유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 이화학적 성분과 항산화 활성

본 실험에서 사용된 꽃송이버섯 자실체는 청송지역 꽃송 이버섯 농장에서 2015년 재배하여 열풍 건조한 것을 제공 받아 본 실험에 사용하였다. 시료는 먼저 분쇄기(FM-909W, Hanil Co., Sejong, Korea)로 분쇄한 다음 autoclave (HB-506-4, Hanbaek Science Co., Bucheon, Korea)를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균 시킨 후 실험에 사용하였다. 또한 본 실험에 사용한 미강은 2014년 경기도 강화도에서 생산 된 친환경 벼를 2015년 강화마니산미곡처리장(DY-3000R, Yesung Co., Ltd., Daegu, Korea)에서 도정하여 제공받아 사용하였다. Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp., Streptococcus thermophilus으로 구성 되어진 유산균제품 (ABT-5, CHR- HANSEN, Hoersholm, Denmark)과 우유 (Seoul Dairy Co., Korea)는 시중에 구입하여 사용하였다.

유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물은 아래와 같은 재료 배 합비로 제조하였다. 즉 미강 910 g에 꽃송이버섯 자실체 분말 80 g을 넣고 고루 섞어주었다. 우유 10 g을 넣고 반죽한 후 전기찜기(Mach steamer, Dachang Co., Seoul, Korea)에서 102℃, 40분 동안 증자하였다. 온도를 38℃으로 낮춘 후 유산균 제품 500 mL를 넣고 5~10분간 알맞게 반죽 한 다음 37℃에서 48시간 발효하였다. 발효가 완료되면, 오븐시트지에 일정량씩 고른 두께(7×7×7 mm)로 펼쳐서 45℃에서 24시간 건조기(SYA-150, Daehan Co., Gwangju, Korea)에서 건조한 후 분쇄하여 실험에 사용하였다.

꽃송이버섯과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물을 이용하여 메탄올 추출물을 제조하였다. 건조된 시료 100 g당 methanol 1,500 mL을 첨가한 후 환류냉각관을 부착한 65℃ 의 heating mantle(Mtops ms-265, Seoul, Korea)에서 3시간씩 3회 추출한 다음 Whatman filter paper(No.2)로 여과하였으 며, 여액을 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (EYELA VACUUM NVC-1100, Tokyo, Japan)로 용매를 제 거하고 감압․농축한 후 동결건조하고 시료의 산화를 방지 하기 위해 -70℃에 냉동 보관하였다.

버섯 시료의 일반성분은 식품공전의 일반시험법에 따라 분석(19)하였다. 수분 함량은 105℃ 상압가열건조법으로, 조회분 함량은 550℃ 전기회화로를 이용한 직접회화법으 로, 조지방 함량은 Soxhlet 추출법, 조단백질 함량은 자동질 소 증류장치를 이용한 micro-Kjeldahl법으로 각각 분석하였 다. 탄수화물은 100에서 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분 을 제외한 값으로 나타내었다.

버섯 시료의 수용성 식이섬유소, 불용성 식이섬유소 및 총 식이섬유소 함량은 AOAC법에 의하여 분석(20)하였다. 시료 1 g에 MES/TRIS 완충용액(0.05 M MES, 0.05 M TRIS, 24℃에서 pH 8.2) 40 mL를 가하고 교반하여 충분히 분산시 킨 후 내열성 α-amylase 50 μL를 가하였다. 95℃ water bath 에서 40분간 교반한 후 온도를 60℃로 낮추고 protease 100 μL를 넣고 30분간 반응하였다. 그 후 0.561 N HCl 용액 5 mL를 가하여 pH를 4.0~4.7로 조정하고 amyloglucosidase 300 μL를 넣고 30분간 교반하였다. 미리 규조토를 넣어 항량을 구해놓은 유리여과기에 효소분해 한 시료를 여과한 후 잔사는 70℃의 물 10 mL로 2회 씻은 후 세척액은 여액에 합치고 잔사는 다시 90% ethanol과 acetone의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한 후 무게를 측정하였다. 이 잔사 양에서 잔사의 회분량과 단백질량을 감하여 불용성 식이섬유 함량 을 구하였다. 앞서 얻은 여액에는 90% ethanol 200 mL를 가하고 60℃에서 1시간 동안 정치하여 침전물을 형성시키 고 규조토를 넣어 항량시킨 유리여과기로 여과한 후 잔사는 90% ethanol과 acetone의 순으로 각각 15 mL로 2회 세척한 후 무게를 측정하였다. 이 잔사 양에서 잔사의 회분량과 단백질량을 감하여 수용성 식이섬유 함량을 구하였다. 이 렇게 측정된 불용성 식이섬유 함량과 수용성 식이섬유 함량 을 합하여 총 식이섬유 함량을 구하였다.

버섯 시료의 β-glucan 함량은 Megazyme kit(Mushroom and Yeast β-glucan assay procedure K-YBGL)를 이용하여 측정하였다. 시료 100 mg에 37% HCl 1.5 mL를 넣고 30℃ water bath에서 45분간 교반한 후 3차 증류수 10 mL를 가하 고 100℃ water bath에서 다시 2시간 교반하였다. 이 반응액 을 상온으로 식힌 후 2 N KOH 10 mL를 가하여 혼합하였다. 이 혼합물에 0.2 M sodium acetate buffer(pH 5.0)를 가하여 100 mL로 정용한 후 원심분리(1,500×g, 10분)하여 상등액 을 얻었다. 상등액 0.1 mL에 exo-1,3-β-glucanase(20 U/mL) ＋β-glucosidase(4 U/mL) 용액 0.1 mL를 가하고, 40℃ water bath에서 60분간 반응시켰다. 이 반응액에 GOPOD(glucose oxidase/peroxidase, Megazyme) 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 반응시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 total glucan 함량의 계산에 사용하였다. 또한 시료 100 mg에 2 N KOH 2 mL를 넣고, ice/water bath에서 20분간 교반하였 다. 이 반응액에 1.2 M sodium acetate buffer(pH 3.8) 8 mL와 amyloglucosidase(1630 U/mL)＋invertase(500 U/mL) 용액 0.2 mL를 가하고 40℃ water bath에서 30분간 교반한 후 원심분리(1,500×g, 10분)하여 상등액을 얻었다. 상등액 0.1 mL에 0.2 M sodium acetate buffer(pH 5.0) 0.1 mL와 GOPOD 시약 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 반응시킨 후 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 α-glucan 함량의 계산에 사용 하였다. 측정된 total glucan과 α-glucan의 흡광도는 표준물 질인 glucose 용액(1 mg/mL)을 GOPOD 시약과 반응시킨 반응액의 흡광도를 이용하여 각각 함량(g/100 g) 값으로 계산하였다. β-glucan 함량은 total glucan 함량에서 α-glucan 함량을 빼준 값으로 계산하였다.

유리당 분석은 다음과 같이 실시하였다. 건조된 시료를 분쇄하여 칭량하여 50% EtOH 15 mL와 혼합하였다. 80℃ 항온수조에서 20분간 sonication 한 후 3분간 얼음에서 냉각 시켰다. Shaker를 사용하여 15분간 2,000 rpm에서 혼합한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 0.2 μm syring filter로 여과 후 HPLC 분석시료로 사용하였다. 시료는 0.2 μm syring filterMillipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 고속 액체 크로마토크래피(Shiseido Nanospace SI-2, Shiseido, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 이동상으 로는 90% acetonitrile를 사용하였고, 유속은 0.4 mL/min 으로 하였으며 column 온도는 60℃로 설정하였다. Shodex RI-101 detector(Japan)로 검출하였으며, Unison UK-Amino column (250×3 mm, 3 μm, Imtakt Co., Kyoto, Japan)을 사용 하였다. Injection volumn은 4 μL를 주입하였다.

총 polyphenol 함량은 Folin-Denis 방법(21)에 따라 측정 하였다. Test tube에 시료 1 mL과 Folin reagent 2 mL을 넣은 후 실온에서 3분간 정치한 다음 10% Na2CO3 2 mL을 첨가하였고, 이를 혼합한 후 30℃에서 40분간 정치하였으 며, UV-visible spectrophotometer(UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 표준곡선은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis., MO, USA)의 검량선에 의하여 함량을 검출하였다.

총 flavonoid 함량은 Davis법의 방법(22)을 변형하여 측정 하였다. 시료 1 mL에 diethylene glycol 2 mL을 첨가한 다음 1N NaOH 20 μL을 넣고, 37℃ water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV-spectrophotometer(UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 rutin hydrate(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 의 검량선에 의하여 함량을 검출하였다.

DPPH radical 소거능은 Blois의 방법(23)을 변형하여 측 정하였다. 버섯 시료 추출물 1 mL과 0.2 mM 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl(DPPH) 1 mL을 test tube에 취한 후 혼합하 여 37℃에서 30분간 반응시켜 UV-spectrophotometer(UV- 1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거능(%)은 (1-시료첨가구 의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100에 의하여 활성도를 산 출하였다.

ABTS radical의 소거활성은 Roberta 등의 방법(24)으로 측정하였다. 7.4 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid; ABTS)와 2.6 mM potassium persulphate를 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성시킨 후 이 용액을 735 nm에서 흡광도 값이 0.9±0.02이 나오도록 buffer로 희석하여 사용하였다. 흡광도를 맞춘 ABTS 용액 0.5 mL에 시료 0.5 mL를 가하여 37℃에서 30분간 반응시키 고, 735 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS 라디칼 소거 활성(%)은 (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광 도)×100에 의하여 활성을 산출하였다.

항산화지수(antioxidant index, AI)는 Rancimat(Metrohm model 679, Herisan, Switzerland)을 이용하여 측정하는 방법 으로 Joo와 Kim의 방법(25)에 의하여 실시하였다. 흰 민들레 에탄올 추출물에 포함된 용매를 완전히 제거한 후 추출 물의 함량이 1,000 ppm이 되도록 soybean oil(Sigma Co., USA)에 첨가하고, 초음파기기(Ultrasonic processor, UCX- 750, CT, USA)를 이용하여 유기 용매 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 하였다. Rancimat의 측정 조건은 시료 3.0 g를 반응 용기에 취하고 증류수 70 mL를 측정용기에 넣은 후 110℃에서 air flow rate 20 L/hr로 하여 산화안정성을 비교하 였다. 항산화지수는 추출물을 첨가한 실험군의 유도시간을 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 유도시간으로 나눈 값을 구하였다.

실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS 통계 Package를 이용하여 실험군당 평균±표준편차로 표시하였 고, 각 군당 3개의 시료를 사용하여 실험은 3회 반복 시행하였으며, t-test와 Tukey's test에 의하여 각 실험군의 평균치 간의 유의성을 검정하였다.

꽃송이버섯 자실체의 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 일반성분 분석 결과는 Table 2와 같다. 꽃송이버섯 분말은 탄수화물 75.11%, 조단백질 13.11%, 수분 4.21%, 조지방 3.86%, 조회분 3.71% 순이었으며, 유산균 발효 꽃송 이버섯 혼합물은 탄수화물 51.28%, 조지방 22.18%, 조단백 질 11.19 %, 조회분 9.94%, 수분 5.41% 순이었다. 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물이 꽃송이버섯 분말에 비하여 수 분, 조지방 및 조회분 함량은 유의적으로 높게 나타났다 (p<0.05).

꽃송이버섯 자실체의 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 식이섬유소 조성과 β-glucan 함량을 비교한 결과 는 Table 3과 같다. 꽃송이버섯 원물의 총 식이섬유소, 불용 성식이섬유소 및 수용성 식이섬유소의 함량은 각각 51.71, 46.13 및 5.59%를 보였으며, 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합 물은 34.95, 33.46 및 1.48%로 나타났다. 꽃송이버섯 원물의 총 식이섬유소 중 89.21%가 불용성 식이섬유소로 구성되어 있고, 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 불용성 식이섬유 소 함량은 총 식이섬유소의 95.74%를 차지하였다. 이에 비해 수용성 식이섬유의 함량은 꽃송이버섯 분말과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물에서 1.5~5.6 g/100 g 수준으로 매우 낮았다. Lim 등(26)은 꽃송이버섯 원물의 총 식이섬유소 중 불용성 식이섬유소 함량이 96.0%로 구성되어 있는 것으 로 보고되어 본 연구에서의 꽃송이버섯 원물 내 불용성 식이섬유소 함량이 다소 낮은 것으로 나타났다. 한편 꽃송 이버섯 자실체 분말 100%를 이용한 유산균 발효물에서의 불용성 식이섬유소가 총 식이섬유소의 96.67%를 차지하는 것으로 보고되어(26) 본 연구에서의 꽃송이버섯 자실체 분 말 8%을 미강에 첨가한 유산균 발효 혼합물과 유사한 경향 을 보였으며, 이는 꽃송이버섯을 8%로 첨가하였더라도 미 강 내 함유되어 있는 불용성 식이섬유소 함량으로 인해 높게 나타난 것으로 사료된다

본 연구에서 측정된 버섯 원물의 β-glucan 함량은 38.03% 으로 나타났다. 이는 일본에서 재배된 꽃송이버섯 자실체 는 약 40 g/100 g의 함량을 갖고 있다는 보고(27)와 본 연구 결과를 비교했을 때 유사한 것으로 나타났다. 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 β-glucan 함량은 5.44%으로 버섯 원물의 β-glucan 함량에 비하여 유의적으로 낮게 나타났다.

꽃송이버섯 자실체의 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 유리당 함량은 Table 4와 같다. 꽃송이버섯 원물 에는 유리당 중 glucose 4.96%와 fructose 1.77%만 함유하고 있으며, 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물은 sucrose만 5.17% 를 함유하고 있는 것으로 분석되었다. 전체적으로 이당류 중 lactose 및 maltose는 검출되지 않았고 유산균 발효 꽃송 이버섯 혼합물과 달리 버섯 원물에서는 sucrose가 검출되지 않았다. Cho 등(28)은 식용 및 약용버섯의 단당류 및 이당류 함량을 분석한 연구결과에서 꽃송이버섯의 단당류는 glucose와 fructose으로 각각 함량이 8.95 g/L와 2.23 g/L으로 보고되어 본 연구 결과의 꽃송이버섯에 비해 다소 높게 나타났다. 또한, 꽃송이버섯과 찔레버섯을 제외하고 29 종 류의 버섯류에서 이당류가 검출되지 않았다고 보고하였으 며, 꽃송이버섯에서 lactose 함량은 3.38 g/L이라고 보고하 여(27) 본 연구결과와 차이가 있었다. 이는 꽃송이버섯의 산지, 품종, 재배 지역 등에 따라 유리당 함량에 차이가 있음을 시사한다. 본 연구에서의 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물에서 sucrose가 검출 되었으며, 이러한 결과는 톳 추 출액을 유산균으로 발효시킨 결과, 환원당의 급속한 감소 가 있었다는 Song 등(29)의 연구결과와 유사하였다. 이는 미생물이 발효 중 환원당을 탄소원으로 이용하였기 때문인 것으로 사료된다.

꽃송이버섯 자실체의 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 총 polyphenol 및 총 flavonoid 함량은 Table 5에 나타났다. 총 polyphenol 함량은 꽃송이버섯 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 총 flavonoid 함량은 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합 물에서 꽃송이버섯 원물에 비하여 유의적으로 높게 나타났 다(p<0.05). Seo 등(30)은 구지뽕 열매를 유산균을 이용하여 발효하였을 경우 총 polyphenol 함량이 증가하였으며, Song 등(31)은 생더덕 추출물의 초기 총 polyphenol 함량이 0.54 mg/100 g이었으나, 유산균 발효 후 2.79 mg/100 g으로 약 5배 정도 증가하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 꽃송이 버섯 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 총 polyphenol 함량 차이는 크게 없는 것으로 조사되었으며, 이는 유산균 발효에 의해 꽃송이버섯 8% 혼합물에서 항산 화 활성을 가지는 것으로 알려진 polyphenol 화합물이 생성 된 것이라고 판단된다. 한편, Lee와 Hong(32)은 블루베리를 유산균을 이용하여 발효한 다음 총 flavonoid 함량이 무발효 블루베리에 비해 높은 함량을 나타내었다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 것으로 나타났다. 이는 유산균 발효에 의해 유익한 항산화 물질이 생성된 것으로 사료되어 진다.

꽃송이버섯 자실체의 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 DPPH 및 ABTS radical 소거활성은 Table 6과 같다. DPPH radical 소거능은 꽃송이버섯 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물에서 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, 대조구인 비타민 C에 비해서는 유의적으로 낮은 DPPH radical 소거능을 나타났다(p<0.05). ABTS radical 소 거능은 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물이 꽃송이버섯 원물 에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났으며, 대조구인 비 타민 C와는 유의적인 차이를 보이지 않았다. Lee 등(10)은 블루베리 유산균 발효물에서 DPPH 및 superoxide radical 소거활성이 무발효 블루베리에 비해 증가한다고 보고하였으며, Lee 등(9)은 유산균 발효를 통한 인삼열매의 라디칼 환원력에 대한 연구에서 유산균 발효 인삼열매 추출물은 무발효 추출물에 비해 항산화 활성이 증가하는 것으로 확인 하였다. 인체 내의 free radical은 지질, 단백질 등과 반응 생체의 노화를 촉진할 수 있는 물질로 free radical을 제거할 수 있는 천연물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이러한 free radical을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크 면 높은 항산화 활성 및 활성산소를 비롯한 다른 radical에 대하여 소거 활성을 기대할 수 있다. 본 연구에서는 radical 의 환원력을 DPPH와 ABTS 방법으로 측정하였으며, 이들 방법 모두 radical의 환원력을 측정하는 실험으로 원리는 비슷하지만 약간의 차이가 있다. ABTS radical 소거능은 극성과 비극성 시료의 소거활성을 모두 확인할 수 있으나, DPPH는 비극성 물질에서만 확인할 수 있다는 점에서 차이 가 있다. 또한 DPPH는 free radical, ABTS는 cation radical에 반응하여 기질의 특성이 서로 다르므로 ABTS 유리기 소거 법이 DPPH 유리기 소거법보다 적용 범위가 넓다(33). 이와 같은 방법을 이용하여 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 항산화 활성을 측정한 결과, DPPH와 ABTS radical 소거활 성에 모두 효능이 있는 것으로 나타났으며, 이는 유산균 발효 후 총 polyphenol과 flavonoid 함량 증가로 인해 항산화 활성이 증가하는 것으로 사료된다.

꽃송이버섯 자실체의 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 유지 산화 억제효과를 알아보기 위하여 Rancimat 으로 측정한 항산화지수는 Table 7과 같다. 양성대조군으로 사용한 천연항산화제인 비타민 C의 항산화지수는 15.32로 가장 높게 나타났고, 꽃송이버섯 원물과 유산균 발효 꽃송 이버섯 혼합물은 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 꽃송 이버섯 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 항산화지 수는 각각 1.73과 1.86으로 통계적으로 유사한 경향을 보였 고, 대조구인 비타민 C에 비해서는 낮았으나 시료를 첨가하 지 않은 음성대조군의 1.00보다는 높게 나타나 꽃송이버섯 원물과 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 soybean oil에 대한 산화 억제효과가 있는 것을 확인하였다(p<0.05). 이와 같이 유산균 발효 꽃송이버섯 혼합물의 항산화 효과를 Racimate으로 측정한 항산화지수는 DPPH 및 ABTS radiacl 소거능의 결과와 유사하게 꽃송이버섯 원물과 유의적인 차이를 나타나지 않았다. 상기의 결과들을 종합할 때 유산 균 발효 꽃송이버섯 혼합물이 항산화효과에 기여하는 것으 로 여겨지며, 보다 정확한 결과를 얻기 위한 차후 연구가 필요할 것으로 사료된다.