천연색소 함유 식물추출물과 플로럴 워터의 항산화 활성

본 연구에서 사용되어진 원료 식물(소목, 소리쟁이, 오배 자, 황련, 황백, 천초근, 빈랑, 자근, 울금, 치자)는 2014년 3월에 경북 영천시에서 구입하여 사용하였으며, 시료의 학 명, 일반명 및 사용된 부위에 대해서는 Table 1에 나타내었 다. 열수추출물과 플로럴워터 2종류의 시료를 준비하기 위 하여 증류장치를 변형하여(Clevenger type apparatus) 건조 된 시료 20 g에 2 L의 증류수를 넣고 3시간 동안 추출하였으 며 이때 발생되는 증기를 플로럴워터 시료로 사용하였으며 남아 있는 추출액을 다시금 2 L로 부피를 맞춘 후 Whatman No. 2 여과지로 여과하여 고형분을 제거하고 동결건조하여 사용하였다. 실험에 사용된 용매 및 시약은 Dukan(GR grade), Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, USA) 제품을 사용하였 다.

추출된 시료의 총 폴리페놀 함량을 평가하기 위해 Folin-Ciocalteu법(10)을 이용하였다. 즉 시료 100 μL와 Folin-Ciocalteu 시약 50 μL, 20% Na₂CO₃ 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 보관한 후, 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Koyto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였 다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 표준검량선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 시료 1 mg 중의 mg gallic acid로 계산하였다. Gallic acid의 농도는 10~500 mg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 765 nm에서 흡광도를 평가하여 작성하였다.

Brand-Williams 등의 방법(11)에 따라 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 6×10^-5 M DPPH를 methanol에 녹인 후, DPPH 라디칼 용액 900 μL와 시료 100 μL를 혼합한 후 5분간 반응시킨 후 분광광도계(UV-1800, Shimadzu)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 평가하였다. DPPH 라디칼의 소거능은 아무 것도 첨가하지 않은 대조군과 시료 첨가 후 흡광도의 변화로 하여 다음 식으로 계산하였다.

시료의 농도별 DPPH 라디칼 소거능(전자공여능, %)을 도식화하여 전자공여능 50%일 때의 시료 농도를 50% inhibition concentration(IC₅₀)로 나타내었다.

ABTS(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 라디칼 소거활성을 이용한 항산화 력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(12)에 의하 여 측정하였는데, 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate를 섞어 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시켜 냉장 보관하였으며, radical stock solution은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되도록 에탄올로 희석하였다. 이 용액 0.9 mL에 농도별로 제조한 각 시료용액 0.1 mL를 가한 후 실온에서 7분간 반응시킨 후, 반응액의 흡광도 변화를 734 nm에서 측정하였다. ABTS radical cation decolorization 정도는 시료용액 첨가군과 무 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Rose bengal(RB)의 광증감 반응에 의해 생성된 단일항산 소를 측정하기 위하여 imidazole-RNO bleaching 방법(13)을 이용하였다. 단일항산소 분석은 2 μM rose bengal, 5 mM imidazole 그리고 4 μM RNO를 녹인 20 mM Tris-succinate buffer(pH 6.5) 반응액이 빛에 노출되기 전후 흡광도 변화를 440 nm에서 측정하여 나타내었다. 시료는 150 W halogen-lamp(Osram, Augsburg, Germany)로부터 백색광( λ>400 nm, 100 W/m^-2)에 4분간 노출되어졌으며, 모든 분석 은 25°C에서 이루어졌다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

페놀성 화합물은 자연계에 널리 분포하는 2차대사산물 로서 대부분 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (14). 본 실험에서 사용되어진 다양한 천연색소 추출물의 총 페놀성 화합물 함량(total phenolic contents, TPC)의 분석 결과는 Table 2에 나타난 바와 같다. 각 시료의 열수추출물 의 TPC는 0.002~0.3 mg GA/mg extract의 범위를 나타내었 는데 그중 오배자 추출물(EE)이 0.3 mg GA/mg extract로 다른 색소 추출물에 비해 월등히 높은 수준으로 분석되었 다. 일반적으로 페놀성 화합물의 함량은 항산화력과 정의 상관관계를 나타내며(15), 본 실험 결과 천연색소 추출물에 따른 총 페놀 함량이 오배자, 소목, 빈랑, 소리쟁이, 황련, 천초근, 황백의 순으로 분석되어 졌다.

DPPH는 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있 는 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화 합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(16). 천연색소로부터 얻어진 열수추출물과 플로럴워터의 전자 공여능을 측정한 결과는 Fig. 1과 같은 데, 색소 시료의 열수추출물 0.1 mg/mL 농도에서 DPPH 라디칼을 오배자 100%, 소목 100%, 소리쟁이 76.6%, 빈랑 63.8%, 천초근 33.4%, 황련 12.2%, 황백 7.2, 자근 7.2%를 소거하는 것으로 나타났으며, 10% 플로러워터 (0.1 mL) 처리시 DPPH 소거 활성은 빈랑에서 가장 우수한 결과가 나왔으며 그 다음으로 천초근, 황련, 황백, 소목의 순으로 열수추출물과는 다른 결과를 보였다. 비교 물질로 주로 사 용되는 ascorbic acid 0.1 mg/mL 처리시와 비교해 볼때 오배 자, 소목 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거능력은 상당히 높은 수준의 항산화력을 가지는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Antioxidant activities of the hot-water extract (dark-gray bars) and floral water (open bars) of various plant-derived pigments. DPPH in methanol was incubated with 0.1 mg/mL extracts and 0.1 mL/mL floral water at 25°C for 10 min, and the absorbance measured at 517 nm. The data are expressed as the mean±SD of the triplicate experiments (AA, ascorbic acid; A, Caesalpinia sappan L.; B, Rumex crispus L.; C, Aphis chinensis; D, Coptis chinensis; E, Phellodendron amurense; F, Rubia akane Nakai; G, Areca catechu; H, Lithospermum carolinense; I, Curcuma longa Radix; J, Gardenia jasminoides var. grandiflora ).

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ABTS와 potassium persulfate를 암소에 방치하면 ABTS 라디칼이 생성되는데 추출물의 항산화력에 의해 ABTS 라 디칼이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색된다. 이와 같이 ABTS 라디칼 탈색반응은 이미 생성된 자유라디 칼의 제거 정도를 흡광도로 나타내어 ABTS 라디칼의 소거 활성능을 측정하는 방법으로 ABTS 라디칼 탈색반응이 1분 안에 종료되므로 단시간 측정할 수 있고, 소수성과 친수성 모두에 적용 가능하다(17). 천연색소 열수추출물 및 플로럴 워터의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 나와 있는바와 같이, 열수추출물 (0.1 mg/mL) 및 10% 플로 랄워터 (0.1 mL) 처리시의 ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 소거능에서의 결과와 동일하게 오배자, 소목, 소리쟁이에 서 가장 우수한 활성을 나타내는 것으로 확인이 되었다. 또한 DPPH 라디칼 저해 활성이 ABTS 라디칼 저해 활성보 다 높게 나온 경향을 볼 수 있는데 이는 ABTS 라디칼이 DPPH 라디칼 보다 좀 더 강력한 산화물질이기 때문인 것으 로 사료된다(18).

Fig. 2. Antioxidant activities of the hot-water extract (dark-gray bars) and floral water (open bars) of various plant-derived pigment. The ABTS radical scavenging capacity of 0.1 mg/mL extracts and 0.1 mL/mL floral water were measured at 25°C for 5 min, and the absorbance was measured at 734 nm. The data are expressed as the mean±SD of the triplicate experiments. (AA, ascorbic acid; A, Caesalpinia sappan L.; B, Rumex crispus L.; C, Aphis chinensis; D, Coptis chinensis; E, Phellodendron amurense; F, Rubia akane Nakai; G, Areca catechu; H, Lithospermum carolinense; I, Curcuma longa Radix; J, Gardenia jasminoides var. grandiflora).

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다양한 천연색소 열수추출물에 대한 단일항산소 억제 효과를검증하기위하여광증감반응(type-II photosensitization) 에 의해 발생되는 단일항산소의 억제 효과를 분석하였다. 0.15 mg/mL 시료 처리에 따른 단일항산소 억제 효과는 Fig. 3에 나타내었는데, 단일항산소 억제 효과는 소목, 소리쟁 이, 오배자, 빈랑에서 유의성을 보였으며 이러한 결과는 앞서 기술한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능의 결과 유사하 게 나타났다.

결론적으로, 전자공여능 50%일 때의 시료 농도를 50% 억제 농도값(50% inhibition concentration, IC₅₀)을 측정하여 10종의 천연색소 열수추출물에 대한 비교는 Table 3에서 나타내었다. 3가지 방법에 의해 얻어진 결과 동일하게 오배 자, 소목, 소리쟁이, 빈랑 4종류의 천연색소 열수추출물에 서 우수한 항산화 활성을 보이는 것으로 확인되었으며 특히 오배자는 ascorbic acid의 DPPH 라디칼 소거능 IC₅₀(10.5 μg/mL)와 비교해 볼 때 매우 우수한 항산화활성을 나타내 었다. 뿐만 아니라 빛에 의해 야기되는 단일항산소 소거능 결과로 보아 강한 광에 노출되었을 때 일어날 수 있는 생체 기관의 광피해로부터 생명체를 보호하는 중요한 반응을 할 것이라고 판단한다. 향후in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며. 식품산업, 향장산업 및 의약산업에 적용한다면 활용성이 높을 것으로 사료된다.

Fig. 3. Singlet oxygen quenching capacity of the hot-water extracts of var ious plant-der ived pigments. The data are expressed as the mean±SD of the triplicate experiments. (AA, ascorbic acid; A, Caesalpinia sappan L.; B, Rumex crispus L.; C, Aphis chinensis; D, Coptis chinensis; E, Phellodendron amurense; F, Rubia akane Nakai; G, Areca catechu; H, Lithospermum carolinense; I, Curcuma longa Radix; J, Gardenia jasminoides var. grandiflora ).

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