효모 종류에 따른 무독화 옻식초의 초산발효 특성

본 연구에 사용된 옻(Rhus verniciflua)은 2012년 4월 충북 옥천산 옻나무 껍질을 구입하여 사용하였으며, Choi 등(17) 의 방법에 따라 옻나무 껍질을 2×2 cm 크기로 자른 후 수분이 통할 수 있는 자루에 담아 24시간 동안 물에 담근 후, 물 빼기를 하였다. 수분이 흡수된 옻나무 껍질을 5 L 버섯재배 봉투에 옮겨 담고 필터를 달아 121℃에서 100분 간 살균하였다. 전배양된 아까시재목버섯 균사체를 접종하 고 21℃에서 30일간 배양한 후, 50℃에서 열풍 건조시켜 무독화 발효 옻을 제조하였다. 믹서로 잘게 갈은 옻 1,000 g에 10배(w/v)의 증류수를 첨가한 후, 무게를 측정하고 고 압 살균기에 넣어 110℃에서 6시간 동안 추출한 후, 증발된 수분량을 증류수로 보정하여 동일한 무게로 조정하였다. 발효 옻 조추출물은 광목천으로 여과하여 사용하였다.

본 연구에 사용된 균주는 국립농업과학원 농식품자원부 에서 보관중인 효모로 Table 1에 나타내었다. Saccharomyces cerevisiae Fermivin, Pichia kudriavzerii N77-4, Hanseniaspora opuntiae HP1-2, Candida tropicalis Y447, Wickerhamomyces anomalus N43-8, Pichia kluyveri Frootzen 6종을 YPD 고체 배지 (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, agar 2%, pH 6.0)에서 25℃, 48시간 동안 배양하였다. 초산균은 Acetobacter pasteurianus KACC16934로 고체배지(glucose 3%, yeast extract 0.5%, CaCO₃ 1%, ethanol 3%, agar 2%, pH 7.0)에서 30℃, 48시간 동안 배양 한 후 4℃에 냉장보관하 면서 사용하였다.

6종의 효모를 첨가한 알코올 발효액 제조 방법은 Table 2에 나타내었다. YPD 액체배지(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, pH 6.0)에 각각의 효모를 10%(v/v) 접종하 여 25℃, 48시간 동안 배양하였다. 6종의 효모 배양액을 1단 담금 시 각각의 발효액에 1.8 mL씩 첨가하였으며, 이에 백국과 황국, 무독화 옻 추출물을 물과 잘 혼합하여 25℃, 24시간 동안 발효하여 밑술을 만들었다. 1차 발효된 발효액 을 2단 담금하여 20℃, 8일간 알코올 발효한 후 발효액을 광목천으로 여과하여 초산 발효에 사용하였다.

초산균인 A. pasteurianus KACC16934를 액체배지 (glucose 8.26 g/L, fructose 2.5 g/L, soy peptone 83.92 g/L, MnSO₄·H₂O 0.088 g/L)에 접종한 후 30℃, 48시간 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 원심분리(2,000 rpm, 10 min, 4℃)후 상등액을 제거하였다. 증류수로 3회 세척 후, 효모를 달리 한 무독화 옻으로 제조된 알코올 발효액에 초산균을 각각 10%(v/v)로 접종하여 30℃에서 4일간 정치배양하여 산도가 3.5% 이상이 되었을 때 종초로 사용하였다.

2L 삼각플라스크에 무독화 옻 알코올 발효액 800 mL 넣은 후 종초 10%(v/v)를 접종하여 30℃의 항온 배양기에서 10일간 정치 배양하였다.

알코올 함량은 시료 100 mL를 취하여 증류수 100 mL를 가한 후 가열 증류를 통하여 80 mL의 증류액을 얻었다. 이를 증류수로 이용하여 100 mL로 정용한 다음 비중계로 알코올 도수(%)와 온도를 측정하고 국세청 보정표를 이용 하여 환산하였다(18).

pH는 시료 10 mL를 취하여 pH meter(FE20, Mettler Toledo, Switzerland)로 측정하였으며, 적정산도는 시료 5 mL에 1% phenolphthalein 지시약을 2~3방울 떨어뜨린 후 pH가 8.3이 될 때까지 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 acetic acid(%)로 환산하였다. 적정 산도와 pH 모두 3회 반복 측정 후 평균값으로 나타내었다.

옻식초의 유기산 분석을 위해 시료 10 mL를 원심분리 (3,500 rpm, 20 min, 4℃)후 상등액을 초순수(Fisher, HPLC water)를 이용해 산도 0.2%가 되도록 희석하였다. 희석한 시료를 Sep-pack C18 cartridge(Waters Oasis, Milfort, MA, USA)로 색소 및 단백질 성분을 제거하고 0.45 μm membrane filter(Millipore Co., Befford, MA, USA)로 여과하 였다. 시료는 HPLC(Chromaster 5000, Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)로 분석하였으며, ODS-100W(4.6 mm×250.0 mm) column을 사용하여 분석하였다. 이동상은 3 mM perchloric acid를 사용하였으며, flow rate는 0.7 mL/min, column oven 의 온도는 63℃로 하였다. 분리물을 반응액(0.2 mM bromothymol blue, 15 mM Na₂HPO₄, 2 mM NaOH)과 혼합 시킨 후, UV 440 nm에서 검출하였다. 이 때 반응액의 flow rate는 0.9 mL/min으로 하였다.

옻식초의 유리아미노산 분석을 위해 시료를 5% trichloroacetic acid(TCA)로 5배 희석한 후 원심분리(10,000 rpm, 15 min, 4℃)하여 상등액을 사용하였다. 상등액을 n-Hexane으로 처리하여 비극성 물질을 제거한 후 하층액을 0.2 μm syringe filtering 후 아미노산 분석기(L-8900, Hitachi Co., Tokyo, Japan)로 분석하였으며 분석 조건은 Table 3과 같다.

옻식초의 향기 패턴 분석에 사용된 전자코는 metal oxide sensor(MOS)가 장착된 전자코 시스템(Fox 2000, Alpha MOS, Toluense, France)으로 시료 1 mL을 10 mL 헤드 스페 이스 용기에 담아 밀봉 후 4℃에서 24시간 방치하여 사용하 였다. Standard로는 신선한 공기(air)를 사용하였으며 시료 는 80℃에서 20분간 250 rpm으로 교반하였다. 주입구의 온도가 130℃인 상태에서 시료를 주입하였으며, 이 때 사용 된 가스는 공기로 분당 150 mL의 유속으로 분석하였다(19, 20).

시료 분석은 3회 반복하여 평균과 표준편차로 나타내었 다. 유기산 분석은 SPSS(12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA test)을 하고 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test(DMRT)로 평균 간의 다중비교를 실시하였다.

본 실험에서는 효모 종류를 달리하여 알코올 발효액을 제조하였으며, 발효액의 알코올 함량은 Fig. 1과 같다. 발효 8일 째 S. cerevisiae Fermivin의 알코올 함량이 16.1%로 가장 높게 나타났으며, H. pountiae HP1-2는 15.1%, C. tropicalis Y447은 13.7%, P. kudriavzerii N77-4는 12.6%, P. kluyveri Frootzen은 12.2%, W. anomalus N43-8은 11.2% 로 나타났다. 무독화 옻을 첨가한 알코올 발효액의 경우, 발효제의 사용량은 동일하지만 효모 종류에 따라 알코올 함량 차이가 있는 것으로 보여진다. 본 실험은 Han 등(21)이 보고한 누룩 종류를 달리한 탁주 술덧에서 발효 마지막 단계의 알코올 함량이 8.2~12.6%였다는 결과와 주모 제조 용 효모인 S. cerevisiae를 사용한 주모 첨가 탁주 술덧의 알코올 함량이 7.2~8.5%로 나타났다는 Baek 등(22)의 결과 보다 알코올 함량이 다소 높게 나타났다. 시험구별 알코올 함량은 Saccharomyces 속, Hanseniaspora 속, Candida속, Pichia 속, Wickerhamomyces 속 순으로 높은 경향을 보였다. 주모 제조 시 각 시험구에 첨가되는 효모의 양이 동일하다 는 판단 하에 발효 중에 생육하는 효모의 활성이 상이하여 알코올 함량에 차이를 보이는 것으로 생각된다.

Fig. 1. Alcohol concentration of fermentation with var ious yeast strains. Fermivin, Saccharomyces cerevisiae; N77-4, Pichia kudriavzerii; HP1-2, Hanseniaspora opuntiae; Y447, Candida tropicalis; N43-8, Wickerhamomyces anomalus; Frootzen, Pichia kluyveri.

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효모 종류별 무독화 옻 발효액을 알코올 함량 6%로 조절 한 후, 종초 10%(v/v)를 접종하여 초산 발효 특성을 조사하 였으며, 초산 발효에 따른 pH 변화를 Fig. 2에 나타내었다. 모든 시험구의 초기 pH는 3.46~3.69이었으며 초산발효에 따라 pH가 꾸준히 감소하는 경향을 보여 발효 10일 째 2.87~3.06으로 나타났다. 특히S. cerevisiae Fermivin은 발효 2일에서 6일까지 급격한 pH의 감소와 발효 10일 차 가장 낮은 결과를 보였다. 대부분의 식초는 초산발효 후, pH 2.87~2.91로 감소되었으나W. anomalus N43-8은 초산발효 후 3.06으로 다른 시험구에 비해 비교적 높은 pH를 유지하 였다. 효모 종류를 달리한 무독화 옻식초의 적정산도는 Fig. 3에 나타내었으며, 모든 시험구에서 초산발효 10일까지 산 도가 꾸준히 증가하여 5.17~6.66%의 값을 보였다. 특히C. tropicalis Y447의 경우, 6.66%로 가장 높은 적정산도를 보 였으며, P. kluyveri Frootzen, P. kudiravzerii N77-4, S. cerevisiae Fermivin, H. pountiae HP1-2, W. anomalus N43-8 순으로 산도가 높게 나타났다.

Fig. 2. Compar ison of pH of vinegar produced by detoxified Rhus verniciflua of var ious yeast strains. Fermivin, Saccharomyces cerevisiae; N77-4, Pichia kudriavzerii; HP1-2, Hanseniaspora opuntiae; Y447, Candida tropicalis; N43-8, Wickerhamomyces anomalus; Frootzen, Pichia kluyveri.

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Fig. 3. Compar ison of acidity of vinegar produced by detoxified Rhus verniciflua of var ious yeast strains. Fermivin, Saccharomyces cerevisiae; N77-4, Pichia kudriavzerii; HP1-2, Hanseniaspora opuntiae; Y447, Candida tropicalis; N43-8, Wickerhamomyces anomalus; Frootzen, Pichia kluyveri.

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효모를 달리하여 제조한 무독화 옻식초의 유기산 함량을 Table 4에 나타내었다. 제조된 옻식초의 주요 유기산은 acetic acid로 나타났으며, 그 함량은 각각 S. cerevisiae Fermivin 48.7, P. kudiravzerii N77-4 50.7, H. pountiae HP1-2 44.3, C. tropicalis Y447 55.5, W. anomalus N43-8 35.9, P. kluyveri Frootzen 52.2 mg/mL로 사용 효모 종류에 따라 약간 의 차이를 나타내었다. 가장 높은 함량을 보인 것은 C. tropicalis Y447이었으며, W. anomalus N43-8이 35.88 mg/mL로 유기산 함량이 가장 낮았다. 식초의 발효과정 중 초산균에 의해 생성되는 초산은 식초의 주성분으로 초산발 효의 관리 지침으로 알려져 있다(23). 곡물식초는 다른 식초 에 비해 젖산(lactic acid) 함량이 높으며(24), 젖산 함량이 높으면 군덕내의 원인으로 알려져 있다(25). 그러나 본 연구 에서는 acetic acid 외의 다른 유기산은 매우 미량으로 검출 되었으며, 이는 알코올 발효, 초산 발효 방식, 무독화 옻 추출물 첨가 및 효모에 의한 것으로 보여진다. 식초에 따라 유기산 함량 차이는 원료와 원료 전처리법, 효모, 초산균, 알코올 및 초산발효 등에 따른 것으로 보고되어 있다(26).

식초는 대체로 약 20여 종의 유리아미노산이 검출되는 것으로 보고되고 있으며 그 종류에 따라 맛에 영향을 미치 는 것으로 알려져 있다(27). 효모 종류를 달리하여 제조된 무독화 옻식초의 유리아미노산 분석 결과는 Table 5에 나타 내었으며, 효모에 따라 유리아미노산 함량에 차이가 나타 났다. W. anomalus N43-8로 발효한 식초에서 2,411.7 μg/mL 로 가장 높은 함량을 보였으며, S. cerevisiae Fermivin은 1,314.9 μg/mL, P. kudriavzerii N77-4은 1,753.9 μg/mL, H. opuntiae HP1-2은 1,374.9 μg/mL, C. tropicalis Y447은 1,654.6 μg/mL, P. kluyveri Frootzen은 2,077.9 μg/mL로 나타 났다. 모든 시료에서 valine, leucine, isoleucine, lysine, threonine, phenylalanine 등 7종의 필수아미노산이 검출되 었으며 tryptophan은 검출되지 않았다. 식초의 산미를 부드 럽게 해주는 glutamic acid와 aspartic acid(25)는 W. anomalus N43-8에서 177.20 μg/mL, 133.24 μg/mL로 다른 시험구에 비해 높은 결과를 나타내었다. 본 실험에서 제조 된 무독화 옻식초의 주요 아미노산은 glutamic acid와 alanine으로 나타났으며S. cerevisiae Fermivin을 제외한 모 든 옻식초에서 phenylalanine과 생리활성 물질 GABA의 전 구체인 arginine이 다량 검출되었다. Baek 등(28)에 따르면 무독화 옻식초는 valine, leucine, lysine, tyrosine 등의 함량 이 높다고 보고함에 따라 본 실험과 유사한 경향을 보였다. 일반적인 양조식초에 공통적으로 다량 함유된 아미노산은 aspartic acid, arginine, leucine, lysine, alanine 등으로 원료의 종류, 당화공정, 주정 발효의 조건이나 기타 각종 요인이 초산발효의 모든 단계에서 다르기 때문에 같은 식초라도 아미노산의 함량이 다르다고 보고된 바 있다(24). 무독화 옻식초의 유리아미노산의 함량은 각각의 식초마다 큰 차이 를 보였으며, 이는 효모의 종류에 기인하는 것으로 보여진 다.

전자코(electronic nose)는 신속하고 편리하게 향기 패턴 을 분석할 수 있는 장점이 있어 본 연구에서는 식초의 복합 적인 향을 전자코 분석에 의해 시료 간 차이를 판별하고자 하였다. 식초의 향미(flavor)는 미생물 작용으로 다양한 휘 발성 성분이 생성된다. 식초는 초산 이외에 acid, aldehyde, alcohol, ketone, ester류 화합물의 상호작용에 의해 특유의 향미를 형성한다(29). 효모 종류를 달리하여 제조된 무독화 옻식초의 전자코를 이용한 향기 패턴을 비교하여 주성분 분석(PCA) 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 그 중 가장 영향력 이 큰 함수 값인 PC1과 PC2를 중심으로 각 식초를 분석한 결과, 대조구로 사용된 공기는 x축을 기준으로 가장 오른쪽 에 위치해 있었고 y축을 기준으로 가장 위쪽에 위치하였다. 모든 무독화 옻식초는 standard인 신선한 공기를 기준으로 음의 방향에 위치하였으며 이 중 Fermivin, N77-4, Y447, N43-8의 x축 값이 -0.0133~0.127로 나타났으며 y축의 경우 -0.0181~-0.0262 값의 사이에 존재하여 Saccharomyces 속, Candida 속과 P. kudriavzevii는 비슷한 향기패턴을 갖는 것으로 나타났으며, Wickerhamomyces 속은 x축, y축으로 약간 양의 방향에 위치했다. Hanseniaspora 속과P. kluyveri 는 다른 시험구에 비해 x축은 음의 방향으로 위치했으며 y축은 양의 값을 가졌다.

Fig. 4. PCA of the obtained data from electronic nose data for the flavor patterns of vinegar produced by detoxified Rhus verniciflua vinegar by fermentation with var ious yeast strains. Fermivin, Saccharomyces cerevisiae; N77-4, Pichia kudriavzerii; HP1-2, Hanseniaspora opuntiae; Y447, Candida tropicalis; N43-8, Wickerhamomyces anomalus; Frootzen, Pichia kluyveri.

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