두릅 추출물의 기능성 원료 표준화를 위한 HPLC 분석법 검증

본 실험에 사용한 두릅은 2016년 6월 제주도에서 자생하 는 두릅나무의 순을 채취하여 제주대학교 생물학과 김문홍 교수가 동정하여 확인된 것을 사용하였다. 채취한 두릅을 잘 건조하고 분쇄한 후 시료 중량의 10배량의 70% 발효 에탄올(Samchun, Pyeongtaek, Korea) 용매를 첨가한 후 5 0℃에서 약 12시간씩 2회 가열 추출하였다. 추출 후 여과 및 농축하여 동결 건조하여 사용하였다.

분석에 사용한 HE표준품은 두릅나무의 순으로부터 분 리 정제하고 Varian Unity Inova 400FT NMR(California, USA)을 이용하여 구조를 확인한 순도 99.0%(HPLC)를 사 용하였다. HPLC 분석 및 시료 조제에 사용한 용매 및 이동 상은 모두 HPLC급으로 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)사 의 제품을 사용하였다. 또한 PDA 측정을 위해 Agilent 1260 Infinity II system(Santa Clara, USA)의 검출기는 Agilent 1260 DAD WR(G7115A)을 사용하였고 모든 분석 조건은 동일하게 사용하였다.

표준품(HE) 20.0 mg을 사용 전 검교정이 완료된 미세저 울로 정확하게 칭량하여 10 mL volumetric flask에 넣고 HPLC 등급의 methanol을 넣어 녹여 정확하게 10 mL 표선 을 맞춰 2,000 μg/mL농도의 stock solution을 조제하였다. 조제된 stock solution은 4℃에 보관하여 사용 전에 희석하여 사용하였다.

추출 후 여과 및 농축하여 동결 건조한 뒤 얻어진 두릅 추출물 1.0 g을 정확히 취하여 100 mL volumetric flask에 넣고 HPLC 등급의 methanol을 가하여 표선을 맞추어 시험 용액으로 하였다. 시험용액은 사용 전 0.45 μm syringe filter 로 여과하여 검액으로 사용하였다.

HPLC 분석법 검증을 위하여 식품의약품안전처의 “의약 품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(17,18)을 근거로 특이성(specificity), 직선성 및 범위(linearity and range), 정 확성(accuracy), 반복성(repeatability), 실험실내 정밀성 (intermediate precision) 및 완건성(robustness)을 조사하였 고, 직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 표준편차 를 통해 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)를 조사하였으 며 이를 이용하여 두릅추출물 중 기능성 지표성분인 HE의 함량을 분석하였다.

특이성이란 불순물, 분해 생성물, 첨가물 등이 혼재되어 있는 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정 할 수 있는 능력을 의미하며, 시료에서 분석대상물질을 선 택적으로 측정할 수 있는 정도를 나타내는 특이성의 검증을 위하여 표준용액과 시험용액을 HPLC로 분석한 뒤 크로마 토그램을 비교하여 표준물질의 peak가 분리되는지를 확인 하였고 peak간 간섭 정도를 측정하였다. 분석에 필요한 blank(MeOH), 표준용액(HE, 1.0 mg/mL), 시험용액(두릅추 출물, 1.0 g/100 mL MeOH), 검액(HE 2.0 mg/mL 농도의 표준원액+시험용액)을 조제한 뒤 0.45 μm 실린지 필터로 여과하여 분석에 사용하였으며, 조제된 blank, 표준용액, 시험용액 및 검액을 각각 1회 분석하고 이 때 HE 주피크에 간섭이 없음을 확인하였고, 표준액과 시험용액 및 검액의 주피크 유지시간이 동일함을 확인하였다. HE 표준용액과 두릅 추출물을 HPLC로 분석한 뒤 크로마토그램상의 retention time과 비교하여 HE 피크가 분리되는지 확인하였 다. 또한 photo diode array(PDA) spectrum을 측정하여 동일 한 spectrum을 나타내는지도 확인하였다.

시험방법이 일정한 범위 내에 있는 검체 중 분석대상물 질의 양 또는 농도에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 의미하는 직선성을 검증하기 위해 7개 농도 의 검체를 3반복하여 분석 후 얻은 값의 피크 면적비와 농도비의 관계를 알 수 있는 회귀분석을 통하여 표준 검량 선을 얻었다. HE 표준품을 methanol에 용해시켜 분석에 필요한 각각 다른 농도 범위로 0.03125 mg/mL, 0.0625 mg/mL, 0.125 mg/mL, 0.250 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 2.0 mg/mL를 만든 후 HPLC에 주입하고 각 농도별 표준액 을 각 3회씩 주입하여 HE 주입농도와 피크면적간의 결정계 수, 기울기, y 절편을 구하였다.

측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준값에 근접한 정 도로서 실측치가 참값에 얼마나 가까운 가를 의미하는 정확 성을 검증하기 위해 HE 표준용액(2.0 mg/mL)에 methanol을 가하여 최종농도가 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 1.5 mg/mL가 되도록 검액을 조제하고 각각 3회씩 분석하였다. 직선성 시험에서 얻은 검량선을 이용하여 각 검액의 실측 농도 값을 구하였고, 실제 첨가된 이론 농도값에 대한 회수율(%) 을 구하여 기준에 적합한지 확인하였다.

동일 실험자가 동일한 장치와 기구, 동일한 시료, 동일한 조작 조건하에서 균일한 검체로부터 얻은 복수의 검체를 짧은 시간차로 반복분석 실험하여 얻은 측정값들 사이의 근접성(분산정도)을 의미하는 반복성 실험과 실험실내에 서 실험일, 시험자, 기구, 기기 등을 바꿔 측정값 간의 정밀 성을 검증하기 위해 표준용액과 같은 농도로 조제한 시료를 분석하여 검량선을 작성한 다음, 시험용액에 HE 표준원액 을 spiking하여 최종 농도 1.0 mg/mL로 조제한 검액을 분석 하며 전 조작을 6회 반복 시험하여 반복성(repeatability)과 실험실내 정밀성(intermediate precision)을 확인하였다. 시 험을 통해 6회 측정한 농도 값들 간의 평균, 표준편차, 상대 표준편차(relative standard deviation, RSD %)를 구하였다.

시험방법 중 일부 조건이 소규모라도 의도적으로 변경되 었을 때 측정값이 얼마나 영향을 받는지에 대한 척도로써 표준화된 시험방법에서 시험조건을 변동할 수 있도록 설정 해 놓은 범위보다 더 넓은 범위를 의도적으로 변동시켜서 검토하였다. 본 실험에서는 시험용액의 안정성 인자의 검 증을 위하여 특이성 시험에서 조제한 검액을 상온에서 autosampler에 보관하면서 10시간 후, 20시간 후, 24시간 후에 각각 3회씩 재분석하여 HE 피크면적의 상대표준편차 (RSD)를 구하여 일상적으로 수행하는 시험방법의 타당성 이 유지되고 있음을 검증하였다.

직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 표준편차를 통해 검출한계 및 정량한계를 구하였으며, 지표성분 HE의 검출한계(limit of detection, LOD)는 시료에 포함되는 지표 성분의 검출이 가능한 최소량 또는 최저 농도, 정량한계 (limit of quantification, LOQ)는 시료에 포함되어 있는 지표 성분의 정량이 가능한 최소량 또는 최저 농도로서 LOD와 LOQ는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 산출하였다.

$\begin{array}{c}\text{LOD=3.3×standard deviation of the response/slope of the}\\ \text{calibration curve}\\ \text{LOQ=10×standard deviation of the response/slope of the}\\ \text{calibration curve}\end{array}$

제주산 건조 두릅추출물에 함유된 기능성 지표성분인 HE의 함량을 분석하기 위해 1.0 g/100 mL 농도의 시료를 3회 반복 분석하였으며 표준용액의 크로마토그램의 피크 면적을 통하여 작성된 검량선에 의해 두릅추출물 시료 중 함유된 HE의 함량을 산출하였다.

두릅나무 순 추출물의 지표성분인 HE(Fig. 1)에 대한 분 석을 실시하기 위해 column, 이동상의 종류 및 UV검출 파 장을 최적화하여 분석을 진행하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다.

표준용액과 조제된 두릅추출물 시험용액의 크로마토그 램을 비교하여 함유된 표준물질의 피크가 분리되는지를 확인한 결과, 다른 물질과 간섭 없이 단일한 피크로 분리되 었으며 표준용액의 피크유지시간과 시험용액의 피크 유지 시간 또한 일치하였다(Fig. 2). 또한 표준용액과 시험용액의 PDA spectrum을 측정한 결과에서도 190-240 nm에서 동일 한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다.

Fig. 2. The HPLC chromatograms of HE (1.0 mg/mL) (A) standard and (B) Aralia elata extract (1.0 g/100 mL).

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각 농도별로 단계적으로 조제한 표준용액을 HPLC로 분 석하여 피크 면적비에 대한 농도비의 관계를 표시하는 표준 검량선을 작성하였다. 측정한 0.03125-2.0 mg/mL의 농도범 위에서 3회 분석하여 작성한 검량선의 결정계수(R2)는 0.9999이상의 높은 직선성을 보였다(Fig. 3).

Fig. 3. Calibration curve of HE.

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지표성분을 농도별로 시험용액을 조제하여 각 3회씩 분 석한 결과, Table 2에 나타난 바와 같이 표준물질의 회수율 은 0.5 mg/mL의 농도에서는 98.8±0.865, 1.0 mg/mL의 농도 에서는 104.7±2.536 그리고 1.5 mg/mL에서는 101.8±1.674 의 범위의 높은 회수율을 보였으며, 분석오차 0.013%를 나타내었다.

반복성(repeatability)과 실험실내 정밀성(intermediate precision)으로 시험하였으며 정밀도(RSD)를 측정한 결과 는 Table 3과 같다. 반복성 시험에서는 1.0 mg/mL의 농도로 조제한 시험용액을 6회 반복하여 분석한 측정값이 평균 101.5±0.4%, RSD 0.4%를 나타내었고, 실험실내 정밀성의 1차 시험에서 1.0 mg/mL의 농도로 조제한 시험용액의 측정 값이 평균 107.2±0.2%, 2차 시험에서의 측정값은 107.2± 0.1%를 나타남으로써 1차 시험과 2차 시험간의 RSD는 0.2%로 적합함을 확인하였다.

개발된 분석법이 정량분석에 가능한 재현성을 가지고 있다는 것을 증명하기 위해 특이성 시험에서 조제한 검액을 상온에서 autosampler에 보관하면서 0시간, 10시간, 20시간, 24시간 동안 시험용액의 안정성을 평가한 결과는 Table 4와 같다. 0시간, 10시간, 20시간, 24시간 후 각 시료를 3회 반복하여 측정한 RSD는 각각 0.3, 0.1, 0.2, 0.2%로 나타났으 며 판정기준 2.0%이하인 것을 확인하였고 이러한 결과는 개발된 분석법이 일상의 정량분석에 적용 가능한 재현성을 가지고 있다는 것으로 확인되었다.

직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기와 표준편차(y 절편)를 통해 검출한계를 구한 결과, 검출한계는 12.0 μ g/mL, 정량한계는 36.5 μg/mL 수준으로 나타났다. 이는 두 릅추출물 시료에 적용할 경우, 두릅추출물은 기능성분 HE 의 함량이 약 4% 수준을 함유하고 있으므로 두릅추출물에 서의 검출한계 및 정량한계는 각각 30 mg/100 mL 및 91 mg/mL로 확인되었다.

제주산 건조 두릅을 70% 발효에탄올로 추출, 농축하여 제조한 시료 중에 함유된 HE의 함량을 분석하였다. 두릅추 출물 시료 1.0 g을 정밀하게 취하여 메탄올에 녹여 100 mL 조제한 용액을 3회 반복하여 분석하였을 때, 두릅추출 물 중에는 4.88±0.01%(RSD 0.41%)의 HE가 함유되어 있음 을 확인하였다.

이상의 분석결과, 본 연구의 기기분석법과 유효성검증을 통해 두릅순의 지표물질인 triterpenoid saponin 계열의 성분 을 정량분석하는데 있어 추가적인 기기의 설비 없이도 일반 적인 검출기인 HPLC/UV법을 적용하여 간편하게 HE를 정 량할 수 있는 분석방법을 개발하여 그 타당성을 검증하였 다. 따라서 이러한 결과를 토대로 건강기능식품 기능성 원 료로서 두릅나무 순 추출물의 지표성분인 HE의 분석이 가능함을 확인하였다.