상대적 생존율은 85.5%, 알파 락토오스의 상대적 생존율은 81.3%, 트레할로오스의 상대적 생존율은 84.8%로 나타나 동결건조 및 송풍건조 방법보다 저온 적응성 효모 SCY297의 제형은 액체 제형이 장기저장에 유용한 것으 로 판단된다.

Fig. 4. Changes in the viable count (left panel) and survival rate (right panel) of liquid formulation yeast cells stored at 25℃ for 15-week. 5% skimmed milk, α-lactose or trehalose was used as a protective agents for low temperature-adaptive S. cerevisiae Y297, respectively. All data are expressed as the mean±SD (n=3).

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저온 적응성 효모 SCY 297의 제형화 및 저장 기간별로 약주를 제조하여 이들의 양조적성을 평가하였다. 제형화 전의 효모 SCY 297, 저장기간 4주, 10주, 15주 차의 동결건 조 방법으로 제형화된 효모로 각각의 약주를 제조하여 품질 분석을 한 결과를 Table 2에 나타내었다. 제형화 전의 효모 와 동결건조 되어 저장기간에 따라 차이나는 것은 pH, 적정 산도, 아미노산도, 알코올 함량으로 나타났다. 대조구로써 비제형화된 효모의 pH, 적정산도, 아미노산도, 알코올 함량 은 각각 3.49, 0.53, 3.03, 19.9%인데 반해, 제형화시킨 4주 차 동결건조 효모로 빚은 약주는 각각 3.0-3.3, 0.45-0.47, 2.22-3.48, 14.07-15.03%이며, 15주 차는 각각 4.02-4.19, 1.02-1.14, 14.29-17.26, 14.83-15.43%로 나타났다. 고형분 함량을 살펴보면 제형화 전 약주와 제형화후 저장기간에 따라 제조된 약주의 고형분 함량 차이가 작은 것으로 나타 났다. 제형화 전의 효모에 비해 동결건조 후, 저장기간이 오래될수록 알코올 발효 특성에 영향을 미치는 것으로 보인 다. 특히, 아미노산도의 급격한 증가와 알코올 함량 감소 부분이 효모의 동결건조와 부형제에 의한 영향인지는 추가 적인 연구가 필요하다.

비제형화 SCY 297, 저장기간 4주, 10주 차의 송풍건조 방법으로 제형화된 효모로 약주를 제조한 결과는 Table 3과 같다. 4주 차 송풍건조 효모의 약주 pH, 적정산도, 아미노산 도, 알코올 함량은 각각 3.18-3.98, 0.64-0.69, 7.81-11.65, 14.83-16.77%이며, 10주 차는 3.95-4.16, 1.02-1.34, 14.04- 16.70, 15.37-17.17%로 나타났다. 송풍건조로 제형화된 효 모는 비제형화 효모로 제조된 약주의 고형분 함량에 비해 차이가 작게 나타나 동결건조된 효모와 유사하게 특성을 보였다.

제형화 전의 효모 SCY 297, 저장기간 4주, 15주 차의 액체 방법으로 제형화된 효모로 약주를 제조하여 품질을 분석한 결과는 Table 4에 나타내었다. 4주 차 액체 형태 효모의 약주 pH, 적정산도, 아미노산도, 알코올 함량은 각각 3.44-3.47, 0.53-0.56, 3.10-3.42, 18.5-19.6%이며, 15주 차는 4.44-5.35, 0.56-0.65, 6.07-8.13, 17.0-18.2%로 나타났다. 액체 효모의 경우, 제형화 전에 비해 알코올 함량의 변화는 동결건조 및 송풍건조 방법에 비해 낮게 나타났으나, pH와 고형분 함량이 증가한 것으로 나타났다. 동결건조, 송풍건조 및 액체 제형화 효모의 저장기간에 따라 약주를 발효하였을 때, 이들의 품질변화를 살펴본 결과, 액체 효모가 비제형화 효모에 비해 품질변화가 가장 적은 것으로 나타났다. 특히, 알코올 생산성은 동결건조 효모가 15% 내외, 송풍건조 효 모는 17% 내외, 액체 효모는 19% 정도로 비제형화 효모와 유사하였다. 이는 동결건조 및 송풍건조에 비해 액체 저장 법이 효모에 스트레스 자극이 적은 것으로 판단되며, 효모 고유의 특성을 유지하는 것으로 본 실험에서 확인하였다.

효모 제형화 방법인 동결건조, 송풍건조 및 액체 형태와 효모 부형제에 따른 종균 제형의 저장기간과 생존율 및 발효 특성 등을 분석하였다. 동결건조, 액체의 경우, 부형제 를 첨가하면 실온에서 15주까지 약 80% 이상의 생존율을 나타냈었고 송풍건조는 skim milk만이 약 80% 이상의 생존 율을 보였다. 제형화된 효모의 발효 특성은 약주를 발효하 여 그 술덧을 분석한 결과, 동결건조 및 송풍건조 효모는 대조구에 비해 적정산도, 아미노산도가 증가하였고, 알코 올 함량은 감소하였다. 반면 액체 효모는 제형화 전에 비해 pH, 고형분 함량, 아미노산도가 증가 폭이 낮았고, 알코올 함량의 감소 또한 낮게 나타났다. 이런 결과를 종합해보면, 저온 적응성 효모 SCY297의 제형화는 액상형 종균화가 하나의 대안이 될 수 있는 가능성을 제시하였다.