초미세 분쇄한 삼백초로부터 추출된 phenolic 화합물의 hyaluronidase 억제 효과

본 실험에 사용된 시료는 대구 약령시장 및 한의원에서 한약재로 사용되는 92종을 구입하여 40 mesh의 체눈을 통과하는 분말로 만들어 시료로 사용하였다(Table 1).

물 추출물의 경우 시료 1 g에 증류수 200 mL을 넣고 액이 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하고 에탄올 추출물은 시료에 100 mL의 60% ethanol을 가하고 homogeniger로 20,000 rpm에서 1분간 균질화 시킨 후 24시간 동안 교반 추출하였으며, 추출액은 Whatman No.1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(Rotavapor R-200, Buchi Labortechninik AG, Flawil, Switzerland)에서 농축하여 시료로 사용하였다.

Phenol성 화합물의 정량은 Folin과 Davis 방법(19)에 준하여 측정하였다. 추출물 2 mL에 5% Na2CO3 용액 240 μL를 가하고 발색시약으로 1 N folin ciocalteu reagent 120 μL를 넣고 잘 섞어준 뒤, 10분간 방치하여 발색시키고, 흡광도 725 nm서 1시간 이내에 OD를 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다.

Hyaluronidase(HAase) 저해활성 측정은 sodium- hyaluronic acid(HA)로부터 형성된 N-acetylglucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethylamino benzaldehyde (DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다(20). 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 HAase(7,900 unit/mL) 0.05 mL와 시료용액 0.1 mL를 혼합하여 37℃에서 20분간 배양한 다음 12.5 mM CaCl2 0.1mL를 가하고 혼합 후 다시 20분간 배양 하였다. 기질로서 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 HA(12mg/mL)를 첨가하여 다시 40분간 배양하여 0.4 N potassium tetraborate 0.1 mL 및 0.4N NaOH 용액을 0.1mL 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각 시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 3 mL을 가하여 37℃에서 20분간 배양한 다음 585 nm에서 흡광도를 측정하여 저해활성(%)은 (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100으로 산출하였다.

본 실험에서 사용된 시료는 45℃ 건조기에서 열풍 건조시킨 삼백초잎을 한국생명공학연구원 정읍 분원에 있는 10 L 용량의 초미세 분쇄 장치(MKFS10-1, Koen 21 Co., Ansan, Korea)를 이용하여 시간당 20 kg의 grinding 속도로 fine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh : 초과 사이즈)과 ultrafine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh : 미만 사이즈)으로 나누어 분쇄 사용하였다.

성적은 평균±표준오차로 표기하였다. 각 군간의 차이는 t-test를 사용하여 평가하였으며 95% 유의수준을 인정하였다.

식물에 존재하는 많은 phytochemical 중 폴리페놀 화합물이나 플라보노이드류는 여러 가지 식물에 널리 분포되어 있으며 천연 항산화제로써 작용할 수 있다는 여러 연구들이 행해져 왔다. 이에 따라 본 연구에서는 92종의 한약재로부터 물과 60% ethanol을 용매로 하여 phenol성 물질을 추출하여 총 페놀함량을 측정한 결과 Table 1에서와 같이 물 추출물에서는 Rubus coreanus Miquel(복분자)가 37.1 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 60% ethanol 추출물에서 역시 복분자 추출물이 가장 높은 함량을 나타내었고 다음으로 Evodia officinalis(오수유) 추출물이 15.8 mg/g으로 다른 시료에 비해 높게 나타났다. 경북지방에 많이 재배되고 있는 Saururus chinensis(삼백초)의 경우 각각 물과 60% ethanol 추출물에서 각각 6.2 mg/g과 6.4 mg/g의 phenolic 성분이 함유된 것으로 나타났다. 실험에 사용한 시료 대부분은 물과 60% ethanol 추출물의 함량이 비슷하거나 60% ethanol 추출물이 조금 높은 페놀함량을 나타내었다.

HA는 고분자 다당으로 진피층의 섬유아세포에서 산출되어, 표피, 진피에 주요한 세포외 매트릭스로 glucuronic acid와 glucosamine이 반족해서 연결된 점액성 moucopolysaccharide 이다. 그리고, 염증 형성의 중요 요소인 macrophage의 phagocytic ability를 저해하는 한편, HA 분해 산물 혹은 저분자 HA는 상처 치유과정에서 inflammation, fibrosism, collagen deposition을 증가시키는 것으로 고분자 HA의 분해효소인 HAase의 저해에 의해 HA의 고분자 형태를 유지하게 함으로서 항염증 효과를 기대할 수 있다. 따라서 in vitro test로서 HAase 활성을 측정함으로서 항염증효과를 탐색하게 되고, 항염증활성을 이용한 항염증제제나 아토피관련 제품에 적용이 가능하게 될 것이다(21,22). 여러 가지 한약재 추출물을 이용하여 HAase 저해 활성을 측정한 결과 Table 2에서와 같이 Evodia officinalis(오수유) 물 추출물이 86.8%의 저해 활성으로 가장 높게 나타났으며, Thuja orientalis(측백엽, 80.8%), Carthami semen(홍화자, 66.5%), Melia azedarach(천련자, 74.7%), Siegesbeckia pubescens(희렴, 61.3%), Saururus chinensis(삼백초, 49.15%) 등이 비교적 높게 나타났다. 60% ethanol 추출물에서는 93.2%와 93.13%의 저해활성을 나타낸 Ailanthus altissima(저근백피)와 Saururus chinensis(삼백초) 추출물이 가장 높게 나타났고, Siegesbeckia pubescens(희렴), Armeniacae Semen(행인), Kalopanax pictus(해동피), Piper nigrum(호초), Polygonatum falcatum A. Gray(황정) 추출물이 80% 이상의 높은 항염증 활성을 나타내었다. 여러 가지 한약재 추출물을 이용하여 항염증 억제 효과를 조사한 결과 삼백초가 물 추출물과 ethanol 추출물 모두에서 높은 항염증활성을 나타내어 염증 억제를 위한 시료로 선발되었다.

삼백초 추출물의 고형분에 포함된 phenolic 화합물의 함량은 매우 낮게 나타났으며(Fig. 1-A), phenolic 화합물 함량이 낮은 고형분의 생리활성 역시 매우 낮은 수준으로 나타났다(Fig. 1-B). 따라서 생리활성은 삼백초 추출물에 함유되어있는 phenolic 화합물에 의해 효과가 좌우 될 것으로 판단되었다. 위의 결과에 근거하여 삼백초로부터 생리활성에 관여하는 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 선별된 삼백초의 유효성분을 보다 효율적으로 추출할 방안을 확립하기 위하여 인체에 유해하지 않은 용매로 물과 에탄올을 선택하여 추출 시간, 용매의 농도에 따라 추출되는 phenolic 화합물의 함량을 측정하였다. 식물체에 존재하는 phenolic 화합물은 식물의 방어기작으로 생산되는 2차 대사산물의 한 종류이며, 분자구조 내에 존재하는 phenolic hydroxyl기에 의해 단백질 등 거대 분자들과 결합하는 특성을 나타내어 다양한 생리 기능을 가진다고 보고되어 있다(23,24). Ethanol 농도에 따른 phenolic 화합물의 함량을 측정한 결과 Fig. 2-A에서와 같이 10% ethanol에서 11.3 mg/g, 30% ethanol에서 12.8 mg/g, 50% ethanol에서 15.3 mg/g으로 ethanol의 함량에 따라 지속적으로 증가하다 60% 이상의 ethanol 농도에서는 추출 수율이 오히려 감소하는 경향을 나타내었으며, 물을 용매로 쓰는 것 보다 ethanol 50%로 추출하는 것이 보다 효율적인 것으로 나타났다. 50% ethanol을 용매로 하여 삼백초를 일정 시간 단위로 phenolic 화합물을 추출하고 함량을 측정한 결과 Fig. 2-B에서와 같이 12시간 추출하였을 때 13.04 mg/g으로 가장 높은 추출 수율을 나타내었으며, 12시간 이후는 추출수율이 비슷한 수치로 유지됨을 알 수 있었다. 따라서 삼백초의 생리활성 물질의 추출을 위한 최적조건은 50% ethanol을 용매로 하여 12시간 추출하는 것이 최적이었다.

삼백초 추출물 첨가농도에 따른 염증억제 활성은 Fig. 3에서와 같이 추출물을 100~250 μg/mL phenolic 화합물 농도로 첨가했을 때 70~80%의 염증 억제 활성(HAase 억제 효과)이 높게 나타났으며, 250 μg/mL까지 첨가 농도가 높아지면서 억제 활성은 농도 의존적으로 증가하는 것으로 확인되었으나, 500 μg/mL 이상의 농도로 phenolic 화합물 첨가 시 억제활성이 오히려 감소하는 경향을 나타내었는데, 추출물의 사용 농도를 250 μg/mL 이하로 사용하여야 경제적으로 유리하며 그 이상의 농도에서는 오히려 약효가 떨어져, 경제적 사용 기준점을 제시해주는 자료로 활용할 수 있을 것으로 판단하였다.

Fig. 1. The content of phenolic compound in extracted solid (A) and anti-inflammatory activity of extracted solid and phenolic (B) from Saururus chinensis. The data were expressed as the mean±SD (n=6), *p<0.05.

Download Original Figure

Fig. 2. Effect of ethanol concentration and extraction time on extraction of phenolic compound from Saururus chinensis. The data were expressed as the mean±SD (n=6), *p<0.05.

Download Original Figure

초미세 분쇄 기술은 해당 물질의 표면적을 극대화시킴으로 분해가 어려운 물질들의 용해도를 높이는 장점이 있다. 또한 상대적으로 유용성 물질인 penolic 화합물의 추출 수율을 높이고 추출 또한 용이하게 된다. 이러한 초미세 분쇄 기술은 1차 가공처리 기술을 넘어서 기존 한약재의 용해도를 증진시킴으로(체내 흡수율 증가) 기능성 식품소재나 식의약 소재 등 고부가 가치소재로 전환을 기대할 수 있다(25).

본 연구에서는 초미세 분쇄 가공 기술을 이용하여 phenolic 화합물의 추출수율과 생리활성을 탐색하여 선별된 시료의 고부가가치성을 높이고자 하였다. 선별된 시료 중 항염증 활성 효과가 뛰어난 삼백초를 미세분쇄와 초미세분쇄하여 각각의 phenolic 화합물의 추출수율과 염증억제 활성을 비교하였다. 그 결과 Table 2에서와 같이 물보다 에탄올을 이용하는 것이 효과적이며, 초미세 분쇄를 하였을 때 추출 수율이 더욱 증가하는 것을 알 수 있었다(26). Cho 등(27)이 보고한 홍삼의 입자 크기에 대한 추출수율이 원형삼에 비해 10~40 mesh로 분쇄 하였을 때, 1.56배 높아진다는 보고와 같이 입자가 작아질수록 추출수율이 높아짐을 알 수 있었다.

미세분쇄와 초미세분쇄의 유용성 물질 추출에 대한 비교로서 삼백초 물 추출물과 50% EtOH 추출물의 염증 억제효과를 비교한 결과 Table 2에서와 같이 분쇄하지 시료에 비해 초미쇄 분쇄한 시료에서 항염증 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다. 앞에서 추출수율에 미친 초 미쇄 분쇄의 결과에서 알 수 있듯이 초미세 분쇄에 의해 생리활성물질들이 더 많이 용출되어 나온 결과로 판단되었다. 분쇄 종류별로 비교하면 물 추출물의 경우 미세보다 초미세 분쇄 삼백초가 15.8%정도 HAase 저해활성이 우수하였으며, 50% EtOH 추출물의 경우도 초미세 분쇄 시료가 16.3%가량 우수한 HAase 저해활성을 가졌으며, 삼백초 물추출물 보다 EtOH추출물이 20% 이상 우수한 HAase 저해활성을 가졌다. 이는 Heo 등(28)이 아토피 유도군 실험에 감시료를 초미세 처리하여 사용하였을 때 미세분쇄하지 않은 시료에 비해 보다 우수한 효과를 나타내었다는 결과와 유사한 결과를 보임을 알 수 있었다.

따라서 약용식물 중에서 삼백초 추출물의 HAase 활성억제 효과가 우수하였으며, HAase 활성과 연관된 항염증 효과도 우수하리라 추측되었으며, 초미세 분쇄 기술을 삼백초에 적용하였을 때 HAase 억제 물질에 대한 추출수율의 증가 효과를 기대할 수 있었다. 또한 초미세 분쇄 기술은 다양한 한약재로부터 생리활성물질 추출수율의 증가를 목적으로 적용할 수 있는 기술로 개발이 가능할 것으로 판단되었다.

Fig. 3. Inflammation inhibition effect based on phenol concentration. The data were expressed as the mean±SD (n=6), *p<0.05.

Download Original Figure