함초의 건조방법에 따른 항산화 및 항혈전 활성의 변화

본 실험에 사용된 함초는 전남 신안군 함초 재배농가에 서 2015년 9월 및 2016년 10월에 수확한 함초를 구입하여 사용하였다. 동결건조의 경우, 이물질을 제거한 함초를 3 cm 정도로 세절하고 이를 -40℃ 초저온 냉장고에서 예비동 결한 후, 동결건조기(일신바이오베이스 PVTFD-100R, Dongducheon, Korea)에 넣어 건조하였으며, -40℃에서 시 작하여 15℃/200분씩 온도를 증가시켜 운전하고 최종적으 로는 25℃에서 80시간 건조하였다. 열풍건조의 경우, 이물 질을 제거한 상기 세절 함초를 60℃의 열풍건조기에 넣고 2일간 항량 건조하였으며, 음건의 경우 세절 함초를 25℃의 실온에서 7일간 항량 건조하였다. 각각의 건조 함초는 50-100 mesh로 분쇄하여 추출에 사용하였으며, 95% ethanol(Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd., Cheongju, Korea)을 시료 무게의 10배 되도록 가하여 상온에서 3회 추출하였다. 이후 추출액은 filter paper(Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)하여 분말로 조제하였다. 이후 분말시료들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, 성분 분 석, in vitro 항산화 활성, 항혈전 활성 및 적혈구 용혈 활성 평가에 사용하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시 판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd., Tianjin, China)를 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MD Pacific Hemostasis(MD Pacific Technology Co.)의 분석시약 을 사용하여 측정하였다(30). 기타 사용한 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 구입하 여 사용하였다. 실험에 사용한 함초 시료는 안동대학교 식 품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2015- SEFD).

다양한 건조법으로 조제된 함초의 에탄올 추출물의 항산 화 활성은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) anion scavenging activity(DSA), 2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonate)(ABTS) cation scavenging activity(ASA), nitrite scavenging activity(NSA) 및 환원력 측정으로 평가하였다 (31). 활성 평가는 기존의 방법(30)과 동일하게 사용하였으 며, 대조구로는 vitamin C(Sigma Co.)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각 각 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 표시하였다.

혈전 생성과정중의 혈액응고는 다양한 coagulation factors, prothrombin, thrombin의 순차적 cascade 응고반응 에 의해 진행되므로, 함초의 혈액응고저해 활성은 thrombin time(TT), prothrombin time(PT) 및 activated partial thromboplastin time(aPTT) 을 측정하여 평가하였다(31). TT 는 37℃에서 0.5 U thrombin(Sigma Co.) 50 μL와 20 mM CaCl₂ 50 μL, 다양한 농도의 시료 10 μL를 Amelung coagulometer KC-1A(Amelung. Lemgo, Germany)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 μL를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조 군으로는 아스피린(Sigma Co.)을, 그리고 용매 대조군으로 는 DMSO를 사용하였다. Thrombin 저해 활성은 3회 이상 반복한 시료 TT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 TT 평균치의 비로 나타내었다(32). 한편 PT 측정은 혈장 70 μL와 다양한 농도의 시료 10 μL를 coagulometer 의 튜브 에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130 μL의 PT reagent 를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, prothrombin 저해 활성은 3회 이상 반복한 시료 PT 실험의 평균치를 DMSO의 PT 평균치의 비로 나타내었다(32). aPTT 측정의 경우에는, 표 준혈장 70 μL와 다양한 농도의 시료 10 μL를 coagulometer 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 65 μL의 aPTT reagent를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 반응하였다. 이후 65 μL CaCl₂(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, aPTT 연장 활성은 3회 이상 반복한 시료 aPTT 실험의 평균치를 DMSO의 aPTT 평균치의 비로 나타내었다(32).

혈소판 응집은 혈전 생성의 최초반응이면서 1차 지혈 플러그를 생성하여 혈전 생성을 가속화시키는 중요한 반응 이다. 혈소판 응집저해 정도는 혈소판이 미세전극에 부착, 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 Whole Blood Aggregometer(Chrono-log, PA, USA)를 사용하여 측 정하는 impedance 법으로 평가하였다(33). 먼저 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma, PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 5×10⁸ cells/mL이 되도록 조정하여 사 용하였으며, 응집유도제로 collagen(1 mg/mL)을 사용하였 다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under 를 측정하여 평가하였다(30,31) 시료의 혈소판 응집 저해 활성은 시료 대신 DMSO를 첨가 한 대조구와의 상대적인 area under값의 비로 나타내었다.

다양한 건조법으로 조제된 함초의 에탄올 추출물의 안전 성 평가의 일환으로 인간 적혈구(4%)를 이용하여 용혈 활 성을 평가하였다. PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μL를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μL를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응 액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μL를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다(31). 시료의 용매 대조 구로는 DMSO(2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 triton X-100 및 amphotericin B를 사용하였 다. 용혈활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

$\text{Hemolytic activity(\%)=(}\frac{\text{Abs. S-Abs. C}}{\text{Abs. T-Abs. C}}\text{)×100}$

Total flavonoid(TF) 및 total polyphenol(TP) 함량 측정은 기존의 보고된 방법(34)에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다(31). 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다(35). 각각의 분석결과는 3회 반복 한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.

실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean±SD 로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사 하였다. 유의수준은 p<0.05로 하였다.

동결건조, 열풍건조 및 음건하여 제조된 함초 시료의 최 종 수분함량은 각각 5.7%, 7.2%, 및 9.35%를 나타내었다. 동결건조 시료는 건조 후 색상을 유지한 반면 열풍건조 및 음건 시료는 함초의 푸른색이 감소되고 부분적인 갈변이 나타났다. 동결건조, 열풍건조 및 음건 시료의 ethanol 추출 효율은 각각 14.4, 13.2, 11.9%를 나타내어 동결건조시 수율 이 음건에 비해 1.2배 높았다(Table 1). 각각의 건조시료의 ethanol 추출물의 TP 함량 분석결과, 열풍건조 시료에서 가장 높은 4.6 mg/g을 보였으며, 음건에서 가장 낮은 3.2 mg/g 함량을 나타내었다. 반면 TF 함량은 4.2-4.4 mg/g을 나타내어 유의적인 변화를 나타내지 않았다. 이는 기존의 더덕(1), 산사과(7), 포도씨(8) 등의 동결건조시 열풍건조보 다 높은 폴리페놀 함량을 나타낸다는 기존의 보고와 동일한 경향이었다. 한편 총당 분석결과 동결건조 시료에서 23.4 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, 열풍건조 시료에서 20.5 mg/g 및 음건시료에서 12.5 mg/g을 나타내어 함초의 열풍 건조 및 음건시에 총당의 감소가 나타남을 알 수 있었다. 환원당 분석결과, 열풍건조 시료에서 14.6 mg/g의 가장 높 은 값을 나타내어, 동결건조시료의 6.5 mg/g, 음건시료의 4.4 mg/g에 비해 2.2-3.3배 높게 나타났다. 이러한 결과는 함초의 폴리페놀 및 총당 함량은 열풍건조 및 음건시에 유의적으로 감소되며, 환원당 함량은 열풍건조시에 증가되 나, 음건시에는 유의적으로 감소됨을 의미하고 있다.

다양한 함초 건조시료의 항산화 활성 평가를 위해 DPPH, ABTS 및 nitrite 소거능 및 환원력을 평가하였다. 그 결과 0.5 mg/mL 농도에서 동결건조 시료는 2.8%, 21.7%, 0.041의 DSA, ASA 및 환원력을 나타내었으며, 0.2 mg/mL 농도에서 41.1%의 NSA를 나타내어, 양이온 소거능과 nitrite 소거능 이 우수하였다. 반면, 열풍건조 시료는 상기 농도에서 DSA 는 인정되지 않았으며, 21.3%의 ASA, 42.9%의 NSA 및 0.079의 환원력을 나타내어 동결건조와 유사한 라디컬 소 거능을 나타내었다(Table 2). 반면 음건한 경우 ASA는 28.1%로 다소 증가하였으나, NSA 활성은 오히려 17.2%로 감소하였으며, 환원력도 나타나지 않았다.

한편 함초 건조시료들의 다양한 농도에서의 항산화능 평가 결과를 바탕으로 RC₅₀을 계산하였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다. ASA의 경우 함초 음건시료에서 가 장 낮은 950.8 mg/mL의 RC₅₀을, NSA의 경우 열풍건조 시료 에서 가장 낮은 235.7 mg/mL의 RC₅₀을 확인하였다. 이러한 결과는 건조방법에 따라 함초의 항산화 활성의 변화가 나타 날 수 있음을 의미하나, 열풍건조 시료에서 동결건조 시료 와 유사한 항산화 활성을 유지하고 있음을 알 수 있다.

성숙 함초의 트롬빈 및 혈액응고인자 저해(25) 및 효소처 리 함초 methanol 추출물의 혈액응고인자 저해(22)는 최근 보고된 바 있으나, 다양한 건조과정 이후의 항혈전 활성 변화는 알려져 있지 않은 상태이다. 따라서, 다양한 동결건 조, 열풍건조 및 음건 함초 시료의 항응고 활성을 TT, PT, aPTT를 각각 측정하여 평가하였으며, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 먼저 대조구로 사용된 aspirin(1.5 mg/mL)은 무처리구에 비해 TT는 2.09배, PT는 1.23배, aPTT는 1.38배 연장시켜 우수한 혈액응고저해 활성을 나타내었다. 동결건 조 함초 시료는 5 mg/mL 농도에서 TT는 1.92배, PT는 1.06 배, aPTT는 1.12배 연장시켜 양호한 트롬빈 저해 활성을 나타내었다. 이러한 항응고 활성은 농도 의존적으로 증가 되었으며, 건조과정을 거치치 않은 함초 에탄올 추출물의 항응고 활성과 유사하였다(25). 열풍건조 시료의 경우, 5 mg/mL 농도에서 TT는 1.89배, PT는 1.09배, aPTT는 1.48배 연장시켜 aPTT에서만 활성 증가가 나타났으며, 농도 의존 적인 항응고 활성이 나타났다. 한편 음건 시료의 경우 5 mg/mL 농도에서 TT는 1.50배, PT는 1.12배, aPTT는 1.27배 연장시켜, 동결건조시료에 TT의 감소가 확인되었다. 특이 한 점은 열풍건조 시료의 7 mg/mL 처리시, TT 및 aPTT를 각각 2.87및 1.95배 연장시켜, 동일농도의 동결건조 시료에 비해서도 유의적으로 항응고 활성의 증가가 나타났다(Fig. 1). 이러한 결과는, 함초의 항응고 활성 물질은 열풍건조시 에 손실되지 않으며, 열풍건조시 동결건조와 유사한 항응 고 활성을 나타냄을 의미한다.

Fig. 1. Effect of the ethanol extracts of Salicornia europaea prepared by different dry methods on blood coagulation. Relative TT, PT, and aPTT are dimensionless.

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성숙 함초의 에탄올 추출물이 0.25 mg/mL 농도에서 140-150%의 혈소판 응집도를 나타낸다는 최근 보고(25)가 있으나, 다양한 건조과정 이후 함초의 혈소판 응집활성에 대해 알려진 바는 없다. 따라서 동결건조, 열풍건조 및 음건 함초의 에탄올 추출물을 대상으로 인간 혈소판 응집능을 평가하였다. 먼저 혈소판 응집저해제인 아스피린(0.25 mg/mL)은 amplitude 9 Ω, area under 47.8로, 무첨가구 DMSO의 21 Ω, area under 130.6에 비해 각각 42.8% 및 36.6%의 감소된 값을 나타내었다. 아스피린은 농도 의존적 인 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다(Table 4, Fig. 2). 한편 동결건조, 열풍건조 및 음건 시료에서는 각각 187.9, 181.6 및 179.7의 area under를 나타내어, 혈소판 응집도는 각각 143.9, 139.1 및 137.1%로 나타났다. 이러한 결과는 열풍건조 및 음건시에 혈소판 응집에 관련되는 성분의 변화 는 거의 없음을 의미한다.

Fig. 2. Diagram of impedance changes dur ing platelet aggregation after addition of aspir in and the ethanol extracts of Salicornia europaea prepared by different dry methods. A, DMSO; B, aspirin (0.5 mg/mL); C, aspirin (0.25 mg/mL); D, aspirin (0.125 mg/mL); E, freeze dried; F, hot-air dried; G, shade dried Salicornia europaea . Aggregation was induced by addition of 2.5 μL of collagen (1 mg/mL) into cuvette containing 50 μL of washed PRP and measured the impedance change for 12 min.

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다양한 함초 건조 시료들의 적혈구 용혈활성을 평가한 결과는 Table 5에 나타내었다. 대조구로 사용된 DMSO는 용혈활성이 없었으며, triton X-100은 1 mg/mL 농도에서, amphotericin B는 0.02 mg/mL에서 적혈구를 100% 용혈시 킨 반면, 동결건조, 열풍건조 및 음건 함초 시료의 ethanol 추출물은 1 mg/mL 농도까지 용혈활성이 전혀 나타나지 않았다. 따라서 함초는 다양한 건조과정에서 추가적인 적 혈구 용혈 문제는 나타내지 않으리라 판단되었다. 이상의 결과는, 함초 재배 농가에서 일반적으로 사용하는 천일건 조 및 음건보다는 열풍건조 또는 동결건조가 함초의 유용성 분, 항산화 및 항혈전 활성 유지측면에서 유리하며, 특히 동결건조 및 열풍건조시 성분 및 활성의 변화가 거의 없으 며, 열풍건조가 동결건조보다 훨씬 경제적임을 감안한다 면, 오히려 함초의 경우 열풍건조가 유리함을 제시하고 있 다. 특히 함초의 항혈전 활성을 이용하는 기능성 음료를 제조하고자 하는 경우 열풍건조를 이용하는 것이 경제적이 면서 효과적임을 제시하고 있다.