db/db 마우스에서 Ceriporia lacerata 균사체 배양액이 GLUT4 발현에 미치는 영향

본 실험에 사용한 균주는 ㈜월드바이오텍(World Biotech Co., LTD., Sangju, Korea)에서 보유한C. lacerata 균사체를 potato dextrose agar(PDA, Difco. Co., Maryland, USA) 배지 에 접종하여 25℃에서 9일 동안 배양하여 사용하였다. C. lacerata 균사체를 전분 4 g/L, 포도당 20 g/L, 정제수 600 mL을 혼합하여 만든 액체 배지에서 pH 5, 온도 23℃, 회전 속도 300 rpm으로 10일 동안 전배양하였다. 전배양이 종료 된 균사체 배양액을 설탕 12.5 g/L, 탈지대두분 2.5 g/L, 소포제 0.125 g/L, 정제수 400 L를 혼합하여 만든 액체 배지 에 옮겨 pH 5, 온도 23℃, 공기주입량 1.0 kgf/cm², 회전 속도 100 rpm으로 9일 동안 배양하였다. 배양한C. lacerata 균사체 배양물을 농축 건조(CL01)하여 건조 중량을 기준으 로 각 실험군의 용량에 맞게 사용하였다. 실험에 사용된 metformin은 다림바이오텍 사(Glupa Tab. 500 mg, Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였고, GLUT4, IRS1, Akt2, beta-actin primer는 제노텍(Daejeon, Korea)에서 구입하였 고, p-IR, p-PI3K, p-Akt, p-AMPK, GLUT4 항체 및 그 외 시약은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입 하였다.

GLUT4 유전자 발현을 평가하기 위해 마우스 근육세포 (C2C12 myoblast)를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였 다. C2C12 myoblast 세포를 2×10⁴ cells/mL로 10% FBS를 첨가한 고농도 glucose(4.5 g/L) DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂로 조정된 CO₂ 배양기에서 72 시간 동안 배양한다. 세포 가 약 80% confluent 해졌을 때 2% horse serum이 첨가된 DMEM배지로 교환한 후 4일간 배양하여 근육세포로 분화 하였다(24). 분화한 세포를 6 well plate에 1×10⁶ cells/mL로 분주하여 CL01을 각각 100, 250, 500 μg/mL로 처리하여 24시간 배양 후 세포를 수거하여 PCR을 수행하였다.

실험동물은 5주령의 수컷 C57BLKS/J-db/db 마우스 (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea)를 구입하여 7일간 순화시킨 뒤 실험에 사용하였다. 동물은 온도 23±3℃, 상대 습도 55±15% 및 12시간 명암주기로 조절되는 환경에서 사육하였다. 실험동물은 케이지당 3마리 이하로 배치하여 사육하였으며, 실험기간 동안 사료는 Teklad certified irradiated global 18% protein rodent diet(2918C, Harlan Co., Ltd., Indiana, Indianapolis, USA)를 자유 급이하였고, 음수 는 여과된 살균 정제수를 자유롭게 섭취시켰다.

각 실험군당 5마리씩 절식 혈당을 측정하여 각 군의 평균 혈당값이 균등하게 되도록 무작위 배치하였다. 실험군은 음성대조군(멸균주사용수(Daihan Pharm Co., Ltd., Seoul, Korea))(G1), CL01 300 mg/kg 투여군(G2), 양성대조군(메 트포민 300 mg/kg)(G3)으로 구성하여 4주간 사육하였다. CL01 투여군은 CL01을 멸균주사용수(Daihan Pharm Co., Ltd., Seoul, Korea)에 녹여 경구 투여용 존데와 주사기를 이용하여 10 mL/kg를 투여하였고, 음성대조군과 양성대조 군은 각각 동일한 용량의 멸균주사용수와 멸균주사용수에 녹인 메트포민을 경구 투여하였다. 4주 동안 주 1회 체중 및 혈당을 측정하였다. 혈당은 미정맥에서 혈액을 채취하 여 glucometer(G-Doctor, AllMedicus Co., Ltd., Anyang, Korea)로 측정하였다. 동물실험은 경기바이오센터 동물실 험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 수행하였다.

실험 종료 후, 실험동물을 4시간 절식시키고 isoflurane으 로 마취하여 개복한 후 후대정맥에서 혈액을 채취했다. 채 취한 혈액을 clot activator가 들어있는 vacutainer tube에 넣 어 실온에서 30분 이상 응고시킨 후 원심분리(4,000×g, 10 min)하여 혈청을 새 tube에 담은 후 분석을 위해 –70℃에서 보관하였다. 포도당 농도는 혈액생화학기기(Adiva 2120, SIEMENS, Munich, Germany)를 이용하여 측정하였고, insulin 및 c-peptide는 각각의 kit(AKRIN-011T, AKRCP-031, Shibayagi, Japan)를 이용하여 측정하였다. 측정한 포도당, insulin 농도를 이용하여 인슐린 저항성을 나타내는 Homeostatic Model Assessment-Insulin Resistance(HOMA-IR) 는 Matthews 등(24)의 방법으로 계산하였다.

채혈이 끝난 실험동물의 다리의 비복근 및 가자미근을 적출하였다. 적출한 근육을 잘게 분쇄하여 lysis buffer를 이용하여 protein을 분리하였다. 분리한 protein을 BSA kit를 이용하여 protein을 정량하고 동일한 protein 양으로 희석하 여 acrylamide gel에 전기영동하고 nitrocellulose membrane 에 옮긴 후 일차 항체 pIR, pAkt, pAMPK 및 GLUT4로 반응시켰다. Membrane 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 ECL solution kit이 포함된 용액에 1분간 반응시 킨 후 Chemidoc(Proteinsimple, FlowChem®, Düsseldorf, Germany)으로 단백질 발현을 분석하였다.

Western blot 시 적출한 근육 15 mg 및 CL01을 처리한 C2C12 세포를 각각 trizol을 사용하여 total RNA를 추출한 후 NanoVueplus spectrophotometer(GE healthcare, Wisconsin, USA)를 이용하여 정량하고 Reverse transcription mixture (Improm-Ⅱ, Promega, Wisconsin, USA)을 이용하여 cDNA 를 합성하였다. cDNA를 합성한 후 세포 내 포도당 수송에 특이적인 primer(Table 1)을 이용하여 각각의 조건(Table 2)으로 PCR을 수행하였다.

모든 실험 결과는 평균값과 표준편차로 나타냈다. SPSS Statistics 22 for Medical Science(SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)를 이용하여 Student’s t-test로 유의성을 확인하였으 며, 음성대조군과 CL01 투여군 간의 비교를 실시하였다. p<0.05인 경우 통계학적으로 유의하다고 판정하였다.

마우스 근육세포에서 CL01 처리에 따른 GLUT4 mRNA 발현양을 확인한 결과(Fig. 1), 근육세포에 CL01을 각각 100, 250, 500 μg/mL로 처리했을 때 GLUT4 유전자가 음성 대조군 대비 각각 약 180%, 178%, 189%(p<0.01) 발현되었 다. 본 연구에서 CL01 처리를 통해 근육세포에서 GLUT4 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Effects of CL01 on GLUT4 mRNA expression in C2C12 cell. Control, negative control; CL1, CL01 treated at 100 ㎍/mL; CL2, CL01 treated at 250 ㎍/mL; CL3, CL01 treated at 500 ㎍/mL. Data are expressed as mean±SE (n=3). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. **Significantly different from control (p<0.01).

Download Original Figure

4주간 CL01 투여에 따른 체중 변화를 살펴보기 위해 주 1회 체중을 측정하였다(Table 3). 체중 측정 결과, 모든 실험군에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았으며 실험 기간 내내 체중이 증가하는 경향을 보였다. 실험기간 동안의 혈 당 변화를 측정하기 위해 주 1회 체중 측정 후 혈당을 측정 하였다(Fig. 2). 투여 1주차에 CL01 투여군의 혈당이 증가하 여 음성대조군과 혈당 수치가 비슷하지만 2주차부터 혈당 이 감소하여 음성대조군보다 약 12.3% 혈당 수치가 낮게 측정 되었고, 시험 종료 시 양성대조군의 약 110% 수준 (475.40±31.16 mg/dL)으로 감소하였다. 4주간의 혈당 변화 를 관찰한 결과, CL01이 전문 혈당강하제에 비해 속효성은 낮으나 장기 투여 시 전문 혈당강하제의 약 66% 수준의 혈당 강하 효력이 있는 것을 알 수 있었다.

Fig. 2. Changes in blood glucose levels in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. **Significantly different from G1 (p<0.01).

Download Original Figure

시험 물질 섭취 4주 후 동물을 희생하여 혈장 내 혈당, 인슐린, c-peptide 농도를 측정하고, HOMA-IR 수치를 계산 하였다. 먼저, 혈장 내 혈당 수치를 살펴보면 음성대조군에 비해 양성대조군은 유의적으로 혈당이 감소하였고 (p<0.05), CL01 투여군에서 유의성은 나타나지 않았지만 소폭 감소하였다(Fig. 3). 혈장 내 인슐린 농도를 측정한 결과, 양성대조군의 경우, 음성대조군 대비 약 65% 감소하 여 1.43±0.29 ng/mL(p<0.05)의 농도를 나타냈고, CL01투여 군의 경우, 음성대조군 대비 인슐린 농도가 약 55.8% 감소 하여 1.83±0.47 ng/mL(p<0.05)의 농도를 나타냈다(Fig. 4). 혈장 내 c-peptide 결과를 살펴보면 4주간 시험물질 투약 후 인슐린 농도의 감소와 유사한 형태로 감소한 것을 알 수 있다. 시험 종료 후 양성대조군의 c-peptide 농도는 음성 대조군의 약 20% 수준인 87.56±28.50 pg/mL(p<0.01)의 농 도를 나타냈고, CL01 투여군에서는 음성대조군의 약 40% 수준인 172.69±54.72 pg/mL(p<0.05)의 농도를 나타냈다 (Fig. 5). 분석한 혈액생화학적 지표를 이용하여 인슐린 저 항성을 반영하는 지표인 HOMA-IR 수치를 계산한 결과, 양성대조군에서는 음성대조군 대비 약 74% 인슐린 저항성 이 개선되었고(p<0.01), CL01 투여군에서는 음성대조군 대 비 약 62% 개선되었다(p<0.05)(Fig. 6). 혈장 내 인슐린과 c-peptide 농도는 인슐린 분비의 지표이며, 동시에 인슐린과 c-peptide는 proinsulin의 구성 요소이다. Proinsulin이 분해 되면서 생기는 인슐린은 혈중 안정성이 낮아 분해가 잘 되는 반면 c-peptide는 혈중 안정성이 높아 장시간에 걸친 인슐린 분비능을 확인하는 지표로 활용 가능하다(25). 인슐 린 저항성은 혈당은 동일하되 인슐린 수치가 상이한 서로 다른 개체에서 동일한 혈당을 유지하는데 더 많은 인슐린이 필요하여 그만큼 단위 인슐린의 작용이 떨어졌다는 것을 의미한다(26). 제 2형 당뇨병 환자의 90% 이상에서 인슐린 저항성이 생겨 고인슐린혈증이 유발되고(27), 당내성 장애, 당뇨병, 고혈압, 비만 등의 인슐린 저항성 증후군 유병률이 인슐린의 농도가 증가할수록 증가하며 인슐린 농도가 낮은 경우보다 대사 이상이 생길 확률이 증가한다(28). 본 연구에 서는 CL01의 섭취에 따라 인슐린 저항성이 개선되며 그에 따라 인슐린, c-peptide 및 혈당을 낮추는 것을 알 수 있다.

Fig. 3. Effects of CL01 on plasma glucose levels in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. *Significantly different from G1 (p<0.05).

Download Original Figure

Fig. 4. Effects of CL01 on plasma insulin in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. *Significantly different from G1 (p<0.05).

Download Original Figure

Fig. 5. Effects of CL01 on plasma c-peptide in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. *,**Significantly different from G1 (p<0.05, p<0.01).

Download Original Figure

Fig. 6. Effects of CL01 on plasma HOMA-IR in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. *,**Significantly different from G1 (p<0.05, p<0.01).

Download Original Figure

CL01이 근육세포에서 포도당 수송체 발현에 미치는 영 향을 확인하기 위해 시험 물질을 4주간 투여 후 동물을 희생하여 근육세포를 채취하여 포도당 수송체 발현에 관여 하는 유관 단백질 및 mRNA 발현을 측정하였다. Western blot으로 근육세포에서의 단백질을 측정한 결과(Fig. 7), CL01 투여군과 양성대조군에서의 pIR, pAkt, pAMPK 및 GLUT4 단백질 발현이 음성대조군과 비교하여 증가하였 다. 특히 CL01 투여군에서의 pAkt와 GLUT4 단백질 발현양 이 양성대조군 대비 각각 약 10%, 23.6% 증가하였고, pIR와 pAkt 그리고 GLUT4 단백질의 발현양이 음성대조군 대비 각각 약 153%, 145%, 167%(p<0.01) 수준으로 발현되었다. mRNA 발현양을 확인한 결과(Fig. 8), CL01 투여군과 양성 대조군에서의 Akt2, IRS1 및 GLUT4 발현이 음성대조군과 비교하여 증가하였고 CL01 투여군에서의 Akt2와 IRS1이 음성대조군 대비 각각 약 129%, 149%(p<0.05) 발현되었다. 본 연구에서 CL01 섭취를 통해 포도당 수송체 발현과 관련 된 단백질 및 mRNA 발현이 증가하였으며 그에 따라 GLUT4의 발현이 증가하여 혈당 감소에 영향을 미친 것을 확인할 수 있었다. 그리고 CL01 섭취 시 인슐린을 통한 IR의 인산화(pIR)에 도움을 주어 IRS1, Akt2, GLUT4의 유 전자 발현이 연속적으로 이루어져 GLUT4 translocataion을 증가시켜 혈당 감소 효과를 보이며 이는 양성대조군으로 사용한 메트포민과 유사한 기전으로(30), 인슐린에 의한 당 흡수 증가 기전과 다르게 AMPK 활성으로 인한 GLUT4 증가에서 기인한 세포내 당 유입 촉진에 따른 혈당 강하를 확인할 수 있었다. 일반적으로 담자균류에 속하는 버섯의 β-glucan, heteroglyca, galactan 등의 비소화성 수용성 다당 류가 혈당 강하에 우수한 효능을 나타내는 성분으로 알려져 있고(31,32), Kim 등의 연구(33)에서는C. lacerata 균사체 배양 대사산물인 세포외다당체 성분이 인슐린 분비 세포를 덱사메타손의 독성으로부터 보호한다고 보고된 바 있다. 상기의 결과에 비추어 볼 때C. lacerata 균사체 배양 대사산 물인 다당류 등이 항당뇨 활성을 나타내는 것으로 추측할 수 있으며 추후 C. lacerata 균사체 배양물의 기능 성분을 규명하기 위한 기초 증거로 활용할 수 있을 것이다.

Fig. 7. Effects of CL01 on protein expression in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. *,**Significantly different from G1 (p<0.05, p<0.01).

Download Original Figure

Fig. 8. Effects of CL01 on mRNA expression in C57BL/KsJ-db/db mice fed diets supplemented with CL01. G1, negative control; G2, CL01 administered at 300 mg/kg; G3, positive control (metformin administered at 300 mg/kg). Data are expressed as mean±SE (n=5). The results were statistically analyzed by Student’s t-test method. *Significantly different from G1 (p<0.05).

Download Original Figure