배추의 가공에 따른 glucosinolates 및 isothiocyanates 함량 변화

본 연구에서는 봄맛노랑과 춘광 2품종의 봄배추 및 배추 를 이용한 절임배추와 김치를 CJ 제일제당에서 제공받아 사용하였다. 두 품종의 배추는 2013년 3월에 강원도 영월의 CJ 제일제당 계약포장 노지에 파종하여 관행재배법에 따라 재배 후 6월에 수확하였다. 배추는 수확 후 무작위로 선택하 여 24시간 안에 소금에 절인 후 김치로 제조하였으며, 4℃와 20℃에서 각각 1주 동안 저장한 것을 실험에 사용하였다. 절임공정 및 김치 제조 방법은 CJ 제일제당의 시중 유통 김치의 제조방법과 동일하다.

GSL 추출 및 분석을 위해 사용된 desulfo효소인 aryl sulfatase, 외부표준물질로 사용한 sinigrin 및 컬럼 충진물인 DEAE-Sephadex A-25는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 이동상용매로 사용한 acetonitrile은 HPLC 분석 등급으로 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. 또한 ITC 추출에 사용된 dichloromethane은 J.T. Baker에서 구입하였고, 표준물질로 사용된 3-butenyl isothiocyanate, 4-pentenyl isothiocyanate 및 2-phenylethyl isothiocyanate는 Kasei(Tokyo, Japan)에서 구입한 것을 실험에 사용하였다.

배추의 GSL 함량은 국제표준화기구(ISO)의 공인된 방법 으로 분석하였다. 동결건조 시킨 배추, 절임배추 및 김치 분말 70 mg에 70%의 에탄올을 첨가하여 진동한 후 5분간 물중탕(70℃)하여 조(crude) GSL을 추출하고 4℃에서 20분 간 13,000 ×g에서 원심분리 하였다. 1 mL blue tip으로 미니 컬럼을 만들어 H⁺ 형태로 활성화시킨 DEAE-Sephadex A-25를 충진 후 원심분리한 시료의 상층액을 loading한 후 75 μL의 aryl sulfatase(28.7 unit) 용액을 loading 하였다. 실온 에서 over night 방치하면서 desulfate 시켰다. 증류수 0.5 mL를 3회 반복하여 loading 하면서 desulfo GSL를 분리해냈 다. 분리한 desulfo GSL는 HPLC(Dionex, Sunnyvale, CA, USA)로 분석하였다. HPLC 분석을 통해 얻은 주요 peak에 대한 mass spectrum을 MS spectrometer(Thermo scientific, Waltham, MA, USA)로 분석하여 분자량을 확인하고 GSL 임을 확인하였다. HPLC 및 HPLC/MS분석법은 Table 1에 나타내었다.

배추의 ITC의 추출은 Al-Gendy와 Lochwood(14)의 자연 적인 자가분해(natural autolysis)방법을 수정하여 사용하였 다. GSL이 존재하는 배추, 절임배추 및 김치 시료의 건조 파우더 2 g을 증류수 20 mL와 섞어 자가분해가 일어나도록 실온에서 24시간 방치하였다. 그 이후 dichloromethane 5 mL을 첨가한 후 30분 동안 교반시켜준 후 3,500 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 dichloromethane 층만 을 취하여 질소가스를 이용하여 0.5 mL까지 농축하여 GC/MS 분석을 하였다. GC/MS분석법은 You 등(15)의 분석 법을 참고하였으며 Table 2에 나타내었다. 표준물질 2-penylethyl ITC, 3-butenyl ITC 및 4-pentenyl ITC는 배추 추출물과 머무름 시간을 비교 분석하여 확인하였으며, MS 분석을 통하여 분자량을 확인하여 정성분석 하였다.

본 연구에서 모든 분석은 5회 반복하였으며, 얻어진 모든 측정값은 평균값과 표준편차로 나타내었다. 각 평균값 간 의 차이에 대한 유의성은 SPSS program(ver. 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA를 실시하고, Duncan’s multiple range test로 각 군의 평균 차이에 대한 사후 검정을 하였으며, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석 하였다.

본 연구에서 사용한 배추는 봄맛노랑과 춘광 두 가지 품종으로 동일한 시기에 같은 장소에서 동일한 조건으로 재배하는 등 재배조건을 통제하여 품종 간 비교하였다. 봄 맛노랑 및 춘광 신선배추의 GSL 함량을 HPLC 및 HPLC/MS를 통하여 분석한 결과, 두 품종 모두 총 4가지의 주요 피크를 획득하였으며 분자량 확인 결과 sinigrin, gluconapin, glucobrassicanapin 및 4-methoxyglucobrassicin 으로확인되었다(Table 3). 봄맛노랑에는4-methoxyglucobrassicin (9.57±0.42 μg/g dry weight, DW) > gluconapin(7.59±0.16 μg/g DW) > sinigrin(2.60±0.17 μg/g DW) > glucobrassicanapin (1.61±0.31 μg/g DW) 순서로 함유되어있었으며, 춘광에는 4-methoxyglucobrassicin(12.46±1.99 μg/g DW) > gluconapin (4.90±0.62 μg/g DW) > glucobrassicanapin(2.44±0.25 μg/g DW) > sinigrin(1.16±0.47 μg/g DW) 순서로 함유되어있어 품종 간에 차이가 있었으나 총 GSL 함량은 통계적 차이가 없었다(Table 3, Fig. 2). Hwang 등(16)의 보고에 의하면 배추에 함유된 GSL중 4-methoxyglucobrassicin이 가장 함량 이 높았으며 이는 본 연구와 유사한 결과이다.

Fig. 2. Change in total glucosinolate levels at different processing conditions of Kimchi cabbage. Values represent the mean±SD (n=5). Means with different letters above a bar are significantly different at p<0.05.

Download Original Figure

신선배추를 염수에 절인 절임배추의 GSL 함량은 Table 4에 나타내었다. 두 품종 모두 sinigrin은 절임공정 후에 소멸되었으며, 4-methoxyglucobrassicin은 봄맛노랑에서 4.16±0.35 μg/g DW, 춘광에서 7.19±0.83 μg/g DW로 확인되 어 신선배추에 비하여 각각 56.5%, 42.3% 감소되었다. 한편 gluconapin과 glucobrassicanapin의 함량은 비교적 절임공정 에 따라 크게 변화하지 않았다. 이처럼 GSL이 절임공정 후 함량이 감소한 것은 절임과정 중에 염수로 빠져나갔기 때문으로 판단된다. 절임공정에 따라 배추의 총 GSL 함량 은 봄맛노랑은 39.0%, 춘광은 52.5% 감소하였다. Tyagi 등 (17)에 따르면 mustard cake의 총 GSL 함량은 수침시간에 영향을 받아 수침시간이 증가할수록 GSL가 감소하는 것으 로 나타났다. 또한 배추가 염수에 접촉하면 배추 표피 세포 막의 주성분인 펙틴이 펙틴분해효소에 의해 가수분해 되면 서 세포막이 파괴되는데 이때 수용성 물질인 비타민 C, 당, GSL을 포함한 황 함유물질 및 유리아미노산 등이 섬유 질로부터 빠져나온다(9,12). Hwang(9)의 연구에 따르면 절 임시간 및 절임에 사용하는 소금의 농도가 증가할수록 총 GSL 함량이 감소하였다. 배추의 절임공정에 따른 GSL의함 량 감소의 첫 번째 원인은 GSL가 삼투압 또는 펙틴분해에 의한 세포막 파괴로 인하여 염수에 용출되기 때문이다. 이 기작은 품종에 따라 조직의 차이가 있어 소금이 세포 안으 로 확산되는 정도가 달라지게 된다(9,10). 따라서 품종에 따라 동일조건의 절임공정 일지라도 GSL의 함량 차이에 영향을 준다(10). GSL의 함량 감소의 두 번째 이유는 세포 막이 파괴되면서 세포내의 myrosinase가 GSL에 작용하여 GSL가 가수분해기 때문이다. Hwang(9)은 절임 과정 중 myrosinase에 의하여 GSL가 분해되어 총 GSL 함량이 감소 하는 것으로 분석하였지만 myrosinase도 염수에 의해 활성 이 감소되며 저장 중 대부분의 활성이 소실된다는 연구결과 에 따라 배추의 절임과정에서 GSL의 함량 감소의 주요한 원인은 삼투압 및 펙틴분해에 의한 세포막 파괴로 인한 용출 때문인 것으로 사료된다(18,19).

배추를 김치로 가공하여 각각 4℃와 20℃에 1주일 저장한 후 GSL 함량을 분석하였다(Table 5-6). 김치로 제조하여 4℃에서 저온 숙성하였을 때 두 품종 모두 gluconapin과 glucobrassicanapin의 함량은 크게 변화하지 않았다. 하지만 4-methoxyglucobrassicin은 봄맛노랑에서 2.37±0.73 μg/g DW, 춘광에서 3.11±0.33 μg/g DW로 확인되어 절임배추에 비하여 각각 43.0%, 56.8% 감소되었다. 20℃에서 숙성하였 을 때는 sinigrin과 더불어 glucobrassicanapin도 검출되지 않았다. 또한 gluconapin이 봄맛노랑에서 3.33±0.47 μg/g DW, 춘광에서 2.92±0.16 μg/g DW로 확인되어 4℃ 저장배 추에 비하여 각각 53.8%, 29.5% 감소되었으며, 4-methoxyglucobrassicin은 봄맛노랑에서 0.32±0.19 μg/g DW, 춘광 에서 1.68±0.18 μg/g DW로 확인되어 4℃ 저장배추에 비하 여 각각 86.6%, 46.0% 감소되었다. 이는 숙성과정에서 GSL 의 분해가 가속되는 것을 나타낸다. Jung 등(11)은 저장온도 가 높을수록 저장 초기에 총 GSL 함량이 급격히 감소한다 고 보고하여 본 연구결과와 유사하다. 배추를 절이는 과정 이나 김치로 제조하여 4℃에 저장하였을 때 4-methoxyglucobrassicin의함량은지속적으로감소되었으나gluconapin 과 glucobrassicanapin의 함량은 크게 감소하지 않았으므로 비교적 절임 공정에 안정한 것으로 사료된다. 다만, 20℃에 저장하여 숙성 및 발효가 진행되는 동안에 분해되는 것으로 나타나 고온에서의 저장 안정성은 다른 GSL과 비슷하게 감소하는 것으로 판단된다. 이처럼 GSL의 종류에 따라 분 해되는 정도가 달라진다. 총 GSL 함량으로 봤을 때 절임 과정 중 크게 감소하며, 숙성 과정 중에 크게 감소하는 것으 로 나타났다(Fig. 2). 절임이나 숙성 과정 중 품종에 따른 변화 차이가 있는 것은 품종에 따라 펙틴이나 세포벽 등의 차이에서 기인하는 것으로 판단된다.

배추를 가공 상태에 따른 ITC의 함량을 GC/MS로 분석한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 봄맛노랑 및 춘광 두 시료에서 2-pheynylethyl ITC, 3-butenyl ITC, 4-pentenyl ITC가 확인되 었다. 이는 Hong과 Kim(13)의 연구와 일치하였다. 하지만 Hong과 Kim(13)의 연구에 사용된 신선배추에는 이들 ITC 의 함량 순서가 4-pentenyl ITC > 3-butenyl ITC > 2-pheynylethyl ITC 라고 보고하였는데 본 연구에서는 봄맛 노랑은 3-butenyl ITC > 2-pheynylethyl ITC > 4-pentenyl ITC 순서로 분석되었으며(Fig. 3A), 춘광은 3-butenyl ITC > 4-pentenyl ITC > 2-pheynylethyl ITC의 순서로 분석되었 다(Fig. 3B). 이는 품종에 따른 ITC의 함량 차이로 여겨진다. 2-Pheynylethyl ITC는 봄맛노랑 및 춘광 두 시료에 대하여 절임 후 증가하였다가 김치로 가공하여 저장하는 과정에 소실되는 것으로 나타났으며, 20℃로 저장하였을 때 크게 감소하는 경향을 나타내었다. 3-Butenyl ITC의 경우 절임공 정에 의해 감소되었다가 저장과정 중에는 소실되지 않는 것으로 확인되었으며, 4-pentenyl ITC는 신선배추 상태에서 확인되었다가 가공처리에 의하여 완전히 소실되었다. 배추 의 ITC의 함량 조사 결과 품종에 따라 ITC 함량에 차이가 있었으나, 동일한 가공조건에서 ITC의 함량 변화 경향은 일치하였다. Chun 등(18)의 연구 결과 돌산 갓 김치의 발효 기일이 늘어나면서 ITC의 함량이 감소하는 경향을 보였다. 또한 Hong과 Kim(13)의 연구에서 배추김치를 제조하여 저 장하였을 때 ITC 함량은 저장 1일째에 증가하였다가 이후 급속하게 감소하며, 5일 이후에는 완전히 소실되었다. 이는 저장 초기에 myrosinase의 활성이 완전히 소실되기 전에 GSL과 반응하여 분해산물인 ITC를 생성하였다가 저장일 수가 증가하면서 myrosinase가 활성을 잃게 되면서 ITC의 생성이 줄어드는 것으로 예측된다. Park 등(19)은 갓 김치 숙성 중 myrosinase 활성은 20℃에서 3일 이상 저장하였을 때 급격히 감소하여 4일 이후에는 50% 이상의 활성을 손실 하고 10일 후에는 거의 활성이 없었다고 보고하고 있다. 이는 ITC 생성이 기질과 효소와의 반응에 의한 것으로 숙성 중 기질 및 효소활성의 감소가 ITC의 감소 원인으로 판단된 다(18). Foo 등(20)는 자연 상태의 pH에서는 GSL가 myrosinase에 의하여 주로 ITC로 전환이 되지만 산성의 조 건에서는 nitrile이 주요 분해산물로 생성된다고 보고하였 다. 한편 Kim 등(21)은 청갓을 김치로 제조하였을 때 ITC 함량의 감소 원인이 ITC가 염수로 용출되었기 때문으로 예측하였으나, ITC는 휘발성 물질로서 물에는 잘 용해되지 않는 지용성 물질이므로 염수 및 김치의 양념수에 용출되어 소실되기 보다는 저장 중 다른 화학성분으로 변화하였거나 휘발되어 소실되었을 것으로 판단된다(22). GSL 및 ITC 함량은 배추의 물리적 특성인 경도(firmness, hardness)에 영향을 받아 가공됨에 따라 함량의 변화에 영향을 받을 것이며, 배추 조직의 밀도에 영향을 주는 펙틴 및 셀룰로오 즈의 함량과도 연관이 있을 것으로 예상된다. Lee 등(23)의 연구에 의하면 펙틴분해효소인 pectinesterase는 펙틴이 펙 틴산으로 분해되었을 때 Ca 및 Mg 이온과 가교결합을 하도 록 유도하여 식물 세포막을 견고하게 하는 작용을 한다고 보고하여 무기질 함량 연구 또한 병행될 경우 배추 조직의 물리·화학적 특성에 의한 GSL 및 ITC의 함량 변화의 인과 관계를 확인 할 수 있을 것이다. 또한, 기질(GSL)과 효소 (myrosinase) 반응을 통한 분해산물(ITC)의 합성에 대한 연 구를 위하여 myrosinase 활성 연구도 함께 진행되어야 할 것이다.

Fig. 3. Change in isothiocyanate levels at different processing of Kimchi cabbage. (A), Bomatnorang; (B), Chungwang. ●, 2-phenylethyl ITC; □, 3-butenyl ITC; ○, 4-pentenyl ITC. Values represent the mean±SD (n=5). Means with different letters above a bar are significantly different at p<0.05.

Download Original Figure