약용열매 혼합 열수 추출물의 이화학적 특성 및 항산화 활성

본 실험에 사용된 산수유는 경상북도 의성군, 오미자는 경상북도 문경시, 복분자는 경상남도 하동군 및 구기자는충청남도 청양군에서 재배되어 건조된 것을 2015년 7월 경상북도 경산시 소재의 농협 하나로 마트에서 구입하여 사용하였으며, 구입한 약용열매 4종은 냉장 보관하였다.

약용열매 4종을 건식분쇄기(FM-909W, Hami Co.,Sejong, Korea)로 각각 분쇄한 다음 표준망체(60 mesh, Chung Gye Sang Cong Sa, Seoul, Korea)를 통과시킨 분말을 Table 1과 같이 비율별로 혼합한 시료 40 g에 10배의 증류수 를 첨가하였다. 100℃에서 3시간 동안 환류냉각추출기 (CA-1112, Eyela Co., Japan)를 이용하여 추출하였고 각각의 추출물은 불순물을 제거하기 위하여 여과지(No.2, Whatman Intemational Ltd, Leicestershire, England)를 이용하여 여과 하였다. 여과된 용액은 감압농축기(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 다음, 동결건조기(Free Zone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70℃ 이하의 암소에 보관하면서 시료로 사용하였다.

각각의 약용열매 혼합 열수 추출물 동결건조분말 1 g에20배의 증류수를 첨가하여 이를 분석용 시료로 사용하였다. pH는 pH meter(CH 8603, Mettler-Toledo Inc., Schwarzenbach, Switzerland)를 이용하여 측정하였으며, 당도는 굴절당도계 (Master-a, Atage Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였 다. 산도는 pH가 8.3이 되도록 각각의 시료 1 mL에 0.1 N NaOH를 적하하여 소비한 양을 lactic acid(0.009)로 환산 하여 계산하였다.

약용열매 혼합 열수 추출물의 수율은 동결건조(FreeZone 2.5, Labconco Co.)한 다음 건물 중량을 구하였고 시료 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(18)에 따라 시료 1 mL 에 1 N Folin ciocalteu reagent 1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음 20% Na2CO3 1 mL를 첨가하여 실온의 암소에 서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 Tannic acid (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)를 정량하여 작성한 표준곡 선으로부터 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 Jia 등(19)의 방법을 응용하여측정하였다. 시료 1 mL에 5% NaNO2 150 μL를 혼합하여 실온에서 6분간 반응 시킨 후 10% AlCl3 300 μL와 혼합하여 다시 실온에서 5분간 반응 시킨 후 1 N NaOH 1 mL와 혼합한 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 총 플라보노이드함량은 Rutin(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다. 총 당 함량은 phenol-sulfuric acid 방법을 응용하여 측정 하였다(20). 즉, 시료 1 mL에 5% phenol 1 mL와 진한 H2SO4 5 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 반응 시킨 후 분광광도 계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH radical 소거활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)의 환원력을 이용하여 측정하였다(21). 즉, DPPH reagent는 DPPH 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL 첨가하여 흡광도를 517 nm에서 약 1.6으 로 조정하여 제조하였다. 시료 0.5 mL에 DPPH reagent 5 mL를 혼합하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계 (Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)로 흡 광도를 측정하고 아래와 같이 계산하였다.

S : absorbance of sample at 517 nm

C : absorbance of control at 517 nm

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)) radical 소거활성(22)은 7.4 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate를 최종 농도로 혼합하 여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS⁺을 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되게 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. 희석 된 용액 180 μL에 시료 20 μL를 혼합하여 정확히 1분간 반응시킨 다음 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 시료의 첨가 전과 후의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

S : absorbance of sample at 732 nm

C : absorbance of control at 732 nm

FRAP는 Benzie와 Strain의 방법(23)에 따라 다음과 같이측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer(300 mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine(TPTZ, Sigma, St, Louis, MO, USA) 2.5 mL와 20 mM ferric chloride(FeCl3) 2.5 mL를 첨가하여 제조하였다. 시료 30 μL에 제조된 FRAP reagent 900 μL와 증류수 90 μL를 넣은 후 37℃에서 10분간 반응시 킨 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하 였다. FRAP는 FeSO4·7H2O(Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

환원력은 Oyaizu의 방법(24)에 따라 다음과 같이 측정하였다. 시료 1 mL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1% potassium ferricyanide 용액 2.5 mL를 가한 후 50°C에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 10% trichloroacetic acid 용액 2.5 mL를 가한 후 원심분리 한 뒤, 상등액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL와 0.1% FeCl3 용액 0.5 mL를 혼합한 다음 분광광도 계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

모든 실험결과는 SPSS(version 19.0, SPSS Inc., Chicago,IL, USA)를 이용한 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의성 (p<0.05)은 Duncan's multiple range test를 실시하여 검정하였다.

약용열매 4종의 혼합비율에 따른 열수 추출물의 pH, 당도 및 산도의 결과는 Table 2와 같다. 약용열매 혼합 열수추출물의 pH는 3.22~3.52의 범위로 오미자 혼합비율이 높 은 추출물에서 낮았으며, 추출물 간의 차이는 미미하였다. 당도는 MS, M1, M2 및 M4가 4.00~4.20 °Brix로 유사하게 나타났으나, M3은 3.20 Table °Brix로 다른 추출물에 비해 낮게 나타났다. 복분자주 주박의 항균 항산화 및 항혈전활 성 연구에서 복분자는 그 자체로 우수한 식용가치를 가지고 있어 추출 음료 및 차 등의 식용으로 이용되고 있으나, 당도 가 낮고 신맛이 강해 생과보다는 설탕을 첨가한 과실주, 초콜릿 및 식빵 등의 가공식품으로 더욱 많이 이용되고 있다고 보고하였다(25). 산도는 3.60~5.85%로 유의적으로 나타났으며, 오미자 혼합비율이 높은 추출물에서 5.85%로 가장 높게 나타났다. Jeong 등(26)은 후숙 온도에 따른 오미 자의 이화학적 특성 변화에서 수확 시 오미자의 pH는 2.81 이었고 산도는 5.59%라고 하였으며, Kim 등(27)은 오미자 의 산도는 4.9%라고 보고하였는데 본 연구에서는 산도가 높은 오미자의 영향을 받아 오미자의 혼합비율이 높은 추출 물의 pH가 가장 낮게 나타났으며 산도는 높게 분석되었다.

약용열매 혼합 열수 추출물의 추출수율, 총 폴리페놀,총 플라보노이드 및 총 당 함량은 Table 3과 같다. 추출수율 은 각각의 추출물에서 유의적인 차이를 나타내었는데, M2(42.33%), M1(40.40%), MS(36.03%), M4(35.90%) 및 M3(32.53%) 순으로 오미자 혼합비율이 높은 추출물이 가 장 높았고 복분자 혼합비율이 높은 추출물에서 가장 낮았 다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 M3이 각각 14.54 g/100 g 및 5.65 g/100 g으로 가장 많이 함유되어 있었으며 다른 구간에 비해 복분자 혼합비율이 높은 추출물에서 페놀 성물질의 함량이 가장 우수함을 확인하였다. 복분자 혼합 비율이 높은 추출물의 총 폴리페놀 함량은 14.54 g/100 g으 로 가장 높게 나타났으며, 총 폴리페놀 함량이 가장 낮게 나타난 오미자 혼합비율이 높은 추출물보다 약 2배 정도 높게 나타났다. 오미자와 배를 이용한 혼합발효주 제조 방 법에 대한 연구에서 오미자 및 복분자 발효액의 총 페놀 함량은 각각 1,017.0 mg/L 및 3,139.0 mg/L로 복분자 발효액 은 오미자 발효액에 비하여 3배 정도 높게 함유하고 있다고 보고하였다(28). 총 플라보노이드함량은 M3에서 5.65 g/100 g으로 가장 높게 나타났으나, 다른 추출물은 4.00~ 4.66 g/100 g으로 유사하게 나타났다. 이러한 페놀성 화합물 은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며 플라보노이드와 탄닌이 주성분이다. 이들은 phenolic hydroxyl(OH)기를 갖기 때문 에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하며, 항산화 및 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 축합형 탄닌은 녹차를 비롯한 찻잎의 주된 폴리페놀 성분으로 알려져 있으 며 충치 예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항암, 항산화 및 미백 효과 등이 보고되어 있다(29). 총 당 함량은 39.30~48.36 g/100 g으로 나타났으며, 유의적인 차이를 나타내었다. Lee 등(30)은 총 당 함량은 추출 수율과 유사하게 나타난다고 보고하였는데, 추출수율이 가장 높았던 M2의 총 당 함량이 48.36 g/100 g으로 높게 나타나 유사한 경향을 나타내었다.

Radical은 불안정하여 세포 구성 성분들과 쉽게 반응하여 비선택적이고 비가역적인 손상을 일으킨다. 보라빛을 나타내는 DPPH radical은 비교적 안정한 화합물로 항산화 제와의 반응에 의해 radical 활성을 검정하는데 사용된다 (31). 추출물의 DPPH 및 ABTS radical 소거활성은 Fig. 1과 같다. DPPH radical 소거활성은 복분자 혼합비율이 높은 M3이 250~1,000 μg/mL 농도에서 25.80~86.09%로 가장 높 은 활성을 나타내었으며, 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid는 100 μg/mL 농도에서 66.65%의 항산화 활성을 나타 내었다. 다른 추출물은 250~1,000 μg/mL 농도에서 MS 17.89~65.69%, M1 14.65~57.63%, M2 12.89~45.94% 및 M4 11.69~46.16% 순으로 약용열매 혼합비율이 동일한 MS의 DPPH radical 소거활성이 M3 다음으로 높았으며, 모든 시 료에서 농도 의존적으로 증가하였다. Lee 등(32)은 추출온 도에 따른 산수유 추출물의 DPPH radical 소거활성을 조사 한 결과 산수유 추출물의 농도가 증가할수록 DPPH radical 소거 활성이 유의하게 증가하였으며, Lee 등(33)은 복분자 메탄올 추출물의 DPPH radical 소거 활성이 50 μg/mL 농도 에서는 94.90±0.68%이며, 100 μg/mL 농도에서는 95.93± 0.81%로 50 μg/mL 농도 이상에서 농도 의존적으로 유의 하게 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다고 보고하 였다.

Fig. 1. DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activity ofextracts from medicinal fruit mixture. Means±SD (n=3) with different letters (a-o) above bars are significantly different byDuncan's multiple range test (p<0.05).

Download Original Figure

ABTS radical 소거활성은 모든 추출물에서 농도가 증가함에 따라 소거 활성이 증가하였으며, 특히 250~1,000 μg/mL 농도에서 M3은 33.43~90.49%로 가장 높은 활성을 나타내어 DPPH radical 소거활성과 유사한 경향을 나타내 었다. 1,000 μg/mL 농도에서 M3은 90.49%로 유의적으로 높은 활성을 나타내었으며, MS 27.07~69.22%, M1 21.78~66.91%, M2 22.28~55.21% 및 M4 21.16~53.12% 순 으로 나타나 DPPH radical 소거활성과 유사하게 나타났다. Jun 등(34)은 복분자와 오디의 ABTS radical 소거활성을 조사한 결과 60% acetone 추출물은 시료의 농도가 증가할 수록 항산화 활성이 증가하여 농도 의존적인 특성을 보였다 고 보고하였다. 모든 추출물에서 ABTS radical 소거활성이 DPPH radical 소거활성에 비하여 높은 활성을 나타내었는 데, 이는 다수의 연구에서 ABTS radical 소거활성의 경우 DPPH radical 소거활성보다 수소 공여 항산화 물질과 chain breaking 항산화 물질을 모두 측정할 수 있어 더 높은 활성을 나타낸다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다(22,35).

FRAP에서는 추출물에 존재하는 항산화 물질이 산화제로 작용해 산화-환원 반응에 사용되며, Ferric 2,4,6-tripyridyl- S-triazine의 [Fe(Ⅲ)-(TPTZ)2]²⁺ 화합물은 산화-환원 반응에 의해 파란색을 띠는 ferrous complex [Fe(Ⅲ)-(TPTZ)2]³⁺로 변한다(36). 측정된 파란색의 강도는 추출물의 항산화 물질 양과 관련이 있다고 보고되고 있다(37). 약용열매 혼합비율 에 따른 추출물의 FRAP 및 환원력은 Fig. 2와 같다. FRAP는 M3이 250~1,000 μg/mL 농도에서 0.36~0.86 μM로 가장 높 은 활성을 나타내었으며, MS, M1, M2 및 M4는 각각 0.30~0.65, 0.28~0.50, 0.27~0.53 및 0.26~0.52 μM로 모든 시료에서 농도 의존적으로 FRAP가 증가됨을 확인하였다. Hwang 등(38)은 경북약용작물(홍화자, 향부자, 형개, 위유 및 작약)의 FRAP를 조사한 결과 5가지 약용작물 중 FRAP 값은 홍화자 1,914.95±2.11 μM Fe²/mg로 가장 높은 FRAP 활성을 나타냈으며, 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 비교 했을 때 5가지 약용식물 중 홍화자 추출물에서 모두 높은 함량으로 동일한 결과를 확인할 수 있다고 보고하였다.

환원력은 reduction의 항산화 반응에서 hydrogen atom을제공함으로써 자유라디칼 연쇄를 변환시키며, reduction은 또한 과산화의 일정한 전구물질과 반응하여 과산화의 형성 을 방해한다. Flavonol 물질은 이 안정된 생성물로 그들을 전화시키기 위해 자유라디칼과 반응하거나 전자를 제공함 으로써 reduction과 같은 유사한 형태에서 반응하고 자유라 디칼 연쇄반응을 끝낸다고 보고되고 있다(39). 항산화 작용 의 여러 가지 기작 중에서 활성 산소종 및 유리기에 전자를 공여하는 능력이 환원력이므로 이를 측정하여 항산화 활성 을 검정하는 수단으로 이용할 수 있으며, 환원력이 강할수 록 녹색에 가깝게 발색되므로 항산화 활성이 큰 물질일수록 높은 흡광도 값을 나타낸다(40). 약용열매 혼합비율에 따른 추출물의 환원력은 모든 시료가 250~1,000 μg/mL 농도에서 0.21~0.96으로 높은 활성을 나타내었으며, 농도 의존적으 로 증가하였다. 특히 M3의 1,000 μg/mL 농도에서 0.96으로 나타났으며, 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid는 100 μg/mL 농도에서 0.82의 활성을 나타내었다. 다른 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 MS 0.27~0.80, M1 0.23~0.70, M4 0.22~0.66 및 M2 0.21~0.59 순으로 나타났다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높은 M3에서 다른 추출물에 비해 FRAP와 같이 환원력 또한 활성이 높음을 확인하였으며, 이는 식물체 내에 있는 다양한 항산화 성분들이 그들의 특성에 따라 다른 항산화 활성을 나타낼 수 있기 때문으로 생각된다(41). 따라서, 약용열매 혼합 열수 추출물의 항산 화 활성을 분석한 결과, 복분자 혼합비율이 높은 추출물에 서 항산화활성이 우수함을 확인하였다.

Fig. 2. FRAP (ferric reducing antioxidant power) (A) and reducingpower (B) of extracts from medicinal fruit mixture. Means±SD (n=3) with different letters (a-k) above bars are significantly different byDuncan's multiple range test (p<0.05).

Download Original Figure