종양이식 모델 쥐에서 동결건조 시판 막걸리가 종양성장에 미치는 영향

본 연구에 사용된 막걸리는 마켓에서 판매되고 있는 장수막걸리(Seoul Jangsu Co., Ltd., Jincheon, Korea)를 구입하였고 실험을 위하여 막걸리를 동결 건조물로 만들어 실험에 이용하였다. 동물실험에는 정수된 물을 이용하여 막걸리 total 동결건조물 100 mg/kg·day;막걸리추출물 저 농도군(ML), 500 mg/kg·day;막걸리추출물 고농도군(MH), 양성대조군으로 항암제인 5-fluorouracil(5-Fu)는 18 mg/kg·day의 양으로 준비하여 생쥐에게 경구 투여하여 효과를 확인하였다.

종양유도에 사용된 세포 주는 위암세포인 AGS human gastric carcinoma cell을 사용하였는데 세포를 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 10% FBS, 항생제가 들어있는 RPMI1640배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. 마우스 한 마리당 1.5 plate에 2×106 cell/100 μL 배지 씩 세포현탁액을 만들어 이용하였다.

실험동물은 5주 령 male nude mice를 라온 바이오(Yongin, Korea)에서 구입하여 이용하였다. Male nude mice는 온도, 50% 습도항습, 그리고 12시간 광주기의 일정한 환경에서 사육하였고 실험기간동안 사료와 식수는 자유롭게 섭취하도록 제공하였다. 1주 안정화 후 mice는 무작위 배정하여 정상 군(None), 종양유도군(Induction), 막걸리추출물 저 농도 군(ML), 막걸리추출물 고농도군(MH), 양성대조군(Fu) 4마리씩 5그룹으로 나누었다. 준비된 위암 세포 주 AGS 세포 (3×106/100 μL)와 100 μL matrigel을 섞어 none 그룹을 제외한 나머지 생쥐의 뒷다리 양쪽에 주사기로 주입하여 종양을 유도하였다. 정상 군 그룹은 AGS 세포 대신 PBS 100 μL를 이용하였다. 주입 후 2주 후부터 매일 정상 군과 종양유도군 그룹에는 물을, 각 그룹에는 준비된 샘플 ML, MH, Fu를 200 μL 씩 7주간 경구 투여하고 매주 생쥐의 무게를 측정하였다. 해부 시 각 군별로 모아서 사진 찍고, 종양을 떼어 무게와 크기측정을 하였다. 종양의 크기는 종양의 가로, 세로 길이를 측정한 다음 기존실험의 방법과 동일하게 V=a×b2/2(a:긴 부분의 지름, b:짧은 부분의 지름)의 계산식으로 측정하였다. 동물실험은 한국식품연구원 동물연구윤리위원회의 허가 하에 이루어졌다(KFRI-M-15004).

세포는 24 well plate에 배양하였고 시판막걸리 동결건조물(M100, 250, 500, and 1000 μg/mL)을 24시간 동안 처리한 후 세포 내 Caspae-3/7활성은 MuseTM Caspase-3/7 assay kit(Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 측정하였다.

모든 값은 평균±표준 오차로 나타낸 것이며 통계처리는 IBM SPSS Statistics(2.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하였고 non-paired t-test를 시행하였다. 확률적 유의성은 0.05이하로 간주하였다.

시판 막걸리 동결건조물의 암 예방 효능을 검증하기 위하여, AGS위암 세포 주가 이식된 누드마우스 모델에 경구 투여를 실시하여 평가하였다. 그림 1A,B,C에서 보여주는 바와 같이 각각을 AGS위암 세포 이식 군(Induction), AGS위암 세포 이식+시판막걸리 동결건조물 100 mg/kg·day군(ML), AGS위암 세포 이식+시판막걸리 동결건조물 500 mg/kg·day군(MH), AGS위암 세포 이식+5-FU 18 mg/ kg·day군으로 나누어 경구 투여를 실시하였다. 7주가 지난 후 각각의 마우스를 희생시킨 후 종양의 크기와 무게를 측정하였는데 AGS위암 세포 이식 군(Induction)에 비해 ML 및 MH군은 같이 종양의 크기와 무게가 유의하게 감소되는 것을 관찰 할 수 있었다. 이때 5-FU는 잘 알려진 항암제로서 양성대조군으로 사용하였다. 이들의 결과로 시판 막걸리는 동물모델에서 종양의 성장을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 본 연구진에서 이미 보고한 제조된 막걸리의 암 성장억제효능이 시중에 판매되고 있는 막걸리에서도 나타나고 있음을 알 수 있다.

Fig. 1. The effects of Makgeolli on the size and weight of tumor in AGS gastr ic cancer xenograft model. Induction, AGS cell inoculation; ML, AGS cell inoculation with MK at 100 mg/kg·day; MH, AGS cell inoculation with MK at 500 mg/kg·day; 5-FU, AGS cell inoculation with 5-FU at 18 mg/kg·day. Data are expressed as mean±SD. *p<0.05 vs. induction.

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지금까지의 막걸리에 대한 연구는 막걸리의 미생물을 동정하고, 조절하는 연구와 막걸리의 일반성분분석을 통하여 특성을 규명하는 연구가 주를 이루었었다(16,17). 그러나 최근에 들어와 막걸리의 기능성이 주목받기 시작하였고, 몇몇의 연구자들을 통해 막걸리의 생리활성이 예측되는 성분들이 밝혀졌으며, 막걸리의 균주의 생리활성, 막걸리 자체의 생리 활성 등 그 연구 범위가 다양해지고 있다(9-14). 특히 최근 막걸리에 포함되어 있는 파네졸이 강력한 항암물질이라는 사실이 보고됨에 따라 막걸리의 암 예방 효능에 대한 기대가 더욱 커지게 되었지만, 지금까지 막걸리의 암 예방 효능에 대한 연구는 in vitro수준에서 머물러 있었다(13,18). 이에 본 연구진은 시판 막걸리를 알콜과 수분만을 제거한 동결건조물을 만들어 암 예방 효능을 평가한 결과 AGS위암 세포가 이식된 동물모델에서 종양의 성장을 억제하는 것을 발견할 수 있었다. 이는 기존에 연구자들에 의해 밝혀진 바와 같이 막걸리의 주재료인 쌀, 누룩, 효모 안에 포함되어 있는 다양한 생리활성성분이 역할을 한 것으로 보이고 이 성분들 중 기존에 알려진 바와 같이 파네졸(farnesol) 등의 강력한 항암 성분들의 역할이 클 것으로 예상하고 있다(9-14). 다만 본 연구에서는 어떠한 성분이 이러한 종양성장억제에 강력하게 작용할 것인지에 대한 실험은 실시하지 않았고, 막걸리의 종양의 성장억제 능에 있어서 다양한 Cancer바이오마커에 대한 영향평가 또한 실시하지 않았다. 추후 연구에서는 이러한 성분들에 대한 연구와 관련 바이오마커의 동정에 대한 연구가 뒤따라야 할 것으로 사료된다. 그럼에도 불구하고 본 연구에서는 막걸리가 암 예방 효능을 나타낼 수 있음을 처음으로 보고한 것으로 의의가 있고 향후 화학적 암 예방을 위한 천연 소재로서 쓰일 수 있음을 예상하게 되었다.

다음으로 시판막걸리 동결건조물의 투여가 경구 투여 중 안전성을 평가 할 수 있는 지표인 체중에 미치는 영향을 평가하였다. Fig. 1에서와 같은 조건에서 각각을 대조군, AGS위암 세포 이식 군(Induction), AGS위암 세포 이식+시판막걸리 동결건조물 100 mg/kg·day군(ML), AGS위암 세포 이식+시판막걸리 동결건조물 500 mg/kg·day군(MH), AGS위암 세포 이식+5-FU 18 mg/kg·day군으로 나누어 경구 투여를 실시할 때 체중의 변화를 1주일에 한번 씩 측정하였다. 그림 2에서 보는바와 같이 각각의 군에서 체중감소에 있어서 어떠한 유의적인 변화는 없었다. 이들의 결과로 시판 막걸리는 동물모델에서 경구 투여에 의한 종양의 성장을 억제할 때 안전성에 별다른 문제가 없을 것으로 예측되었다. 이들의 모든 결과로 시판막걸리 동결건조물의 투여는 종양의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며 체중 감소 등의 부작용을 보이지 않았다. 이들의 결과를 토대로, 향후 시판막걸리의 다양한 암 세포모델 계에서의 암 예방 효능검증, 암 관련 작용기작 연구, 암 예방 활성성분 도출 등에 대한 연구가 수반 되어야 할 것이다.

Fig. 2. Body weight change between group in AGS gastr ic cancer xenograft model. Con, untreated; Induction, AGS cell inoculation; ML, AGS cell inoculation with MK at 100 mg/kg·day; MH, AGS cell inoculation with MK at 500 mg/kg·day; 5-FU, AGS cell inoculation with 5-FU at 18 mg/kg·day. Data are expressed as mean±SD. *p<0.05 vs. induction.

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마지막으로 시판막걸리 동결건조물이 AGS위암 세포 주에서 암 세포의 사멸을 유도하는 데 있어 중요한 타겟인 Caspase-3/7의 활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보았다. 그림 3에서 보는바와 같이 시판막걸리의 동결건조물을 AGS위암 세포 주에 농도 의존적으로 처리 후 Caspase-3/7의 활성을 측정한 결과, 대조군(Con)에 비해 시판막걸리 동결건조물 처리 군(M)에서 농도 의존적으로 Caspase-3/7의 활성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 막걸리의 AGS위암 세포 주에서 동물실험과 유사하게 종양의 증식을 억제할 수 있을 것으로 판단되어지며 이는 Caspase-3/7의 활성화를 통해 이루어 질 것으로 예측할 수 있었다.

Fig. 3. Effect of Makgeolli on caspase-3/7 activity in AGS cells. Cells were treated with dealcoholized commercial Makgeolli (M) for 24 hr in a dose-dependent manner, and then caspase-3/7 activity was measured by MuseTM Caspase-3/7 kit (A). Data were presented as graph (B).

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