녹차와 로즈마리 추출물을 첨가한 두유의 항산화 활성

본 연구에서 재료로 사용한 녹차, 로즈마리. 레몬 잎, 조 릿대 잎은 제주도에서 2015년 8월중에 채취하였으며, 세척, 건조한 후 사용하였다. 두유는 (주)제주아침에서 2015년 제조한 두유를 사용하였다. Folin-Ciocalteu’s reagent, Gallic acid, Rutin, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt (ABTS)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

녹차와 로즈마리 추출물을 1%, 10% 첨가한 두유를 동결 건조한 후 80% 메탄올을 넣고 sonicator로 15분씩 3회 반복 추출하였다. 이후 여과지로 여과한 후 rotary vacuum evaporator로 50℃에서 감압 농축한 후 동결 건조하여 사용 하였다.

총 폴리페놀 함량은 Cheung 등(15)의 방법을 약간 변형하 여 증류수 1.375 mL에 125 μL의 시료를 넣은 후 0.5 mL Folin-ciocalteu’s reagent를 넣고 4분 후에 1 mL의 Na₂CO₃를 가한 다음 상온에서 30분 동안 정치하여 반응시켰다. 그 후 분광광도계(Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하 여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 함량은 gallic acid equivalents(mg GAE/g)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(16)의 방법을 변형하 여 측정하였다. 증류수 80 μL에 시료 40 μL를 넣은 후 5% NaNO2 6 μL를 첨가하여 5분간 반응시킨 후 10% AlCl3 12 μL를 혼합하여 6분간 반응시킨 다음 1 N NaOH 40 μL를 첨가한다. 그 후 증류수 42 μL를 넣고 앙금이 생기지 않도록 잘 섞어준 후 분광광도계(Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria) 를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 함량은 rutin equivalents(mg RE/g)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능 측정은 기존에 보고된 방법(17,18) 을 토대로 하여 수행하였다. DPPH 라디칼 용액은 DPPH를 200 μM로 에탄올에 용해시켜 준비하였고, 96-well plate에 시료를 농도별로 40 μL씩 분주하고 200 μM DPPH radical 용액 160 μL를 첨가한 후 30분간 37℃ incubator에서 반응시 켰다. 반응이 끝나면 분광광도계(Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양 성대조군으로는 catechin을 사용하였다.

$\text{DPPH radical scavenging activity(\%)=(1-}\frac{\text{시료의 흡광도}}{\text{대조구의 흡광도}}\text{)×100}$

추출물을 첨가한 두유의 경우 ESR spectrometer(JESFA200, JEOL, Tokyo, Japan)를 이용하여 DPPH 라디칼 소 거능을 측정하였다. 이는 기존에 보고된 방법(19)을 토대로 하여 수행하였다. DPPH 라디칼 용액은 DPPH를 60 μM로 에탄올에 용해시켜 준비하였으며, 튜브에 시료를 농도별로 30 μL씩 넣고 60 μM DPPH 라디칼 용액 30 μL를 첨가한 후 2분간 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 ESR spectrometer(JES- FA200, JEOL, Tokyo, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정조건은 magnetic field 336.000 mT, power 5 mM, sweep time 30초, sweep width 10 mT, frequency 9.43 GHz, modulation width 0.2 mT, amplitude 500, time constant 0.03초이며, 양성대조군으로는 catechin 을 사용하였다.

$\text{DPPH radical scavenging activity(\%)=(1-}\frac{\text{시료의 흡광도}}{\text{대조구의 흡광도}}\text{)×100}$

ABTS 라디칼 소거능 측정은 기존에 보고된 방법(20)을 변형하여 수행하였으며, ABTS 라디칼 용액은 7 mM ABTS 와 2.45 mM K₂S₂O₈를 혼합해 20시간 동안 암소에 보관하여 준비하였으며, 흡광도가 0.700±0.005에 도달하게 증류수로 희석하여 사용하였다. 큐벳에 900 μL ABTS radical 용액과 100 μL 시료를 혼합하여 실온에서 2분간 반응시킨 후, 분광 광도계(UV1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 α-tocopherol 을 사용하였다.

$\text{ABTS radical scavenging activity(\%)=(1-}\frac{\text{시료의 흡광도}}{\text{대조구의 흡광도}}\text{)×100}$

모든 실험은 3회 반복 수행하여 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 실험군 간의 유의성 검증 및 상관성 분석은 SPSS(Statistical package for social sciences, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) software(version 18.0)를 이용하여 실시 하였으며, 유의성 검증의 경우 ANOVA one way로 수행하 였다.

다양한 조건에서 추출한 녹차, 로즈마리, 레몬 잎, 조릿대 잎 추출물들의 폴리페놀 함량은 Fig. 1과 같다. 녹차의 경우 에는 에탄올 초음파 추출물, 증류수 가압 가열 추출물 및 증류수 상온 정치 추출물의 폴리페놀 함량이 다른 세 종류 의 식물 추출물들보다 높았으며, 특히 에탄올 초음파 추출 물의 폴리페놀 함량이 43.72±4.83 mg GAE/g으로 가장 높았 다. 로즈마리의 경우에는 로즈마리 증류수 가압 가열 추출 물의 폴리페놀 함량이 23.02±1.57 mg GAE/g으로 다른 로즈 마리 추출물과 비교하여 두드러지게 높은 폴리페놀 함량을 보였다. 레몬 잎과 조릿대 잎의 경우에는 각 추출물들의 폴리페놀 함량이 추출방법과 무관하게 약 7.00 mg GAE/g 이하로 측정되어 녹차와 로즈마리에 비해 상대적으로 낮은 폴리페놀 함량을 보였다. 식물에 함유되어 있는 페놀 화합 물은 다양한 항산화 활성과 생리활성을 가지며, 이는 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질 등 거대 분자들과 결합하는 특성이 있기 때문이라고 알려져 있다. 또한 페놀 화합물의 hydroxyl group은 유지 산패의 초기 단계에 생성 된 유리기들이 안정된 화합물을 형성할 수 있도록 산화억제 작용을 한다. 즉 페놀 함량이 높은 것은 산화 억제 작용이 높은 것을 의미한다(21). 이를 통해 레몬과 조릿대 잎보다는 녹차와 로즈마리 추출물에서 더 높은 항산화 활성을 기대할 수 있다.

Fig. 1. Effect of extraction method on the total polyphenol content of plant extracts. Each plant extract was prepared by , 80% ethanol sonication extraction; , distilled water autoclave extraction; , distilled water extraction at room temperature. GAE, gallic acid equivalent. GT, green tea; RM, rosemary; LL, lemon leaves; BL, bamboo leaves. Values are mean±SD (n=3). Means with different letters among the same plant extracts are significantly different at p<0.01.

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다양한 조건에서 추출한 녹차, 로즈마리, 레몬 잎, 조릿대 잎 추출물들의 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 녹차 추출물의 경우 에탄올 초음파 추출물, 증류 수 가압 가열 추출물, 증류수 상온 추출은 각각 9.31±1.51, 7.94±0.42, 8.86±0.50 mg RE/g의 플라보노이드 함량을 보였 다. 한편 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물의 플라보노이 드 함량은 23.01±2.12 mg RE/g으로 녹차추출물보다 약 2배 이상의 높은 플라보노이드 함량을 보였다. 레몬 잎과 조릿 대 잎의 경우에는 약 3.00 mg RE/g이하의 낮은 플라보노이 드 함량을 보였다. 플라보노이드는 페놀성 화합물의 주된 성분이며, 세포를 공격하는 유리라디칼의 산화작용을 소거 하는 작용기를 포함하고 있다. 일반적으로 총 플라보노이 드 함량은 총 폴리페놀 함량과 밀접한 상관관계가 있다고 알려져 있으나(21), 본 연구 결과에서는 총 폴리페놀 함량이 가장 높았던 녹차 에탄올 초음파 추출물의 플라보노이드 함량이 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물 보다 2배 이상 낮게 나타났다. 이는 Kim 등(22)의 연구에서 쥐오줌풀의 플라보노이드 함량은 낮고 폴리페놀 함량이 높게 나타난 결과와 유사하며, 폴리페놀이 플라보노이드계와 비플라보 노이드계로 나누어지며 녹차 에탄올 초음파 추출물의 경우 플라보노이드계보다는 비플라보노이드계 폴리페놀의 함 량이 높았기 때문이라고 사료된다. 반면 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물의 총 폴리페놀 함량은 총 플라보노이드 함량과 유사하게 나타났는데 이는 녹차 추출물과 달리 플라 보노이드계 폴리페놀의 함량이 녹차 에탄올 초음파 추출물 의 경우보다 상대적으로 높기 때문이라고 사료된다.

Fig. 2. Effect of extraction method on total flavonoid content of plant extracts. Each plant extract was prepared by , 80% ethanol sonication extraction; , distilled water autoclave extraction; , distilled water extraction at room temperature. RE, rutin equivalent. GT, green tea; RM, rosemary; LL, lemon leaves; BL, bamboo leaves. Values are mean±SD (n=3). Means with different letters among the same plant extracts are significantly different at p<0.01.

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DPPH 라디칼의 경우 보라색의 안정한 자유 라디칼로서, 항산화 활성을 가진 물질과 만나면 환원되어 노란색으로 변하는 특징을 갖는다. 여러 연구에서 DPPH 라디칼의 색 변화를 이용하여 천연물질의 항산화 활성을 평가하는 지표 로 활용하고 있다(23). 본 실험에서는 측정한 다양한 추출물 의 DPPH 라디칼 소거능은 Fig. 3에 나타낸 바와 같다. 녹차 추출물의 경우 추출방법과 상관없이 모두 높은 DPPH 라디 칼 소거능을 보였으며 그 중 에탄올 초음파 추출물에서 86.87±4.81%로 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다. 이는 Gu 등(21)이 해방풍 에탄올 초음파 추출물의 DPPH radical 소거능이 열수 추출물의 DPPH radical 소거능 보다 높다고 보고와 것과 유사한 양상이다. 로즈마리 추출물의 경우는 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물에서 50.07± 2.54%로 다른 추출방법과 비교하여 두드러지게 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다. Lee 등(24)의 연구에서 로 즈마리 열수 추출 시 추출온도가 높을수록 높은 항산화 활성을 보인다는 보고가 있었으며, 이는 본 실험 결과와 일치하였다. 한편 Lee 등(24)의 연구에서는 로즈마리 열수 추출보다 에탄올 추출이 더 높은 항산화 활성을 보였으나 Cho 등(25)의 연구에서는 로즈마리 열수 추출물이 에탄올 초음파 추출물보다 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보이고 있다. 이러한 차이는 추출용매는 동일하더라도 각 실험실 별로 추출방법의 차이에 의해 기인한 것으로 사료된다. 레 몬 잎과 조릿대 잎 추출물의 경우에는 모든 추출물에서 10%이하의 낮은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다.

Fig. 3. Effect of extraction method on DPPH radical scavenging activity of plant extracts. Each plant extract was prepared by , 80% ethanol sonication extraction; , distilled water autoclave extraction; , distilled water extraction at room temperature and used at a concentration of 200 μg/mL. , catechin 200 μM was used as a positive control. GT, green tea; RM, rosemary; LL, lemon leaves; BL, bamboo leaves. CAT, catechin. Values are mean±SD (n=3). Means with different letters among the same plant extracts are significantly different at p<0.01.

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ABTS 라디칼은 항산화 활성을 가진 물질에 의해 제거되 어 청록색이 하늘색으로 탈색되는 점을 이용한 측정방법으 로, hydrogen-donating antioxidants와 chain breaking antioxidants 모두 측정할 수 있다. 또한, aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능하다(26). 본 실험에서는 측정한 다양한 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Fig. 4에 나타낸 바와 같다. 녹차 추출물의 경우 추출방법과 상관없 이 모두 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였으며, 녹차 에탄 올 초음파 추출물이 99.95±0.24%로 가장 높은 ABTS 라디 칼 소거능을 보였다. 로즈마리 추출물의 경우는 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물에서 37.49±0.90%로 다른 추출방 법과 비교하여 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. 레몬과 조릿대 잎 추출물의 경우 추출방법과 관계없이 10%이하의 낮은 ABTS 라디칼 소거능을 보였다.

Fig. 4. Effect of extraction method on ABTS radical scavenging activity of plant extracts. Each plant extract was prepared by , 80% ethanol sonication extraction; , distilled water autoclave extraction; , distilled water extraction at room temperature and used at a concentration of 80 μg/mL. , α-tocopherol 200 μM was used as a positive control. GT, green tea; RM, rosemary; LL, lemon leaves; BL, bamboo leaves. Values are mean±SD (n=3). Means with different letters among the same plant extracts are significantly different at p<0.01.

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다양한 조건에서 추출한 녹차, 로즈마리, 레몬 잎, 조릿대 잎 추출물들의 항산화 물질과 항산화 활성간의 상관성을 비교한 결과는 Table 1과 같다. 총 폴리페놀 함량과 총 플라 보노이드 간의 상관계수 0.601(p<0.05)로 높은 상관성을 확인하였다. 또한 총 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거 능, ABTS 라디칼 소거능의 경우 각각 0.993(p<0.01), 0.992(p<0.01)로 높은 상관관계를 나타내었다. 이는 Park 등(27)의 연구에서 총 폴리페놀 함량과 DPPH, ABTS 라디 칼 소거능 간의 상관계수 0.860(p<0.01), 0.943(p<0.01)와 유사한 수치이며, Joo(28)의 연구에서 총 폴리페놀 함량과 DPPH, ABTS 라디칼 소거능의 상관계수 0.551(p<0.01), 0.489(p<0.01) 비해서는 높은 수치이다. 한편, 플라보노이 드 함량과 DPPH, ABTS 라디칼 소거능의 상관관계 각각 0.630(p<0.05), 0.517로 Ku 등(29)의 연구에서 보고한 상관 계수보다는 다소 낮게 나타났다. DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능 간의 상관계수는 0.987(p<0.01)으로 높은 상관성을 보였으며, 이는 여러 연구자들이 보고한 수 치(30)와 유사한 결과이다.

네 가지 식물 중 항산화 활성이 높은 녹차와 로즈마리 추출물을 각각 1%와 10% 첨가한 후 추출물이 첨가된 두유 의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였으며 이는 Fig. 5와 같 다. 녹차 에탄올 초음파 추출물을 제외한 나머지 모든 추출 물에서 무첨가 두유와 비교하여 높은 DPPH 라디칼 소거능 을 보였다. 그 중에서 증류수 가압 가열과 상온에서 12시간 정치한 녹차 추출물이 혼합된 두유의 DPPH 라디칼 소거능 이 다른 추출물에 비해 가장 우수하였다. 녹차 증류수 가압 가열 추출물을 10% 첨가한 두유는 85.1±2.3%, 녹차 증류수 상온 정치 추출물을 10% 첨가한 두유는 84.4±2.0%의 DPPH 라디칼 소거능을 보여 이들 두 추출물이 혼합된 두유 의 DPPH 라디칼 소거능에는 유의적 차이가 나타나지 않았 다(p<0.01). 폴리페놀 함량 및 DPPH 라디칼 소거능이 높은 녹차 에탄올 초음파 추출물을 첨가한 두유의 DPPH 라디칼 소거능은 무첨가 두유와 비교하여 오히려 낮은 소거능을 보였다. 이는 녹차 에탄올 초음파 추출물에는 녹차 증류수 가압 가온 추출물이나 상온 정치 추출물에는 존재하지 않는 녹차 성분들이 침출되었을 가능성을 시사하고 있으며, 이 러한 성분들 중 일부가 두유와 혼합 시에 혼합 두유의 항산 화 효능을 저해하는 역할을 하는 것으로 판단된다. 한편, 로즈마리 가압 가열 추출물을 10% 첨가한 두유의 DPPH 라디칼 소거능은 74.7±6.6%로 녹차 증류수 추출물에 이어 서 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보였다.

Fig. 5. DPPH radical scavenging activity of soymilk added with green tea and rosemary extracts. Each extract was added to soymilk at 1% and 10%. , NAS, non-added soymilk; , 80% ethanol sonication extract added soymilk; , distilled water autoclave extract added soymilk; , distilled water extract at room temperature added soymilk. , CAT, catechin 200 μM was used as a positive control. GT1S, green tea 1% added soymilk; GT10S, green tea 1% added soymilk; RM1S, rosemary 1% added soymilk; RM10S, rosemary 10% added soymilk. Values are mean±SD (n=3). Means with different letters among the same plant extracts are significantly different at p<0.01. *Means indicated significant difference in comparing control (NAS) at p<0.01.

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각 추출물이 첨가된 두유를 사용하여 ABTS 라디칼 소거 능을 측정하였을 때 결과는 Fig. 6과 같다. 녹차 증류수 상온 정치 추출물과 증류수 가압 가열 추출물을 10% 첨가 한 두유의 ABTS 라디칼 소거능이 가장 우수했으며 각각 81.3±4.8%, 73.4±2.8% ABTS 라디칼 소거능을 보였다. 녹 차 에탄올 초음파 추출물을 1%, 10% 첨가한 두유에서는 각각 10.2±2.6%, 27.0±3.9% 소거능을 보여 48.1± 4.2% 소거 능을 보인 무첨가 두유보다 ABTS 라디칼 소거능이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이는 DPPH 라디칼 소거능 결과와 도 유사한 것으로 녹차 에탄올 초음파 추출물을 두유에 혼합 시 ABTS 라디칼 소거능을 오히려 감소시키는 성분들 이 포함되어 있음을 시사하고 있다. 한편, 로즈마리 추출물 을 첨가한 두유의 ABTS 라디칼 소거능은 증류수 상온 정치 추출물을 1% 첨가한 두유와 증류수 가압 가열 추출물을 10% 첨가한 두유에서 무첨가 두유와 유의적 차이를 보였다 (p<0.01). 특이하게도, 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물을 10% 첨가한 두유의 DPPH 라디칼 소거능은 무첨가 두유보 다 월등하게 높았으나 로즈마리 증류수 가압 가열 추출물을 10% 첨가한 두유의 ABTS 라디칼 소거능은 무첨가 두유와 비슷한 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. 이는 ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼과 달리 극성과 비극성 라디칼 모두 와 반응한 것에 기인한 것으로 사료된다. Lee 등(31)의 연구 에서 과채류를 식품에 첨가한 후 살균처리를 할 경우 살균 처리하기 전과 후의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능의 차이 가 나타나지 않았다 보고하였으며, Choi 등(32)와 Dewant 등(33)의 연구에 따르면 열처리 과정에서 조직에 결합되어 있는 결합형 페놀화합물이 유리형 페놀화합물로 전환되어 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성이 오히려 증 가한다고 보고한 바 있다. 이러한 연구결과를 통해 두유 가공 시 로즈마리 추출물을 첨가한 후 살균을 할 경우에도 항산화 활성의 감소는 유발하지 않을 것으로 기대된다.

Fig. 6. ABTS radical scavenging activity of soymilk added with green tea and rosemary extracts. Each extract was added to soymilk at 1% and 10%. , NAS, Non-added soymilk; , 80% ethanol sonication extract added soymilk; , distilled water autoclave extract added soymilk; , distilled water extract at room temperature added soymilk. , α-tocopherol 200 μM was used as a positive control. GT1S, green tea 1% added soymilk; GT10S, green tea 1% added soymilk; RM1S, rosemary 1% added soymilk; RM10S, rosemary 10% added soymilk. Values are mean±SD (n=3). Means with different letters among the same plant extracts are significantly different at p<0.01. *Means indicated significant difference in comparing control (NAS) at p<0.01.

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본 연구에서는 제주산 녹차, 로즈마리, 레몬 잎, 조릿대 잎을 물과 에탄올을 이용해 다양한 조건에서 추출물을 제조 하여 각 추출물에 대한 항산화 활성을 측정하였으며, 이 중 항산화 활성이 높은 식물 추출물을 두유에 첨가하였을 때 나타나는 항산화 활성에 대해 확인하였다. 로즈마리 추 출물을 첨가한 두유는 항산화 활성 증가를 바탕으로 두유 품질의 고급화와 두유 제품의 다양화에 기여할 것으로 기대 된다. 향후에는 로즈마리 추출물이 첨가된 두유의 항산화 활성뿐만 아니라, 생리활성 성분 분석과 관능검사, 항암 효능에 대한 연구를 통해 로즈마리 첨가두유의 가치를 더욱 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.