레드 비트 뿌리 추출물의 항산화 및 항염증 효과

레드 비트 뿌리는 2015년 2월에 유기농으로 재배되어 수확된 것을 제주도 친환경 농산물 유통 업체인 생드르 영농조합법인에서 같은 해 3월에 구입한 것을 사용하였다. 구입한 시료를 40℃에서 3일간 열풍 건조하여 얻어진 시료 250 g 분말을 20배의 70% EtOH을 가하여 총 3회 추출하였 으며, 감압 농축하여 70% EtOH 조추출물 150 g을 얻었다. 이 후 얻어진 조추출물을 증류수로 현탁시킨 후에 n-hexane 1 L씩 3회, EtOAc 1 L씩 3회, 그리고 butanol(BuOH) 1 L씩 3회로 순차적으로 분획 및 농축하여 각각의 분획물을 확보 한 후 동결 건조하고 -20℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Systematic purification using solvent partitioning from red beet root.

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총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법으로 측정하였다 (17). 실험 시료는 70% EtOH에 100 mg/mL의 농도로 제조 하여 시료 용액 200 μL와 증류수 1,800 μL을 혼합하고, Folin-Ciocalteau's phenol reagent 200 μL을 가하여 잘 섞은 후 5분간 상온에서 반응시켰다. 여기에 2 M Na₂CO₃ 400 μL을 가하여 혼합한 다음 증류수를 가하여 4 mL로 조정하 였다. 이 용액을 상온 암소에서 1시간 동안 반응시킨 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였고, gallic acid(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 이용한 검량선과 비교 하여 총 페놀함량을 mg gallic acid equivalents(GAE)/g로 나타내었다.

라디칼 소거활성 측정을 위해 2,2‘-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)는 Re 등의 방법 을 변형하여 측정하였다(18). 시험 용액의 제조는 증류수에 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 첨가하고, 상온에서 16시간 배양하여 ABTS 양이온(ABTS⁺)을 생성시 켰다. 2.45 mM potassium persulfate buffer와 동량 혼합하였 을 때, 734 nm에서 흡광도의 값이 0.70(±0.02)이 되도록 희석하여 제조하였다. 그 다음 시료의 여러 농도에 희석한 ABTS⁺ 용액을 동량 가하여 6분 후에 흡광도 값을 측정하였 다. 대조군(2.45 mM potassium persulfate buffer)의 흡광도 와 비교하여 흡광도를 감소시키는 정도를 %로 나타내었으 며, 양성대조군으로는 ascorbic acid(Vit. C)와 BHT (dibutyl hydroxy toluene)를 사용하였다.

Murine macrophage cell line 인 RAW264.7 세포는 한국세 포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 uint/mL penicillinstretomycin( GIBCO Inc, New York, NY, USA)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, GIBCO Inc, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양 하였다. LPS(E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma로부터 구입 하여 사용하였다.

24 Well plate에 RAW264.7 cells를 2.5×10⁵ cells/mL로 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator 조건하에 18시간 배양한 후 실험에 사용하였다. 전 배양시킨 cells을 1 μg/mL LPS 가 포함된 배지로 교환 후, 시료를 농도별로 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100 μL과 Griess 시약 (1%(w/v) sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphyl) ethylenediamine (Sigma) in 2.5(v/v) phosphoric acid) 100 μL을 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO₂)의 검량선과 비교하여 환산하였다(19).

세포독성 평가는 MTT[3-(4,5- dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide] 법으로 세포 생존율을 3회 반복 측정하였으며, 시료의 농도에 대한 흡광도를 570 nm 에서 측정한 후 대조군의 흡광도와 비교하여 RAW264.7 세포에 대한 독성 정도를 나타내었다.

RAW264.7 cell을 2.5×10⁵ cells/mL되도록 24-well plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에 전 배양한 다음 sample 과 LPS 1 μg/mL와 함께 처리한 후 24시간 동안 배양 후 원심분리하여 상층액을 얻어 실험을 진행하였다. PGE₂,의 측정은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하 여 정량하였으며, standard에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다.

RAW264.7 cell을 5×10⁵ cells/mL 되도록 6-well plate에 18시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에 전 배양하였다. 이 후 sample과 LPS 1 μg/mL와 함께 처리한 후 24시간 동안 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, lysis buffer로 세포를 용해하여 원심분리(22,072 ×g, 20 min, 4℃)하고 상 층액을 얻은 다음 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 농도 는 bovine serum albumin(BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 4-12%의SDS-polyacrylamide gel에전기영동하고polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane(BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane에 1차 항 체인 iNOS antibody, COX-2 antibody, β-acitin antibody clone AC-74를 이용하여 반응시킨 후, 2차 항체와 반응시켰 다. 단백질은 WEST-ZOL(western blot detection system, iNtRON, Seongnam, Korea) 용액을 이용해 ECL 기질과 반 응시킨 후, Chemidoc(Fusion solo, VILBER LOURMAT, Germany)을 이용하여 각각의 단백질 발현정도를 확인하였 다.

RAW264.7 cell을 2.5×10⁵ cells/mL이 되도록 24-well plate에 18시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에 배양한 다음 준비된 각각 농도의 sample과 LPS 1 μg/mL와 함께 처리한 후 24시간 동안 배양 후 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. Pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay(ELISA) kit(R&D system)를 이용하여 정량하였으며, standard에 대한 표준곡선의 r^²값은 0.99 이상이었다.

모든 데이터는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 군의 차이는 분산분석, 사후검정은 다중범위 검정(Duncan's multiple range test)으로 실시하였고, 모든 통계자료는 SPSS 12 program(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석 하였다.

폴리페놀 화합물은 식물체에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물로 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl (-OH)을 가지고 있어 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특징을 갖고 있으며, 항산화, 항균, 항암, 항염, 항당뇨 등 다양한 생리활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(20,21). 식 물체에 들어있는 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 많을수 록 항산화를 비롯한 생리활성이 커지는 경향으로 보고되어 (22,23) 천연물의 항산화 활성을 검색하는 기초자료로 활용 할 수 있다. 따라서 레드 비트 뿌리 70% EtOH 추출물을 용매 분획하여 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 Table 1에 서와 같이 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물이 다른 추출물에 비해 각각 37.02 mg GAE/g, 23.51±0.22 mg GAE/g으로 높게 확인되었다. 이러한 결과로부터 비트 뿌리에 함유되어 있 는 phenol성 물질들이 용출되는 polarity를 확인할 수 있었 다.

라디칼 소거 활성과 총 폴리페놀 화합물의 함량사이에는 밀접한 상관관계가 있다는 연구 결과들에 근거하여 비트 각 분획물의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 총폴리 페놀 함량의 결과와 같은 경향인 EtOAc > BuOH > 70% EtOH > Hexane > H₂O 순으로 라디칼 소거 활성을 나타냄 (Table 2)을 확인함으로써 총 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 활성이 증가하는 비례적 상관관계를 확인 할 수 있었다. 폴리페놀 함량이 가장 높게 측정되었던 EtOAc 분 획물인 경우 250 μg/mL농도에서 94.8%로 높은 소거활성을 나타내었으며, 같은 농도에서 대조군으로 사용된 Vit. C( 100%), BHT(98.5%)와 유사한 활성을 보였다. 또한 자유 라디칼을 50% 소거하는 IC₅₀ 값 농도는 Vit. C(IC₅₀; 7.5 μg/mL) 보다는 낮지만 BHT(IC₅₀; 57.4 μg/mL) 보다 좋은 활성(IC₅₀; 42.9 μg/mL)을 보였다. 이러한 결과는 Lee와 Chin(24)의 연구에서 비트 물추출과 EtOH 추출에서 DPPH 라디칼 소거활성을 0.05%(500 μg/mL)의 농도에서 측정한 결과와 비교하였을 때, 본 연구에서 70% EtOH이 동일 농도 에서 77.7±1.2%로 각각 약 1.7배와 2.9배 정도 높게 나타났 다. 이러한 활성의 차이는 시료 추출 방법과 실험방법의 차이에 기인한 것으로 사료된다. 일반적으로 같은 시료의 라디칼 소거 활성 측정을 할 때 ABTS 라디칼 소거 활성이 DPPH 라디칼 소거 활성 측정값보다 높게 나타난다고 보고 되어 있다(25). 즉, ABTS의 경우 효소반응에 의하여 라디칼 이 생성되며 친수성 용매, 유기용매에 용해되어 친수성, 소수성 물질의 항산화 활성 측정에, DPPH의 경우 자유라디 칼로 유기용매에 용해되어 실험에 사용하므로 친수성 물질 보다 항산화 효과가 있는 소수성 물질과 더 많이 반응하기 때문이다.

이러한 결과들로부터 레드 비트 뿌리의 EtOAc 분획물은 천연 항산화제로써 활용가치가 있을 것으로 여겨지며, 현 재까지 비트 뿌리에 대한 항산화 활성을 가지는 물질의 동정은 색소성분인 betanin 등 일부만 되어 있어 향후 EtOAc 및 BuOH 층에서 ABTS 라디칼 소거 활성을 가지는 물질의 동정이 필요할 것으로 사료된다.

자외선, 스트레스, 공해 등과 같은 환경요인에 의해 과다 생성되어 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 NO 억제 효능을 측정하기 위하여 LPS를 RAW264.7 세포에 처리하여 과다 유도 발생시켜 비트 분획물들을 처리 하였다. 실험 결과, hexane 분획물에서 69.5%로 세포 독성 이 없이 NO 생성 억제 활성이 가장 높았다(Fig. 2A). 그러나 총 폴리페놀 함량과 라디칼 소거 활성이 가장 좋았던 EtOAc 분획물은 93%의 세포 생존율과 36.3%의 NO 억제 효과를 나타내 총폴리페놀 함량 및 항산화 효과와 NO 억제 효과는 유의적인 상관관계가 없음을 확인하였다. 가장 좋 은 NO 억제 효과를 보인 hexane 분획물을 50, 100, 200, 300 μg/mL의 농도로 처리하여 NO 억제 활성을 확인한 결과 농도 의존적으로 NO 생성을 억제되는 것을 확인할 수 있었 다. 이러한 결과는 최근 Lee 등(26)의 식용식품의 항산화, 항염 효과에 대한 연구 결과에 의하면 세포 생존률이 95% 이상인 1,000 μg/mL의 농도에서 가장 좋은 효능을 보인 배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.) 상층부의 NO 억제 효과 (67.4%)와 같은 뿌리 채소인 무(Raphanus sativus)의 NO 억제 효과(36.6%)보다도 훨씬 낮은 농도에서 좋은 효과로 식용 작물로써 레드 비트 뿌리가 항염 소재로서의 활용 가능성이 높음을 확인하였다.

Fig. 2. Cell viability and inhibitory activity of nitr ic oxide production in RAW264.7 cells. The production of NO was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of the samples. Cell viability was determined using the MTT method. Values are expressed as mean±SD of triplicate measurements. Values with different letters (a-f) are significantly different at p<0.05 according to Duncan's multiple range test.

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세포독성 확인을 위한 MTT 실험법은 같은 처리 조건에 서 동시에 측정하였고, 가장 높은 농도인 300 μg/mL의 농도 에서도 92.4% 세포 생존율로 세포독성이 거의 나타나지 않으면서 94.7%의 강한 NO 생성 억제 효과를 나타내어 (Fig. 2B) 동일 농도 조건에서 hexane 분획물의 PGE₂, cytokines, iNOS 및 COX-2 발현 억제 실험을 진행하였다.

Prostaglandin E₂(PGE₂)는 잘 알려진 염증유발 인자로서 통증 및 혈관의 확장과 대식세포 등 면역세포를 염증 부위 로의 이동에 관여하는 것으로 알려져 있다. NO 억제 활성에 서 가장 좋은 효능을 보였던 hexane 분획물에서 LPS에 의해 유도 증가된 PGE₂ 생성에 대한 억제효능을 확인하였다. 실험결과, LPS 단독처리군에 비해 실험군 300 μg/mL의 농 도에서 85%의 억제 효과를 보였고, NO 억제 결과와 유사하 게 농도 의존적으로 염증성 PGE₂의 생성을 효과적으로 억 제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이러한 결과들은 레드 비트 뿌리 hexane 추출물이 NO와 PGE₂의 생성 조절을 통해 항염증 효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여준다.

Fig. 3. Inhibitory effects of hexane fraction of red beet root on PGE₂ production in RAW264.7 cells. Cells (2.5×10⁵ cells/mL) were stimulated by LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of 70% EtOH extracts and solvent fraction of red beet root. Supernatant was determined by ELISA. Values are mean±SEM of triplicate experiments. Values with different letters (a-e) are significantly different at p<0.05 according to Duncan's multiple range test.

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염증반응에서 NO 및 PGE₂의 생성은 염증반응에 관여하 는 효소인 iNOS 및 COX-2에 의해 각각 조절된다. iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 혈관확장, 세포 독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타내는 대표적인 염증자극에 반응하여 유도되는 단백질로 iNOS 발현증가를 억제함으로써 항염증반응에 관여할 수 있다. COX-2는 arachidonic acid로부터 PGE₂를 생성하는데 관여 하는 효소로서, 염증반응을 조절하는 중요한 단계로 작용 한다. 염증상태에서 iNOS와 COX-2에 의해 생성된 NO와 PGE₂는 혈관 투과성, 부종 및 통증 등의 초기 염증반응을 촉진하고 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시 켜 만성 질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(27,28). 현재 임상적으로 상용되고 있는 NSAID(non-steroidal inflammatory drug) 항염증 치료제들은 COX-2 발현 억제를 통해 항염증 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서 도 레드 비트 뿌리의 hexane 분획물에서 LPS에 의해 유도 증가된 NO 및 PGE₂ 생성에 대한 억제효과가 iNOS 및 COX-2 효소의 발현 조절에 의한 것인지 확인하기위하여 단백질 수준에서의 발현을 western blot analysis로 확인하였 다. 실험 결과, iNOS와 COX-2 단백질 발현 억제 활성을 모두 농도 의존적으로 보이고 있음을 알 수 있으며, 특히 iNOS인 경우 200 μg/mL에서 경우 세포 독성이 없이 96.8% 의 억제 효과를, 같은 농도에서 COX-2는 37.5%의 억제 효과를 보였다(Fig. 4). 이러한 결과들로부터 비트 헥산 추 출물의 NO 및 PGE₂ 생성 억제는 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 억제시킴으로써 나타나는 결과임을 알 수 있었고, COX-2에 의한 PGE₂ 합성 억제 보다는 iNOS 발현 억제를 통한 NO 생성 억제 효과가 더 큼을 확인할 수 있었다. 또한 비트 뿌리의 항염 효능은 식용 가능한 과채류로서 최근 Kim 등(29)의 과일류인 병귤의 항염증 효과 연구에서 가장 활성이 좋은 9월에 수확된 병귤 과피의 iNOS 발현 억제 효과(80%)보다도 좋은 것으로 비트 뿌리가 항염 효능을 갖는 식품 소재로서 충분히 이용가능성이 있을 것으로 사료 된다.

Fig. 4. Inhibitory effects of hexane and ethyl acetate fraction of red beet root on iNOS and COX-2 protein expression in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Cells (5×10⁵ cells/mL) were pre-incubated for 18h, and then cells were stimulated with LPS (1 μg/mL) for in the presence of the samples. The expression levels of iNOS and COX-2 protein were determined by immunoblotting. Values are the mean±SEM of triplicate experiments. Values with different letters (a-d) are significantly different at p<0.05 according to Duncan's multiple range test.

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Cytokine은 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포 의 활성, 증식 및 분화를 조절하여 염증반응을 매개하는 인자로, 염증성 질환의 원인과 치료를 규명하기 위하여 cytokine의 역할이 중요시 되고 있다. TNF-α, IL-6 및 IL-1β 는 대표적인 pro-inflammatory cytokine로 LPS로 자극된 RAW264.7 세포는 비처리군에 비하여 염증성 cytokine의 분비를 증가시켰으며, 비트 hexane 분획물의 처리로 증가된 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성이 모두 농도 의존적으로 억제 됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 가장 높은 농도인 300 μg/mL 의 농도에서는 각각 57, 87, 51%로 모두 50% 이상의 저해 활성을 나타내었다. 특히, 과잉 생산 시 여러 가지 면역이상 증, 염증성 질환, 림프계 종양의 발증과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있는 IL-6에 대하여서는 100 μg/mL의 농도 부터 50% 이상의 저해 효과를 보였다. 이러한 결과들로부 터 레드 비트 뿌리 hexane 분획물이 TNF-α 및 IL-1β에 비해 IL-6의 억제를 통한 항염 효능이 클 것으로 예측할 수 있었 다(Fig. 5B).

Fig. 5. Inhibitory effects of hexane fraction of red beet root on production of inflammatory cytokines in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Cells (2.5×10⁵ cells/mL)were pre-incubated for 18 h and then cells were stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of hexane and ethyl acetate fractions of red beet root. Suematants were collected, and the (A) TNF-α, (B) IL- 6 and (C) IL-1β concentration in the supernatants was determined by ELISA. Values are the mean±SEM of triplicate experiments. Values with different letters (a-f) are significantly different at p<0.05 according to Duncan's multiple range test.le range test.

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종합적으로 레드 비트 뿌리의 항산화 효능은 일반적으로 폴리페놀 계열의 화합물이 많이 추출되는 EtOAc 용매 분획 물에서 우수하게 확인되었으나, 항염 효능은 EtOAc 분획물 보다 hexane 분획물이 더 좋은 항염 효능을 나타내어 추후 유효성분에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된 다. 비트 뿌리가 식용으로 다양하게 사용되고 있는 채소류 라는 점을 고려할 때, 안전성이 있으면서 항산화 및 항염증 효과를 가지고 있어 항산화 및 항염 효능을 가지는 건강식 품 소재로서 활용 가능할 것으로 여겨진다.