단풍취 추출물 및 분획물의 항산화 및 α-glucosidase 저해 활성 평가

본 실험에 시료로 사용한 단풍취(Ainsliaea acerifolia)는 경북 영양군 수비면에서 2013년도 5월에 채취된 신선한 단풍취를 사용하였으며, 표본시료는 대구한의대학교의 바 이오산업융합부 천연물화학실험실에 보관하고 있다.

신선한 단풍취 5.0 kg을 70% 에탄올로 침지추출을 4회 반복하여 필터 한 후 농축하였다. 얻어진 단풍취 70% 에탄 올 추출물(401.0 g)에 대해 물에 현탁하여 저극성 용매인 n-Haxane으로 먼저 추출한 후 수층을 다시 ethyl acetate(EtOAc)와 n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각 각 순차적으로 5회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획 을 감압 농축하여 건조 시킨 후 각각 n-hexane 가용분획 (73.8 g), EtOAc 가용분획(56.0 g), n-BuOH 가용분획(27.9 g), H₂O 가용분획(186.0 g)을 각각 얻었으며 각 분획물을 대상으로 라디칼 소거능 및 α-glucosidase 저해능 평가를 수행하였다.

단풍취 70% 에탄올 추출물의 전자공여능은 Blois 방법 (21)에 따라 측정하였다. 각 시료용액에 120 μL에 0.45 mM 의 희석한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 60 μL 을 넣고 교반한 후 15분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

단풍취 70% 에탄올 추출물의 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid(ABTS) radical 소거능을 Re(22)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 7 mM ABTS(in water)와 2.4 mM K₂O₈S₂동량을 혼합 후 실온, 암소 에서 12시간 방치하여 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS⁺ 라디칼 용액을 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.7~0.8 정도가 되도록 희석한 후 사용하였다. 희석한 ABTS⁺ 라디 칼 용액 100 μL와 생약 추출액 100 μL을 혼합하여 실온에서 7분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로는 (+)-catechin을 사용하였으며 결과는 시 료를 처리하지 않은 군에 대한 %로 표시하였다.

α-glucosidase 저해능은 Eom(23) 등이 행한 방법을 변형 하여 효소-기질반응을 이용한 분광학적 방법으로 측정하였 다. 즉, 1 U/mL α-glucosidase 90 μL에 시료 혹은 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 10 μL를 첨가하여 혼합한 후 37°C에서 15분 동안 반응시킨다. 반응 후 기질인 1 mM p-NPG 100 μL를 첨가한 후 5분간 반응시키고 405 nm에서 ELISA reader(Infinite F200, Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 기질로부터 유리되어 나오는 p-nitriphenol을 측정하였다. 양성대조군 으로는 α-glucosidase 저해제로 알려진 acarbose를 사용하였 으며 α-glucosidase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨 가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(24)에 따라 측정하였으며, 추출물 혹은 분획물을 1.0 mg/mL 농도로 조제한 후, 시료 50 μL와 Folin-Denis 시액 50 μL, 0.7 M 탄산나트륨 포화용액 50 μL를 차례로 넣은 다음 이것을 잘 혼합하여 실온에서 60분 방치한 후 UV/VIS 분광광도계 (Cary 50, Varian, Melbourne, Australia)로 750 nm에서 흡광 도를 측정하였으며, 표준물질은 gallic acid를 이용하여 표 준곡선을 작성하여 양을 환산하였다.

보라색을 띄는 비교적 안정한 유리라디칼인 DPPH는, 그 자체가 홀수전자를 가지고 있어 517 nm에서 강한 흡광 도를 나타낸다. 따라서 항산화능이 있는 물질과 반응하게 되면 안정한 형태로 돌아가면서 색이 탈색되고 흡광도 값이 감소한다(25). Table 1에서 나타낸 것처럼 단풍취 70% 에탄 올 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 라디칼 소거능을 평가한 결과, 125 mg/mL의 농도에서 70% 에탄올 추출물이 66.3%의 라디칼 소거능을 나타내었으며, 특히 EtOAc 분획 물이 125 mg/mL의 농도에서 77.6%의 가장 우수한 라디칼 소거능을 나타내었고, 이 결과는 positive control로 사용된 천연 항산화 성분으로 잘 알려져 있는 (+)-catechin과 같은 농도에서 유사한 활성을 나타냄을 확인하였다. n-BuOH 분 획물 또한 125 mg/mL의 농도에서 68.4%의 우수한 라디칼 소거능을 나타내었으며, H₂O층과 n-Hexane 분획물에서는 각각 43.7%, 7.3% 비교적 약한 라디칼 소거능을 나타내었다.

단풍취 추출물 및 각 분획물에 함유하고 있는 총페놀성 화합물의 함량을 Table 4에 나타내었으며, EtOAc 분획물이 1 g당 22.4 mg의 페놀성 화합물을 함유하는 것으로 나타났 으며, n-BuOH 분획물이 20.1 mg, H₂O층에서는 1 g당 4.3 mg의 페놀성 화합물의 함량이 확인되었다. 또한 n-hexane 분획물이 2.2 mg의 상대적으로 낮은 페놀 함유량을 나타내 는 것으로 분석되었다. 이상의 결과는 단풍취 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Table 1 및 2에서 나타낸 것처럼 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 EtOAc 및 n-BuOH 층에서 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있었으며, DPPH 라디칼 소거능과 총 페놀성 화합물 함량사이에는 밀접한 상관관계가 있다는 보고(26)와도 일치하는 결과였 다.

ABTS⁺ 라디칼 소거능은 시료가 항산화력에 의해 ABTS⁺ 이 소거되어 본래의 청록색이 탈색되는 정도를 측정하는 방법으로 천연소재의 항산화활성물질 개발을 위한 연구에 많이 이용되고 있다(27). 그 결과 Table 2에서 나타낸 것처 럼 단풍취 70% 에탄올 추출물은 125 mg/mL 농도에서는 89.8%의 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였으며, 각 분획물중에서도 특히 EtOAc 및n-BuOH 분획층이 125 mg/mL의 농도에서 99.3% 및 99.0%의 매우 우수한 라디칼 소거능을나타내었으며, 이는positive control인 (+)-catechin의 활성에 상당하는 효능임을 확인하였다. EtOAc 분획층의 62.5 mg/mL의 농도에서 99.1%, 31.3 mg/mL의 농도에서 86.0%의 라디칼 소거능을 나타내어 유의적인 농도 의존적 성향을 보였다. 한편, H₂O 분획층과 n-Hexane 분획층에서 는 상대적으로 낮은 라디칼소거 활성을 나타내었다. Table 3, 4에서 나타낸 것처럼 총 페놀성 함량 상대적으로 높게 나타 난 EtOAc, n-BuOH 층에서 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성물질의 존재가 시사되었으며, 단풍취에 존재하는 sesquiterpene류 (17-20) 이외에 라디칼소거활성을 나타내는 물질의 존재에 대한 보고는 없으며, 특히 EtOAc 및n-BuOH 층에 존재하는 라디칼소거 활성물질의 동정이 필요하다고 사료된다. Fig. 1.

Fig. 1. Liquid-liquid partition of Aisliaea acerifolia.

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Acarbose와 vogilbose 등은 섭취한 탄수화물을 단당류로 분해하는데 관여하는 효소인 α-glucosidase의 활성을 저해 하는 기전으로 연구 개발(28)되어 항당뇨를 목적으로 시판 된 대표적인 당뇨 치료제이다. 그러나 이들을 장기간 복용 할 경우 구토, 설사를 비롯한 복부팽만감 등의 부작용이 뒤따를 수 있으므로 보다 안전하면서 식후 혈당 강하의 효능이 있는 천연소재에 관한 연구의 필요성이 대두되고 있다(29). 본 연구에서 수행한 실험의 결과 단풍취 70% 에탄올 추출물에서는 500 μg/mL일 때 51.4%의 효능을 나타 내었고, EtOAc 분획층과n-BuOH 가용분획은 각각 98.5% 와 82.0%로 상대적으로 강한 활성을 나타났다. 양성대조구 인 acarbose의 IC₅₀값과 비교해볼 때 EtOAc 가용분획은 103.4±1.0으로서 높은 효능을 나타내었다. 최근의 연구(30) 에 의하면 베트남산 도꼬마리(Xanthium strumarium) 열매 의 IC₅₀ 값은 35.0 μg/mL, 차전초(Plantago asiatica) 지상부 의 IC₅₀ 값은 55.0 μg/mL, 능소화과 오록실룸 인디쿰 (Oroxylum indicum) 심재의 IC₅₀ 값은 31.9 μg/mL의 α -glucosidase의 활성을 나타내었으며 이들의 활성과 단풍취 의 EtOAc 가용부와의 상대적 효능 평가가 가능하며 향후 활성물질의 동정을 통한 활성기작 평가가 필요하다고 사료 된다.