전통 발효 식품에서 분리한 유산균을 이용한 yogurt 발효특성

균주의 분리원은 대구 경북지역에서 수집한 김치, 식혜, 막걸리, 물김치 등 전통 발효식품을 사용하였으며, 각 샘플 을 직접 또는 적정 희석하여 0.02% sodium azide가 포함된 MRS Agar(Difco Co. Detroit, MI, USA)에 도말하고, 37℃에 서 24시간 배양 후 나타난 특징적인 colony를 취하여 순수 분리한 50균주를 10% 탈지분유에 접종하여 37℃에서 48-72시간동안 배양한 후 응고현상을 보인 16균주를 선발 하였다. 선발 균주는 MRS 사면배지에 접종하여 24시간 배양한 후 4℃에 보관하면서 사용하였다.

선발된 균주에 대한 항균활성은 Listeria monocytogenus ATCC19115, Staphylococcus aureus ATCC2937, Bacillus cereus ATCC14581, Escherichia coli ATCC11775, Salmonella entritidis KCTC12400, Vibrio vulnificus ATCC 17802에 대 해 paper disc method로 생육 억제환 생성 유무를 비교 측정 하였다.

Kobayashi 등(14)의 방법을 변형하여 내산성이 강한 균주 를 선발하기 위하여 1 N HCl을 사용하여 pH 1.5로 조정한 nutrient broth(Difco Co., Detroit, MI, USA)에 pepsin 1%를 첨가한 인공 위액을 사용하였다. 선발 균주를 상기 인공위 액에 접종하여 37℃에서 3시간 배양 후 1 mL을 취하여 0.1% pepton 용액으로 적정 희석하여 MRS agar(Difco Co.) 에 접종, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 colony수를 계측 하였다. 분리균주의 인공담즙 액에 대한 내성은 Lee 등(15) 의 방법으로 MRS broth에 pancreatin(Kanto Chemical, Tokyo, Japan) 1%를 첨가한 후 pH 8.3으로 조정하여 멸균시 킨 후, 멸균된 10% Oxgall(Difco Co.) 용액 1%를 첨가한 배지를 사용하였으며, 인공위액에서 3시간 배양 후 원심분 리하여 상등액을 제거한 균체에 인공담즙 액을 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다.

분리 유산균 중 항균활성, 내산성과 내담즙성이 있는 균 주를 선발하여 24시간 배양한 배양액을 각각 고형분 함량 10% 멸균 환원탈지유에 3%(v/v) 접종하여 4일간 배양하면 서 1일 간격으로 pH, 산도, 생균수를 측정비교 하였다.

최종 선별된 균주를 Gram 염색, catalase test, API 50 CHL kit(BioMerieux Co., Marcy L’Etoile, France)간이 동정한 후 Zhang 등(16)의 27F(5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3') 와 1429R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사 용하여 RNA를 증폭 후 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 (Solgent Co., Daejeon, Korea) 확인하였다.

내산성, 내담즙성, 항균활성, 환원탈지유에서 성장능 등 이 우수한 2균주를 선발, 단독 및 혼합 starter로 10% 멸균 환원탈지유에 각각 3%(v/v) 접종한 후 4일간 배양하였으며, 대조구로 발효가 비교적 완만하게 진행되는 요구르트 제조 에 starter로 사용되는 Lactobacillus casei(CHR, Hansens Lab., Horsholm, Denmark)를 사용하였다.

발효 중 24시간 간격으로 각 시료 10 mL를 취하여 pH는 pH meter(Corning, pH meter 445, Medifield, MA, USA)로, 적정산도는 동일량의 시료에 0.1 N NaOH(Factor=1.001)를 pH가 8.3이 될 때까지 적정한 NaOH 용액의 소비량을 젖산 으로 환산하였다.

발효 중 24시간 간격으로 시료 1 mL를 무균적으로 취한 후 0.1% pepton수로 적정 희석한 후 MRS agar(Difco.)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 colony수를 mL 당 colony forming unit(CFU)로 나타내었다.

점도는 발효가 완료된 요구르트 시료 10 g을 각각 취하여 Brookfield viscometer(LVDV-Ⅱ, brookfield Engineering Lab Inc., Middleboro, MA, USA)의 18번 spindle을 사용, 1.5 rpm에서 5분경과 후 1분 간격으로 6회 측정하여 평균값 으로 나타내었다.

Folin-Denis 법(17)에 따라 발효가 완료된 시료 1 mL에 0.2 N Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시 킨 후, 7.5% Na₂CO₃ 1 mL을 가하여 암소에서 1시간 동안 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 한 표준곡선에 의하여 산출 하였다.

Blois의 방법(18)을 변형하여 발효가 완료된 요구르트와 95% ethanol를 1:1로 비율로 혼합, 24시간 추출한 후 4℃, 3,500 rpm에서 10분간 원심분리(Supra 21k, Hanil science industrial Co., Ltd., Incheon, Korea)한 후 얻은 상등액을 여과지(Whatman No. 2, Maidstone, England)로 여과시켜 사용하였다. 시료 0.4 mL에 0.4 mM DPPH 에탄올 용액 0.8 mL를 가하여 진탕 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후, 525 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 계산식, DPPH radical scavenging activity(%)=100-[(OD of sample/OD of control)×100]에 의하여 활성을 산출하였다.

10% 멸균 환원탈지유에 분리균주를 단독 및 혼합 접종하 여 48시간 배양한 후 4℃에 10일간 저장하면서 저장 중 pH, 산도, 생균수의 변화를 비교하였다.

모든 실험은 3회 반복으로 행하였으며, 유의성 검증은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package(version 19.0)를 이용, p<0.05수준으로 Duncan's multiple range test에 의하여 검증 하였다.

분리한 50균주의 유산균중 커드형성 능력이 있는 16균주 를 선발하여 그람 양성균인 L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus와 그람 음성균인E. coli, S. entritidis, V. vulnificusicus 에 대한 항균활성을 측정한 결과(Table 1) KM32 균주가 가장 우수한 항균활성을 나타내었다. 공시 균주 중 항균 spectrum이 비교적 넓은 9균주를 선발하여 다음 실험에 사 용하였다.

구강을 통해 섭취되는 probiotics는 강산성의 위산과 담즙 산에서 살아남아 췌장과 십이지장을 통과하여 최종 목적 부위인 장에 도달하여야 정장의 효과를 발휘하게 된다(19). 항균활성이 우수한 9균주의 인공위액과 인공 담즙액에서 내성은 양호하였으며(Table 2), KM32는 본 실험에 사용한 pH를 1.5로 조정한 인공 위액에서 log reduction이 1.14를 나타내었고, 인공 담즙액에서는 생균수가 증가하는 경향 (log reduction, -0.78)을 나타내어 소화기관을 통과하는 동 안 우수한 생존율을 나타낼 수 있을 것으로 판단되었다. 내산성이 매우 강하고 담즙액에 대한 내성이 우수한 KM2, KM24, KM32 그리고 KM 72 균주를 선발하여 환원탈지유 에서 배양특성을 비교하였다.

요구르트 starter로 이용 가능성을 검증하기 위하여 KM2, KM24, KM32와 KM72균주의 환원 탈지유에서 배양 중 생 균수, pH, 산도의 변화를 Table 3에 나타내었다. KM24 균주 가 가장 높은 생균수를 나타내어 배양 4일 동안 10⁹ CFU/mL 을 유지하였다. pH의 변화는 KM24 균주의 경우 배양 초기 부터 감소하여 배양 2일째 pH 4.60으로 낮아져 배양 3일 이후 4.10 이하를 나타내었다. 산도의 변화도 pH와 유사한 경향을 나타내었으며 KM24의 경우 배양 2일째 0.87%, 배 양 3일 이후 1.04%를 유지하였다. 요구르트내 유산균수는 10⁷-10⁸ CFU/mL 이상(20), pH는 4.1-4.2(21), 적성산도의 범위는 0.95-1.20%로 제시한 Rasic과 Kurmann(5) 등의 결과 와 비교하면 공시균주는 환원탈지유에서 성장은 양호하나 완만하게 산을 생성하여 요구르트 제조를 위해 배양기간이 2일 이상 필요한 것으로 판단되었다. KM24(구균) 균주만 단독으로 요구르트 제조용 starter로 사용이 가능할 것으로 사료되었으나, 내산성과 담즙액 내성 그리고 환원탈지유에 서의 양호한 성장을 나타낸 KM32(간균)가 KM24와 발효 중 구균인 S, thermophilus 와 간균인 L. bulgaricus와 같은 상호작용이 가능할 것으로 판단되어 두 균주를 선발하여 단독 및 혼합배양 효과를 검토하였다.

선발된 2 균주를 16S rRNA 염기서열 분석을 이용하여 동정 결과(Table 4), KM24는 gram positive, cocci, catalase negative였으며, Pediococcus pentosaceus로 동정되었다. KM32는 gram positive, rod, catalase negative로Lactobacillus plantarum로 동정되었다.

비교적 산 생성이 완만한 요구르트 starter로 사용되는 Lactobacillus casei(대조구), 분리균주인 P. pentosaseus KM32와 L. plantarum KM24 균주를 단독(단독접종구) 및 혼합접종(혼합 접종구)하여 요구르트 제조 중 발효특성을 비교하였다(Table 5). 유산균수는 모든 처리구에서 배양 24 시간째 10⁸ CFU/mL이상 이었으며 배양 72시간까지 동일한 수준을 유지하였다. 혼합 접종구에서 배양 48시간과 배양 72시간째 각각 9.66 log CFU/mL과 9.58 log CFU/mL을 나타 내어 대조구보다 양호하였다. 이 결과는 김치에서 분리한 L. plantarum을 환원탈지유에서 24시간 배양 후 10⁸ CFU/mL 이었다는 Jeong 등(22)의 결과 보다 양호하였다. 분리 균주를 복합으로 사용할 경우 비교적 유산균을 많이 함유하는 요구르트 제조가 가능할 것으로 판단되었다. pH 변화는 배양 48시간째 대조구(3.77), KM24 단독 접종구와 혼합 접종구에서 각각 4.31과 4.25이었다. 산도의 변화는 pH 변화와 유사하여 배양 48시간 후 KM32(0.68%), KM24 (0.85%), 혼합 접종구(0.83%), 대조구(0.99%)이었으며, KM32 단독 접종구를 제외하고 각 처리구 공히 배양 72시간 후 0.88-1.24%의 범위를 나타내었다. 혼합 접종구는 대조구 에 비해 산생성은 완만하였으나 유산균수는 많았다. 이러 한 결과를 김치에서 선발한 유산균을 이용한 요구르트 제조 중 배양 24시간 이후 pH는 4.3이었다는 결과(23)와 탈지유 로 제조한 요구르트의 pH 범위는 4.01-4.27, 산도는 0.82-1.15%(24), mild 요구르트와 acid 요구르트의 적정산도 범위는 각각 0.85- 0.95%와 0.951-1.20%(5)라는 결과와 비 교해 볼 때 KM32와 KM24혼합균주는 mild요구르트 제조 에 적합하다고 판단되며, 산 생성이 완만하여 배양시간이 48시간 이상 필요할 것으로 사료되었다.

요구르트의 항산화 활성과 점도의 비교는 Table 6에서 보는 바와 같이 KM24 단독 접종구가 총 폴리페놀함량 (41.56 μg/mL)이 가장 높았으며, DPPH 라디칼 소거능도 KM24 접종구가 가장 높은 52.54%로 혼합 접종구(48.57%) 와 대조구(48.22%)에 비해 항산화 활성이 가장 우수하였다.

요구르트 제조용 starter YC-380을 이용한 요구르트의 DPPH 라디칼 소거능이 24.5% 였다는 보고(24)와 비교할 때 혼합 접종구의 항산화활성은 비교적 양호한 것으로 판단 된다. 요구르트의 점도는 소비자의 기호성에 영향을 미치 는 주요 요인으로 KM24 접종구의 점도(675 cp)가 가장 높았으며, 혼합 접종한 경우 465 cp로 감소하였다. 요구르 트의 점도는 요구르트 혼합액의 총 고형분 함량과 단백질 가수분해정도, starter의 산과 slime 생성능력에 의해 영향을 받는다(5). 요구르트의 지방함량이 감소할수록 강도가 약 한 겔을 형성하게 되어 물성학적 특성이나 조직특성, 맛, 풍미 등에 바람직하지 못한 영향을 미치게 된다(25). 공시 요구르트의 낮은 점도는 본 연구에 사용한 환원탈지유의 지방 및 고형분 함량(10%)과 KM32의 낮은 산생성 능력 (Table 5)에 기인된 것으로 판단된다.

요구르트를 4℃에서 10일간 저장 중 유산균수, pH, 산도 의 변화는 Table 7에서 보는 바와 같다. 혼합 접종구의 경우 전 저장 기간 동안 가장 높은 유산균수를 유지하였으며, 저장 10일째 9.28 log CFU/mL이었다. pH는 모든 처리구에 서 저장기간 동안 저장 초기와 유사하였으나, KM32 접종구 는 점차 증가하여 저장 초기 pH 4.54에서 저장 10일째 5.17 로 증가하였다. 이는 저장 중 KM32 균주의 단백질 분해능 에 의한 단백질 분해현상에 기인된 것으로 사료된다.

산도의 변화는 저장 5일까지는 다소 증가하다가 그 이후 감소하였다. 혼합 접종구는 대조구에 비해 유산균수는 높 고, 산생성 능력이 낮아 pH는 높고, 산도는 낮은 경향을 나타내었다. 유산균의 probiotics 효과를 기대할 수 있는 요구르트의 유산균수는 섭취 전 10⁸-10⁹ CFU/g이어야 하며, 적어도 10⁶-10⁷ CFU/g 장에 도달하여야 한다(26). 혼합 접종 구는 배양 및 저장기간 동안 10⁹ CFU/mL을 유지하여 섭취 시 probiotics 효과가 있을 것으로 판단된다.

이상의결과로미루어보아김치에서분리한P. pentosaceus (KM24)와L. plantarum(KM32)는 내산성이 강하고 probiotics 기능이 있으며 발효 및 저장중 높은 수준의 생균수를 유지 하므로 요구르트 제조 시 단독 사용보다는 복합 starter로 사용이 가능할 것으로 판단된다. 상업적으로 활용할 경우 당과 고형분 첨가 등 산 생성을 촉진시키는 방안과 발효온 도 등 적정 발효조건 구명과 품질 개선 등에 관한 광범위한 연구가 선행되어야 할 것으로 사료된다.