짚신나물(Agrimonia pilosa) 추출물의 생리활성

짚신나물(A. pilosa) 뿌리에 대한 추출물은 국립원예특작 과학원 인삼특작부 추출물은행에서 분양받은 시료를 실험 에 이용하였으며 제시된 추출방법은 시료 200 g에 70% 에탄올 1 L를 첨가하여 실온에서 2일간 2회 추출하고 이를 여과, 감압농축, 동결건조 하는 것이다.

세포독성 시험은 세포내의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 water soluble tetrazolium salts(WST-1)에서 불용성의 formazan결정으로 변환되는 원리를 이용한다(13). Formazan 이 많이 생성될수록 세포 활성이 커지는 것을 의미한다. Formazan은 dimethly sulfoxide(DMSO)에 녹아서 보라색 빛 을 띄는데 spectrophotometer로 540 nm 파장에서 OD값을 재어서 정량한다. 미국 세포주은행(ATCC)에서 분양 받은 멜라노마 세포(murine melanoma B16F10)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco, USA)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM)에서 배양하 고 24 well plate에 2×10⁴ cells/well 의 농도로 세포를 접종한 후, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양한다. 이후 배양세포에 추출물을 농도별로 처리하고 72시간 배양하였다. 결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID₅₀)을 계산하여 세포 독성 정도를 표현하였다.

DPPH radical 소거능 실험은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 의한 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 측정하였다 (14). 즉, 0.2 mM의 DPPH용액 0.8 mL에 식물추출물 시료 0.2 mL를 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화력은 [1-(시료 첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]×100의 계산식에 의 해 전자공여능(%)을 구하였으며, 대조구는 시료 대신 메탄 올을 첨가하였고, positive control로 L-ascorbic acid를 사용 하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도 (ID₅₀)를 계산하여 DPPH 소거 활성 정도를 표현하였다.

항균효과는 agar disc diffusion방법(15)을 이용하여 측정 하였다. 즉, 시료액을 0.22 μm membrane filter로 여과하여 제균하고 멸균된 paper disc에 흡수시킨 후 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 각 균주(B. subtilis, E. coli, C. albicans) 의 배양조건에 따라 24~48시간 동안 배양한 다음 paper disc 주위의 clear zone 및 inhibition zone의 크기로 항균성을 조사하였다. 또한, 시간별로 항균작용이 어떤 변 화를 보이는지 알아보기 위해 time-curve를 작성하였다. 각 각 균주 배양액에 짚신나물 뿌리 추출물 최종농도가 100 mg/L이 되도록 처리한 후, 일정 시간별로 배양액을 채취하 였다. 채취한 배양액을 십진희석법으로 희석하고 각각 균 주평판배지에 접종하여 배양한 후, 생성되는 군락(colony) 의 수를 측정하고 CFU/mL로 환산하였다.

Melanin 합성에 중요한 단백질인 tyrosinase 저해활성 측 정은 효소 작용 결과 형성되는 DL-β-3,4-dihydroxyphenyl alanine(DOPA) chrome을 비색법에 의해 측정하는 Masamoto 등의 방법(16)을 변형하여 측정하였다. 기질로서 5 mM DL-DOPA 용액 0.2 mL, 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8) 0.2 mL 및 시료용액 0.5 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (Sigma Chemical CO., 250 unit/mL) 0.1 mL을 첨가하여 37°C 에서 10분간 반응시킨 다음 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 아래 식에 따라 tyrosinase 저해활성을 산출하였 다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID₅₀)을 계산하여 tyrosinase 저해 활성 정도를 표현하였다.

Tyrosinase 저해 활성(%)=1-(시료첨가구의 흡광도/대조 구의 흡광도)×100

멜라닌 정량은 Hosoi 등의 방법(17)을 변형하여 사용하 였다. 24 well plate에 2×10⁴ cells/well로 멜라노마 세포를 분주하였고, 3-isobutyl-1- methylxanthine(IBMX)으로 멜라 난 생성을 유도한 후, 상기 세포독성 실험에서 관찰된 짚신 나물 추출물시료 농도를 처리하고 48시간 동안 37°C CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포를 수집하여 세포수를 측정하 고, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 침전한 후, 1 mL homogenization buffer(50 mM sodium phosphate pH 6.5, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF)로 용해시켰다. 여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH(10% DMSO) 200 μL를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도값을 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 시료군을 대조군으로 하고 미백제로 알려진 합성물질 인 arbutin을 표준시료로 사용하였으며 결과는 %로 환산하 였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 멜라닌 생성 저해 농도(ID₅₀)을 계산하여 멜라닌 생성 저해 활성을 표현 하였다.

모든 실험은 독립적으로 3회 반복 시행하고 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 통계적 유의성은 Student's t-test로 하였으며 p<0.05일 때 통계적으로 유의하다고 판단 하였다.

멜라노마 세포에 짚신나물 뿌리 추출물(A. pilosa extract, APE) 250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1,000 mg/L의 농도로 처리한 후, WST-1 분석법(13)을 이용하여 세포독성을 측정 하였다(Fig. 1). 대조군과 대비하여 250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1,000 mg/L의 APE 농도에서 각각 0%, 0.59%, 22.45%, 65.46% 세포독성을 나타냈으며, 50% 세포독성을 나타내는 농도(ID₅₀)는 881.11 mg/L로 나타났다. 따라서 이 후의 실험은 독성이 거의 없는 500 mg/L 이하의 농도에서 진행하였으며 멜라닌 생성 억제효과로서 보고된 백합뿌리 추출물(18)의 경우는 세포독성이 거의 없는 농도가 100 mg/L 이하인 것과 비교하였을 때 천연물시료 중 독성이 없는 더 안전한 물질로 판단된다.

Fig. 1. Cell cytotoxicity of the Agrimonia pilosa extract (APE) on the mur ine melanoma B16F10 cell. The values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant when *p<0.05, **p<0.01.

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짚신나물 뿌리 추출물에 대해서 대조구로 아스코르브산 (ascorbic acid)를 이용하여 DPPH 라디칼 소거 활성법(14)으 로 항산화 활성을 측정하였다. 추출물 시료와 대조구 시료 를 각각 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L의 농도로 제조하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 (Fig. 2), APE 농도 10 mg/L, 50 mg/L 경우 56.8%, 88.7%의 소거능 활성을 보였으며 따라서 추출물 시료의 농도가 증가할수록 라디칼 소거능 활성이 증가하였다. APE 각각에 대한 같은 시료농 도 대조구인 아스코르브산과 비교 하였을 때는 소거활성이 다소 낮았으나, 100 mg/L의 추출물 농도에서는 대조구와 거의 같은 라디칼 소거활성을 보였다(91.3%). 또한, APE의 경우, 50% 라디칼 소거활성 농도는 20.70 mg/L 였으며 대조 군 표준시료인 비타민 C(ascorbic acid)의 경우는 5.65 mg/L 였다. 또한, 기존 보고된 짚신나물 잎 열수추출물의 50% 라디칼 소거활성 농도 13 mg/L과 비교해 볼 때(2,3) 짚신나 물 뿌리 부분의 추출물에도 항산화 활성을 나타내는 물질이 함유되어 있음을 의미하며 항산화 소재로서의 가능성을 지니고 있음을 확인할 수 있다.

Fig. 2. DPPH radical scavenging activities of the Agrimonia pilosa extract (APE). Ascorbic acid was used as a positive control. The values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant when *p<0.05.

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짚신나물 뿌리 추출물에 대한 항균활성 측정은 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하였다. DMSO 10 μL 에 10 mg이 되도록 만든 후, DMSO만을 함유한 disc를 대조 군으로 하고, 각 농도의 시료액을 포함한 disc를 시험균으로 그람양성균 대표로서 B. subtilis, 그람음성균 대표로서 E. coli, 효모균 대표로서C. albicans를 균일하게 접종된 배지 위에 올려 놓고 30°C에서, E. coli 만 37°C에서 48시간 동안 배양하여 disc주변의 투명환을 관찰하여 항균활성을 측정 하였다(Fig. 3). 대조군에서는 균의 증식이 억제되지 않았으 나 짚신나물 뿌리 추출물에 대하여는 항균활성이 나타났으 며, 특히, 그람양성균에 대한 항균활성이 가장 높게 나타났 다. 또한, 추출물 시료 최종농도가 100 mg/L가 되도록 처리 한 후, 시간별로 각각 시험군에 대한 항균작용을 알아보기 위해, time curve를 작성하였다(Fig. 3). 대조군의 경우 시간 이 경과함에 따라 균의 증식에 변함이 없었으나 추출물 시료처리 경우는 배양 12시간 경과 후, B. subtilis, E. coli, C. albicans 각각 대조군에 대하여 50.5%, 40.2%, 33.7%의 증식 억제가 확인되었다. 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨 을 확인 할 수 있었으며 disc 확산법과 마찬가지로 그람양성 균인B. subtilis에 대한 증식억제 효과가 가장 높게 나타났 다. 따라서 짚신나물 추출물(APE)은 항균력이 우수하며, 특히 포자를 형성하여 살균이 상대적으로 어려운 그람양성 균에 대한 항균력이 탁월함을 보임으로써 원인균에 대한 천연방부제로서의 소재개발 가능성을 기대할 수 있을 것으 로 생각한다.

Fig. 3. Anti-microbial effect of the Agrimonia pilosa extract (APE). A clear zone was examined around paper disc. 10% DMSO was used as a negative control; B, time-curve of APE against B. subtilis, E. coli and C. albicans. 10% DMSO was used as a negative control (●) and APE was dissolved in 10% DMSO to a final concentration of 100 mg/L (▲).

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Tyrosinase는 구리를 포함한 효소로서 멜라닌 형성에 중 요한 역할을 하고 있다. 이러한 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해하기 위한 tyrosinase 저해활성을 측정하기 위하여 짚신나물 뿌리 추출물에 대한 mushroom유래의 tyrosinase 저해활성을 관찰하였다(Fig. 4). 추출물시료 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L의 경우, 각각 20.8%, 44.7%, 59.8% 의 tyrosinase 저해활성을 나타내었다. 한편, 미백활성의 표 준시료로서 kojic acid 100 mg/L의 경우 60.8%의 저해활성 을 나타내었다. 또한, APE의 경우, 50% tyrosinase 저해활성 농도는 90.18 mg/L 였으며 대조군 표준시료인 kojic acid의 경우는 89.13 mg/L 임을 고려하면, 짚신나물 뿌리 추출물시 료가 대조군 kojic acid와 비교했을 때도 동일한 수준으로 우수하게 나타났으며 또한, 다른 천연소재 중 우수한 미백 활성 효과로서 보고된 바(19) 있는 녹나무과 추출물 100 mg/L의 경우 52.8% tyrosinase 저해활성을 보이는 것과 비 교하였을 때, 향후 미백 기능성 소재로서의 활용 가능성이 매우 높다고 생각된다.

Fig. 4. Inhibitory effect of the Agrimonia pilosa extract (APE) on tyrosinase. The tyrosinase activity assay was per formed with mushroom tyrosinase. The values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant when *p<0.05.

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짚신나물 뿌리 추출물(APE)에 대한 세포독성 실험 측정 에서 정한 독성이 없는 농도에서 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하였다(Fig. 5). 대조군 대비하여 50 mg/L, 100 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L의 APE 농도에서 각각 51.7%, 72.2%, 91.3%, 100%의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다. 또한, APE의 경우, 50% 멜라닌 저해활성 농도는 62.5 mg/L 이였 으며 또한, 대조군 표준시료로서 tyrosinase 경쟁적 저해제 로 작용한다고 알려져 있는(12) arbutin의 경우는 100.7 mg/L 임을 고려하면 멜라닌 생성 저해 활성이 매우 우수함 을 의미한다. 즉, 시험재료에 있어서 피부미백효과는 멜라 닌 생성 저해에 따른 tyrosinase 저해효과가 나타나야 한다. 본 연구의 짚신나물 뿌리 추출물(APE)의 경우도 멜라닌 저해 활성이 우수하였으며 이에 따른 tyrosinase 저해활성도 높았다. 따라서 짚신나물 뿌리 추출물의 경우, 직접적인 tyrosinase 활성저해에 의한 기작으로 멜라닌 생성이 억제된 것으로 사료된다.

Fig. 5. Anti-melanogenic effects of the Agrimonia pilosa extract (APE). Arbutin was used as a positive control. Values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant when *p<0.05, **p<0.01.

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