열처리 방법에 따른 대두의 이화학적 특성 변화

대두는 2016년 경북 영주지방에서 재배한 백태를 동광산 업(농협-61-09-01)에서 구입하였고 불순물을 제거한 후 정 선하여 사용하였다. 생 대두와 열처리 대두 등 모든 분석용 시료는 48시간 동안 동결건조(MCFD 8518, Ilshinbiobase, Seoul, Korea)한 다음 분쇄(DA338-G, Daesung Artron Co., Ltd., Paju, Korea)하였고 40 mesh 체를 통과한 분말을 시료 로 하였다.

증자 대두(steamed soybean)는 고압 증자기(VS-1321-100, Vision Sci. Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 121℃에서 60분간 삶았다. 팽화 대두(Puffed soybean)는 생 대두 3 kg을 회전식 가열장치(puffing gun, Gumi, Korea)에 넣어 내압이 3 kgf/cm²에 도달할 때까지 직화식 가스불로 가열하고 순식 간에 압력을 제거하여 대두가 폭렬(팽화)되도록 하였다, 대두 튀김(Air-fried soybean)의 공정은 180℃로 가열된 에 어 프라이어(HD 9220, Philips Air-Fryer, Philips Electronics N.V., Amsterdam, NLD)에서 12분 동안 실행하였고 열처리 하지 않은 대두(no treatment soybean)은 대조구로 사용하였 다.

시료의 일반성분 함량은 AOAC(23) 분석법에 준거하여 수분은 105℃에서 항량이 되도록 건조하여 정량하였으며, 단백질은 micro-Kjeldahl법으로 전질소를 정량하고 질소계 수 6.25을 곱하여 조단백질로 하였다. 지방은 soxhlet법을 이용하였고 회분은 650℃에서 회화시켜 정량하였다.

열처리 방법에 따른 대두 단백질의 패턴 변화를 보기 위하여 Laemmli(24)의 방법에 따라 SDS-PAGE를 실시하였 다. 각 샘플 2 g 분말에 10 mL n-Hexane을 넣고 실온에서 1시간 동안 교반한 후 원심분리를 통하여 지방이 녹아 있는 상등액을 제거한 다음 남아 있는 침전물에 10 mL n-Hexane 을 넣고 실온에서 1시간 교반을 통하여 지방 성분을 제거하 였다. 지방을 제거한 침전물은 후드 내에서 n-Hexane을 휘 발시켜 건조하였다. n-Hexane을 제거한 대두 분말에 10배 의 30 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)을 가하고 회전식 진탕 기(SK-71 Shaker, Jeio Tech, Kimpo, Korea)로 실온에서 9시 간 동안 단백성분을 추출하였다. 이 용액을 4℃에서 원심 분리(12,000 ×g, 30분, KUBOTA 6200, Kubota Co., Ltd., Tokyo, Japan)한 후 상층액을 사용 전까지 -20℃에 보관하였 다. 추출된 단백질은 Pierce TM BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)로 정량하였고, 표준물질로 BSA(Bovine Serum Albumin, Thermo Scientific) 을 사용하였다. Gel은 4-20% gel(GenScript USA Inc., Piscataway, NJ, USA)을 이용하였고, 각 시료는 5배 농도의 sample buffer(1 M Tris-HCl, pH 6.8, 50% glycerol, 10% SDS, 2-mercaptoethanol, 1% bromphenol blue)와 최종 단백 질 농도 3 μg/mL로 맞추어 로딩, 분리하였다. 전기영동은 130 볼트에서 90분간 시행하였으며 전기영동 후, gel은 Coomassie Blue staining solution(AE-1340 Ezstain Aqua, Atto Co., Tokyo, Japan)으로 염색하고 탈색한 후 단백질의 분포를 비교분석 하였다.

Morr 등(25)의 방법에 따라 대두 분말 0.1 g을 증류수 10 mL에 분산시켜 1 N HCl과 NaOH 용액으로 pH 2-12로 조정하고 원심분리(12,000 ×g, 30분, KUBOTA 6200, Kubota Co.)한 후 상등액을 취하여 BCA(Pierce BCA protein Assay Kit, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 방법에 따라 단백질을 정량하여 용해도를 구하였다.

수분과 유지 흡착력은 Beuehat(26)의 방법을 이용하여 측정하였다. 각 시료 분말 0.5 g을 증류수 10 mL 또는 대두 유 10 mL에 분산시켜 혼합한 다음 원심분리(12,000 ×g, 60분, KUBOTA 6200, Kubota Co.) 하였다. 수분과 유지 흡착력은 유리된 물과 대두유의 부피를 측정하여 시료 분말 1 g당 흡착된 물과 대두유의 부피(mL)로 나타내었다.

DSC는 시차주사열량기(DSC-Q-100, Dupont Co., Omaha, NE, USA)를 이용하여 30℃에서 250℃까지 분당 5℃의 속도 로 승온하였다(27). 대두 분말 시료 10 mg을 DSC 전용의 알루미늄 용기에 넣고 밀봉하였으며 빈 알루미늄 용기를 대조구로 하였다. 얻어진 흡열곡선은 자체 프로그램 (Universal analysis 2000, TA instruments, New Castle, DE)으 로 개시온도(Onset), 정점온도(Peak), 엔탈피(ΔH)를 분석하 였고 6회 반복 실험으로 평균값을 구하였다.

산화 지질과 단백질의 상호작용을 통해 생성되는 형광 물질을 이용한 형광분석법이 식품의 산화 변패 평가에 보고 되었다(28). 대두 분말의 가열방법에 따른 산패도를 측정하 기 위하여 Uhm과 Yoon(29)의 방법으로 Fluorescence intensity를 측정하였다. 대두 분말 시료 0.5 g을 넣은 15 mL 시험관에 넣고 10 mL CM 용액(chloroform:methanol, 2:1, v/v)을 가하여 혼합한 후 10분 동안 반응시켰다. 반응액 은 실린지 필터로 여과한 다음 여과액 6 mL와 증류수 2 mL를 가하여 다시 혼합하고 원심분리(10,000 ×g, 30분, KUBOTA 6200, Kubota Co.)하였다. 시료 상층액 300 uL를 형광 분석용 플레이트(black 96 well assay plate, CostarⓇ, NY, USA)에 넣어 fluorescence spectrometer(Gen5, Biotek Instrument INC., VT, USA)를 이용하여 emission 400-500 nm, excitation 360 nm, slit 8.0 mm, 측정간격 600 ms의 조건에서 fluorescence intensity를 측정하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복하여 평균값과 표준편차를 계산하였고, 각 시료 사이의 통계적 유의성 검정은 SAS 프로그램(v7.1, SAS Institute, INC., Cary, NC, USA)을 이용 하여 분산분석 후 최소유의차 검정(p<0.05, p<0.01)을 실시 하였다.

가열처리에 의한 대두의 일반성분 분석 결과는 Table 1과 같다. 열처리 하지 않은 대두의 수분함량은 6.7%이었고 증자 대두의 수분함량이 17.82%으로 가장 많았고 튀긴 대 두가 2.05%로 가장 적었다(p<0.01). 조지방 함량은 15.36- 19.06%의 범위에 있었으며 증자 대두의 조지방 함량이 가 장 적었으나 가열방법에 따른 통계적 유의성은 없었다 (p<0.05). 가열하지 않은 대두의 조단백질 함량은 33.90%, 조회분 함량은 5.40%로 나타났고, 이들 성분은 가열에 의해 증가하는 경향을 보였다. 튀긴 대두의 조단백질 함량이 35.78%로 가장 많았고, 팽화 대두(35.28%), 증자 대두 (33.16%)의 순으로 적었다(p<0.05). 조회분 함량도 튀긴 대 두가 5.70%로 가장 많았고 증자 대두가 4.48%로 가장 적었 다(p<0.01). 본 실험에서 사용한 대두의 일반성분은 기왕의 보고(30)와 크게 다르지 않은 결과이지만, 습식가열 처리된 증자 대두의 경우 수분함량이 건식 열처리 된 팽화 대두보 다 2.7배, 그리고 튀긴 대두보다는 8.7배 높기 때문에 증자 대두의 일반성분의 낮은 함량에 영향을 미친 것으로 생각된 다.

처리 방법을 달리한 대두의 단백질 분자량 변화를 살펴 보고자 SDS-PAGE를 실시하였다(Fig. 1), 대두 단백질은 7s fraction과 11s fraction으로 구성되어 있다(31). 열처리 하지 않은 대두의 단백질 분자량 분포는 70-75, 56-58, 38-47, 29-34, 20-27, 15-17 kDa이었고 큰 것부터 차례대로 β의 conglycinin(α-72.4 kDa, β-50.2 kDa), unknown, glycinin 의 acidic polypeptide(36.7 kDa), basic 7S globulin(HMWS, 32.2 kDa), unknown, glycinin의 basic polypeptide(21.7 kDa), basic 7S globulin(LMWS, 18.2 kDa)의 분포를 보였으며 Yoon과 Jeon(18)의 보고와 유사하였다. 증자하거나 가열팽 화 또는 튀김과정을 거친 대두는 열처리에 의하여 SDS-PAGE상의 단백질의 농도를 나타내는 밴드의 굵기가 감소하고 저분자로 분해되는 형태의 분자량 분포를 나타냈 는데 증자 대두와 튀긴 대두에서 뚜렷했다. 동일한 농도를 적용한 SDS-PAGE에서 단백질 분획이 소실되는 것은 낮은 분자량으로 인하여 아크릴아미드 겔을 통과한 때문이다. Han 등(32)은 100℃ 열처리에서 소혈청알부민 밴드가 대부 분 소실되었다고 보고한 바 있다. 또한 Seol 등(20)은 열처리 한 대두는 열처리하지 않은 대두에 비하여 SDS-PAGE상의 단백질 농도가 낮고 단백질 밴드가 약해지는데 단백질이 amino acid와 peptide로 분해된 결과라고 본 연구와 동일한 경향을 보고하였다.

Fig. 1. SDS-PAGE analysis for freeze-dried soybean powders with pre-treatments. M, molecular weight marker; NT, no treatment soybean; S, steamed soybean; P, puffed soybean; AF, air-fried soybean.

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대두 단백질은 음료 등 식품 시스템에 포함될 때 안정적 으로 분산되어야 하며 겔화, 유화 및 거품 발생과도 관련이 있다(33). 열처리에 따른 대두에 함유된 단백질의 용해도 변화는 Fig. 2와 같다. 열처리 하지 않은 대두의 용해도는 등전점(pH 4.5 내외)에서 가장 낮고 산성과 알칼리 영역에 서는 증가하는 용해도 곡선을 보였다. 반면 대두를 열처리 한 경우 단백질의 용해도는 열처리 하지 않은 대두와 차이 를 나타냈는데 산성(pH 3-6)에서는 용해도가 증가한 반면 알칼리 영역(pH 7-10)에서는 낮은 단백질 용해도를 보였다. 단백질의 이온강도가 증가하면 용해도는 향상되는데 Phillips와 Beuchat(34)은 펩타이드 사슬의 분자량 감소와 NH₃+ 와 COO- 같은 단백질의 극성 이온기가 증가하는 결과라고 하였다. 알칼리성 영역에서 단백질 용해도의 감 소와 관련하여 Mirsky와 Pauling(35)은 단백질 분자는 알칼 리성 조건에서 일부 수소결합이 끊어져 원래의 배열보다 열린 형태를 취하게 되며 많은 펩타이드 그룹과 측쇄가 노출되게 되는 공간배열의 변화가 일어난다고 하였다. Kang(36)은 pH 6 이상에서 단백질 분해효소를 처리한 경우 분자적 공간 배열의 변화로 용해도가 감소한다고 본 실험과 같은 경향을 보고하였다.

Fig. 2. Protein solubility of isolated soy protein different treatment methods at various pH. ●, no treatment; ○, steamed soybean; ▲, puffed soybean; △, air-fried soybean.

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열처리에 따른 대두 분말의 수분과 유지 흡착력을 비교 한 결과는 Table 2과 같다. 열처리 하지 않은 대두의 수분흡 착력이 2.38 mL/g 이었던 것에 비하여 열처리에 의해 대두 의 수분흡착력은 증가하였고 튀긴 대두 분말이 2.82 mL/g 로 가장 높은 수분 흡착력을 보였다. Yoon과 Jeon(21)은 중탕 처리시간이 길어지면 대두의 수분 흡착력도 증가한다 고 본 실험과 일치된 결과를 보고하였다. Cha(22)는 옴 가열 (Ohmic heating)처리에 의한 대두 단백질의 수분 흡착력과 속도는 모두 증가하며 단백질의 열 변성에 기인한다고 하였 다. 수분 흡착력과 달리 유지 흡착력은 습식가열 처리된 증자대두에서 감소효과가 나타났다. 가열하지 않은 대두의 유지흡착력은 2.12 mL/g 이었고 건식가열 처리의 경우 전 반적인 감소 경향을 보였으며 증자 처리된 대두의 유지흡착 력은 유의적으로 낮았다(p<0.05). Yoon과 Jeon(18)은 가열 처리 시간에 따라 대두의 유지흡착력은 유의적으로 감소한 다고 본 연구와 같은 경향을 보고하였다.

시차주사열량기로 분석한 대두의 열 특성은 Table 3과 같다. 대두의 DSC thermogram은 전형적인 흡열 반응이었 으며 열처리에 의한 정점온도(Tmax)와 엔탈피(ΔH)의 변화 를 보였다. 가열처리 하지 않은 대두의 정점온도는 91.07℃ 이었으며 엔탈피는 199.62 J/g로 나타났다. 반면 가열처리 한 대두의 정점온도는 84.25-85.37℃ 범위로 나타났고 열처 리 하지 않은 대두 보다 낮았다(p<0.01). 엔탈피도 열처리에 의하여 전반적으로 감소하여 123.07-135.90 J/g 범위를 나 타냈고 튀긴 대두의 엔탈피가 가장 적었다. Arnfield와 Murray(37)는 단백질의 변성이 엔탈피의 감소에 관여한다 고 보고한 바 있고 SDS-PAGE(Fig. 1)는 대두 단백질의 변성 을 잘 나타낸다. Sorgentini 등(38)과 Renkema 등(39)도 대두 단백질의 열 변성정도에 따라 엔탈피 값이 감소하는 유사한 결과를 보고한 바 있다.

대두는 단백질 다음으로 불포화지방산 같은 지방 함량이 많은데(40), 고도 불포화 지방산의 산화는 산패로 이어져 식품의 품질을 저하시키는 원인이다. 형광분광법에 의한 열처리 대두의 산패도를 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. Fluorescence intensity는 360 nm로 excitation 시켜 400-500 nm 사이에서 emission spectrum을 얻었으며 열처리에 따른 차이를 보였다. Fluorescence intensity는 440-450 nm 파장영 역에서 최고값을 보였는데 열처리하지 않은 대두가 가장 낮은 fluorescence emission을 나타냈다. 열처리 대두의 경우 fluorescence emission의 증가를 나타냈고 팽화, 중자, 튀김 의 순으로 fluorescence emission이 유의하게 높았다 (p<0.0001). 지질이 산화되면서 생성된 알데히드류는 단백 질과 malonaldehyde 반응을 통하여 형광화합물을 생성 (41,42)하는데 열처리 대두의 산패된 정도에 따라 자외선으 로 조사시켜 얻어진 형광의 강도로 나타난다. 또한 fluorescence intensity는 산패도와 비례하는데 팽화, 중자, 튀김의 순으로 산패도가 높으며 대두 단백질의 분자량 분포 (Fig. 1)에서 보여주는 분해정도와 같은 경향이다. Uhm과 Yoon(29)은 대두 분말의 저장기간이 경과할수록 fluorescence intensity가 증가한다고 본 연구와 같은 결과를 보고하였고, Estevez 등(43)은 형광분광법에 의해 고기 근섬유 단백질에 서 산화정도를 측정한 바 있다.

Fig. 3. Fluorescence spectra (excitation=360 nm) in organic phase of chloroform/methanol extractions (***p<0.0001). ●, no treatment; ○, steamed soybean; ▲, puffed soybean; △, air-fried soybean.

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