오디 당침출액의 HepG2 세포에서 H₂O₂로 야기된 산화적 스트레스 보호 효과

본 실험에 사용된 오디(Morus alba)는 2014년 전북 고창 에서 생산된 것으로 고창 농가를 통해 직접 구입하여 전통 적인 방법에 따라 오디 침출액을 제조하였다. 즉, 잘 익은 오디를 꼭지와 이물질을 제거하여 동량의 설탕(Qone white sugar, Samyang Co., Ulsan, Korea)을 넣고 밀봉시켜 상온 (18±3℃)에서 40일간 보관하였다. 이후 오디는 건져 내고 얻은 침출액을 4℃의 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하 였다.

오디 당침출액을 10일 간격으로 40일 동안 항산화 효능 을 비교하고, 결과를 바탕으로 시료를 선택하여, 이후 세포 관련 실험에 사용하고자 하였고, 항산화 효능을 측정하기 위해 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하였다. 즉, 0.2 mM DPPH 용액 0.8 mL에 시료 0.2 mL를 첨가하여 혼합한 다음 실온에 서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험에 사용된 세포는 인간 간암세포주인 HepG2로 American Type Culture collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여, 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone, Logan, UT, USA)를 첨가한 DMEM(Hyclone) 배지를 사용 하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양시키고, 세포 밀도가 90%로 포화되었을 때 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

HepG2 세포에 대한 오디 당침출액의 세포 독성 및 산화 적 스트레스에 의한 당침출액의 세포 보호효과 측정을 위해 MTT assay를 시행하였다. 즉, HepG2 세포를 96 well plate에 분주(1×10⁴ cell/mL)하고, 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO₂) 시킨 다음, 시료를 농도별로 세포에 처리하고, 37℃ 배양기 에서 반응시켰다. 24시간 후 500 μM의 과산화수소(H₂O₂)를 처리하고 배양기에서 4시간 동안 방치하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 각 well에 3-(4,5-di-methylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA, 5 mg/mL)을 30 μL씩 넣고 2시간 동안 반응시켜 배양 상등액을 제거하고, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Co.)를 100 μL/well씩 첨가하고 30 분 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

지질과산화물 측정은 세포에 시료를 처리한 후 24시간 배양시켜 250 μM의 H₂O₂를 처리하여 12시간 방치시킨 다 음, 25% trichloroacetic acid(TCA) 1 mL와 0.67% thiobabituric acid(TBA) 1 mL를 첨가하여 95℃에서 30분간 가열하였다. 그 후 n-butanol 4 mL를 첨가하고, 원심분리(3,000 rpm, 30 min) 시킨 다음, 상등액을 취하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지질과산화물은 malondialdehyde(MDA) 의 양으로 환산하여 계산하였다(21).

HepG2 세포 내에서 항산화 효소는 superoxide dimutase (SOD) 및 catalase(CAT)의 활성으로 측정하였다. 배양된 세포에 시료를 처리하고 60분간 반응시켜 trypsin으로 세포 를 걷어내고, phosphate-buffer saline(PBS)로 씻어 준 다음, lysis buffer(20 mM tris, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.2 M sucrose)에서 sonication 하였다. 그 후 1,5000 rpm에서 30분 간 원심분리하여 단백질 추출물을 얻고, 황산화 효소 활성 에 사용하였다. SOD 활성은 50 mM PBS(pH 8.2) 8.7 mL에 세포 상등액을 넣고, 3 mM pryogallol 용액 0.3 mL을 첨가하 여 325 nm에서 흡광도를 측정하였고, CAT 활성 측성은 11 mM H₂O₂를 포함하는 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0)를 시료와 혼합하고, 240 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HepG2 세포를 6-well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주한 후 배양기에서 24시간 동안 배양하여 시료를 처리한 후, 500 μM H₂O₂를 처리하여 12시간 반응시킨 다음, PBS 완충 액으로 2회 세척하여 10% formalin을 처리하여 4시간 고정 시켰다. 그 후, PBS로 세척하고 Hoechst 33342(Sigma- Aldrich Co.)로 30분 동안 염색시키고, PBS로 세척하여 형 광 현미경 하에서 400배로 관찰하였다.

Caspase-3 활성은 ApoAlert caspase-3 colormetric assay kit(Clontech Co., CA, USA)를 이용하여 분석하였다. HepG2 세포를 6-well plate에 1×10⁶ cells/well로 24시간 배양 후, 시료를 처리한 다음, 500 μM H₂O₂를 처리하여 12시간 반응 시킨 다음, 원심분리하여 상등액을 버리고 세포만을 얻었 다. 모아진 세포에 chilled cell lysis buffer를 첨가하여 10분 간 얼음위에 반응시킨 다음, 3분간 원심분리(4℃, 15,000×g) 하여, 상등액을 96-well plate로 옮기고 reaction buffer를 첨 가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 caspase-3 substrate를 첨 가하고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 405 nm에서 흡광 도를 측정하였다.

모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계적 유 의성 검증은 statistical analysis system(SAS, 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하여 one way ANOVA법으로 분산분석을 실시하고, Duncan의 다중 범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 조사 항목들 간의 유의성을 5% 수준에서 검증하였다.

본 실험에서는 오디 당침출액(MSE)을 40일간 저장하면 서 10일 간격으로 항산화 효과 측정을 측정하여 적정 저장 기간을 선정하여 세포 실험에 사용하고자 하였고, 측정 방 법으로는 DPPH radical scavenging을 이용하였다. DPPH radical 소거능은 식물 추출물 및 식품의 항산화 효과 측정을 위한 대표적인 방법으로, MSE의 측정 결과는 Fig. 1과 같다. MSE 최종농도 100 μg/mL에 대하여 저장 기간 동안 DPPH radical 소거능은 증가하여, 저장 30일과 40일에는 각각 65% 및 66%로 다른 저장 기간과 비교하여 유의적으로 높았으 나, 저장 30일과 40일간의 유의적 차이는 없었다. Kim 등 (22)은 오디 에탄올 추출물들(400 μg/mL)에서 59~67%에 DPPH radical 소거능을 나타냈다고 보고한 바 있다. 이상의 결과를 통해 이후 진행되는 세포 실험에는 40일간 저장시 킨 오디 당침출액만을 사용하여 측정하고자 하였다.

Fig. 1. Antioxidant effect of mulberry sugar extracts (MSE) during storage time. The amount DPPH radical was determined spectrophotometrically at 517 nm following incubation with 100 μg/mL MSE for 40 days. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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본 실험에서는 오디 당침출액을 통한 세포 보호 효과를 확인하고자 MTT assay 방법을 이용하여 세포 생존율을 확인하였다. 먼저, HepG2 세포에 대한 MSE의 세포독성을 확인하고자, MSE를 농도별(0.1, 0.25, 0.5%)로 24시간 동안 처리 후 결과를 확인하였고, MSE 처리로 인한 세포독성은 나타나지 않았다(Fig. 2). 앞선 결과를 기초로, HepG2 세포 에 H₂O₂로 산화적 스트레스를 유발시켜 MSE의 세포 생존 율을 확인하였고, 결과는 Fig. 3과 같다. 세포 생존율 확인을 위해 시료를 24시간 동안 0.1, 0.25, 0.5% 농도로 전처리 후, 500 μM의 H₂O₂를 처리하여 확인하였다. 500 μM의 H₂O₂ 를 단독 처리한 세포의 경우, 세포 생존율이 49±5.3%로 감소한 반면, MSE를 농도별로(0.1, 0.25, 0.5%) 전처리 한 세포들의 경우, 69%, 61%, 및 64%로, 세포 생존율이 60% 이상으로 증가하여, H₂O₂로 인한 산화적 스트레스에 대해 MSE의 세포 보호 효과를 확인하였다. 이와 관련하여, Park 등(7)은 오디 추출물 자체 독성에 대해 2.5 mg/mL 이하의 농도로 오디추출물을 HepG2 세포에 처리할 경우 세포독성 없이 세포 생존율이 높았다고 보고한 바 있으며, Kim 등(22) 은 MIN6N β-cell에서 H₂O₂로 야기된 산화적 스트레스에 대해 오디 에탄올 추출물들(100 μg/mL)이 62~73%의 세포 생존율을 나타내었다고 보고한 바 있다.

Fig. 2. Cytotoxic effects of mulber ry sugar extracts (MSE) in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with MSE (0, 0.1, 0.25, and 0.5%) for 24 h, and the cell viability was determined by MTT assay. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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Fig. 3. Cytotoxic effects of mulber ry sugar extracts (MSE) against H₂O₂-induced oxidative stress in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with vehicle or MSE (0, 0.1, 0.25, and 0.5%) in the presence of 500 μM H₂O₂ for 24 h. The cell viability was determined by MTT assay. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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지질과산화는 조직내 ROS 발생으로 인한 인지질 막 내 불포화지방산의 수소를 탈취함으로써 지질과산화(lipid peroxidation)의 연쇄반응이 진행되고, 최종 부산물로 malondialdehyde(MDA)등의 aldehyde를 생성하게 된다. 이 러한 부산물들은 세포나 조직막을 손상, 체액의 손실 및 단백질 변화등을 유발시켜 암, 동맥경화, 고혈압 등의 질병 을 유발하는 원인으로 작용한다(23). 이에, 본 실험에서는 산화적 스트레스로 인한 세포 손상의 증거로 지질과산화 생성물인 MDA를 간접 측정하여 지질과산화물에 대한 MSE의 억제 효과를 확인하고자 하였다(Fig. 4). HepG2 세 포에 아무것도 처리하지 않은 세포의 MDA 농도를 기준으 로, 500 μM의 H₂O₂를 단독 처리한 세포에서는 MDA 농도가 약 2.0배 증가한 반면, 세포에 MSE를 처리한 경우는 1.6배 증가하여, H₂O₂ 단독 처리군과 비교하여 약 0.4배 감소한 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 통해, MSE가 H₂O₂로 야기된 산화적 스트레스로 인한 세포 내 손상으로 증가된 지질과산화물(MDA)를 유의적으로 감소시켜 간세포 손상 을 억제시킴을 확인하였다. 오디에는 cyanidin-3-glucose , cyanidin-3-rutinoside 같은 anthocyanin, resveratrol 및 polyphenol 등이 다량 함유되어 있어 항산화 활성이 높은 것으로 알려져 있어(24,25), 산화적 스트레스와 관련된 만 성질환의 예방에도 도움이 될 것으로 생각된다.

Fig. 4. Effects of mulberry sugar extracts (MSE) against H₂O₂-induced lipid peroxidation in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with vehicle or MSE (0.5%) in the presence of 500 μM H₂O₂ for 12 h. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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항산화 효소인 SOD는 산화적 스트레스에 의해 세포 내 과잉 생성되는 O₂-를 H₂O₂와 산소로 변화시키고, CAT는 H₂O₂를 산소와 물로 변환시키는 역할을 통해 세포 내 radical을 소거함으로 인해 산화적 스트레스를 보호하는 것 으로 알려져 있다(26). 본 실험에서는 H₂O₂로 야기된 산화 적 스트레스로 증가된 radical의 억제시키는 체내 방어기전 인 항산화 효소들의 활성 측정을 통해 MES의 산화적 스트 레스에 대한 보호 효과를 확인하고자 하였다(Fig. 5,6). HepG2 세포에 H₂O₂로 처리하여12시간 동안 SOD 활성을 측정한 결과, 시간 의존적으로 활성이 감소하여 측정 12시 간에 SOD 활성이 41%로 감소한 반면, MSE를 처리한 세포 의 경우, 측정 12시간에 54%로 H₂O₂만을 단독 처리한 세포 와 비교하여 SOD 활성이 10%이상 유의적으로 증가하였다 (Fig. 5). 또한, CAT 활성에서도 H₂O₂만을 단독 처리한 세포 에서는 시간 의존적으로 감소하여 측정 12시간에 46%를 나타낸 반면, MSE를 처리한 세포에서는 53%를 나타내어 H₂O₂ 처리군에 비해 CAT 활성을 유의적으로 증가시킴을 확인하였다(Fig. 6). 이상의 결과는, HepG2 세포에서 H₂O₂ 를 처리로 인하여 떨어진 항산화 효소들의 활성을 MSE가 증가시킴으로 인해 산화적 스트레스로 유발된 세포 내 손상 이 감소된 것으로생각된다.

Fig. 5. Effects of mulber ry sugar extracts (MSE) on antioxidant enzyme activity in H₂O₂ treated HepG2 cells. HepG2 cells were treated with vehicle or MSE (0.5%) in the presence of 500 μM H₂O₂ for 12 h. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05). ■, control; △, 500 μM H₂O₂; ▲, 500 μM H₂O₂+0.5% MSE. SOD, superoxide dismutase.

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Fig. 6. Effects of mulber ry sugar extracts (MSE) on antioxidant enzyme activity in H₂O₂ treated HepG2 cells. HepG2 cells were treated with vehicle or MSE (0.5%) in the presence of 500 μM H₂O₂ for 12 h. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05). ■, control; △, 500 μM H₂O₂; ▲, 500 μM H₂O₂+0.5% MSE. CAT, antioxidant enzyme activity of catalase.

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H₂O₂는 세포에서 많이 발견되는 활성산소종으로, 세포 막 통과가 용이하여 외부자극에 빠르게 반응하여 산화적 스트레스를 증가시킴에 따라 미토콘드리아 막전위를 감소 시켜 미토콘드리아 내부의 cytochrome c 방출을 촉진시켜 caspase-9과 caspase-3의 활성화를 통해 apoptosis를 유발시 키는 것으로 알려져 있다(27). 본 실험에서는 H₂O₂로 야기 된 산화적 스트레스로부터 유도되는 HepG2 세포의 apoptosis의 형태학적 특징을 확인하기 위하여 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하 였다(Fig. 7). 정상세포의 핵은 타원형의 온전한 형태를 나 타내었으나, H₂O₂를 처리한 세포의 핵은 condensation과 fragmentation으로 인한 apoptosis body가 핵 주변에 나타나 는 전형적인 apoptosis 특징을 나타내었다. 반면에, 0.5%농 도의 MSE를 처리한 세포의 핵은 정상세포와 유사하게 타 원형의 온전한 핵 형태를 나타내어, H₂O₂로 야기된 산화적 손상에 대해 MSE가 세포를 보호하고 있음을 확인하였다. 이에 본 실험에서는 MSE의 apoptosis 보호 효과가 caspase-3 와 관련이 있는지 확인하고자 caspase-3의 활성을 확인하였 다(Fig. 8). HepG2 세포에 H₂O₂를 처리한 경우, caspase-3 활성이 control과 비교하여 3.2배 정도 증가한 반면, MSE를 처리한 세포의 경우 2.3배로 감소하였다. 이는, MSE가 H₂O₂로 야기된 apoptosis 과정에서 caspase-3의 활성 억제를 통한 간세포 내 산화적 손상을 감소시켜 세포를 보호한다는 것을 의미한다.

Fig. 7. Protective effect of mulberry sugar extracts (MSE) against H₂O₂-induced apoptosis in HepG2 cells. The cells were treated with MSE and then stimulated with 500 μM H₂O₂ for 12 h. Fixed cells were stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscope (Magnification×400, a: control, b: 500 μM H₂O₂, c: 500 μM H₂O₂+0.5% MSE).

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Fig. 8. Protective effect of mulber ry sugar extracts (MSE) against H₂O₂-induced apoptosis in HepG2 cells. The cells were treated with MSE and then stimulated with 500 μM H₂O₂ for 12 h. The caspase-3 activity was measured by the colorimetric assay. The present data were expressed mean±SD. Means with different letters are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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