식품보존에 이용된 식물의 천연보존료 함유량 연구

본 연구에 사용된 식물류는 충남지역에서 자생하고 있는 솔잎(Pinus densiflora), 망개잎(Berchemia berchemiaefolia), 대나무잎(Phyllostachys bambusoides), 모시잎(Boehmeria nivea), 산초잎(Zanthoxylum schinifolium), 감잎(Diospyros kaki), 떡갈나무잎(Quercus dentata), 쑥(Artemisia princeps Pamp), 잣나무잎(Pinus koraiensis), 칡잎(Pueraria lobata Willd.), 연잎(Nelumbo nucifera), 조릿대(Sasa borealis(Hak.) Makino), 원추리(Hemerocallis fulva), 구절초(Chrysanthemum zawadskii), 토란잎(Colocasia esculenta) 등 15종 21건으로 천안시 등 6개 시군에서 채취한 후 균질하게 갈아(복합식 품분쇄기, S.F.D(G), 신성기업사, Korea) –20℃에 보관하여 사용하였다(Table 1).

보존료의 표준품은 각각 소르빈산(이하 SA, Sigma, USA), 안식향산(이하 BA, Sigma, Germany), 데하이드로초 산(이하 DHA, Wako, Japan), 파라옥시안식향산메틸(이하 POBM, TCI-GR, Japan), 파라옥시안식향산에틸(이하 POBE, TCI-GR), 파라옥시안식향산프로필(이하 POBP, TCI-GR), 파라옥시안식향산이소프로필(이하 POBIP, TCI-GR), 파라 옥시안식향산이소부틸(이하 POBIB, TCI-GR), 파라옥시안 식향산부틸(이하 POBB, TCI- GR), 프로피온산(Wako)이며 프로피온산의 분석을 위한 내부표준물질로는 crotonic acid(Sigma)을 사용하였다.

식품공전(14) 보존료 시험법에 준하여 균질화 된 시료 약 25 g에 100mL의 증류수를 가하고 잘 섞은 후 15% 주석 산 용액 10mL, NaCl 80 g 및 실리콘수지 한 방울을 가했다. 이를 수증기 자동증류기(Buchi K-355, Buchi, Swiss)에 연결 하고 증류액을 받는 수기 끝을 1% 수산화나트륨용액 20 mL에 잠기도록 하여 증류하고 유액은 매분 10mL의 속도 로 하여 250mL가 되도록 증류한 후 0.45 um syringe filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였고 이 증류액 100 mL를 정확히 취하여 분액깔때기에 넣고 NaCl 10 g, 인산 1 mL 및 내부표준용액 1 mL를 가하여 에테르 50 mL 씩으 로 2회 추출하여 에테르층을 모은 뒤, 무수황산나트륨을 사용하여 수분을 제거하고 감압농축기(Buchi R-201, Buchi, Swiss)를 이용하여 농축한 후, 아세톤을 가하여 최종 부피가 10 mL가 되도록 하였다. 이를 분석용 시료로 사용하였다.

데하이드로초산, 소르빈산, 안식향산 및 그 염류, 파라옥 시안식향산에스테르류의 정성 및 정량분석을 위하여 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, Shiseido, Japan)를 사용하고 각 보존료의 표준품을 메탄올에 녹여 약 1000 ppm을 조제하여 10, 20, 30, 50, 100 ppm으로 희석 한 후 보정(Calibration curve)을 위한 표준액으로 사용하였 다. 시료 분석을 위한 컬럼은 CAPCELL PAK C8(Shiseido, SG80 5 um 4.6 mm I.D.×150 mm)으로 하고 시료 주입량은 10 uL로 하여 자외부흡광검출기(PDA ACELLA, UV Detector, 217 nm)로 검출하였다. 이동상은 0.1% TBA-OH (Sigma-aldrich)용액과 Acetonitrile(Fisher Scientific, USA)을 사용하였고 Table 2와 같은 조건으로 분석하였다.

프로피온산 분석은 capillary column(HP-FFAP 0.50 um × 25 m, 320 um)이 장착된 기체크로마토그래피(Agiliant 6890, USA)를 이용하였고 분석조건은 불꽃이온화검출기 (FID) 온도를 250℃로 하고 컬럼 온도는 60℃에서 1분 유지 시킨 후 200℃까지 분당 10℃로 승온시켜 1분 동안 유지하 고 분당 20℃로 240℃까지 승온시켰다. Carrier gas는 질소를 사용하여 1 mL/min으로 하였다.

HPLC-PDA와 GC-FID의 분석결과 검출된 천연유래 보 존료를 GC/MSD(Agilent 6890N/5975 MSD, USA)로 확인 하였다. 상기 천연유래 보존료의 추출 및 정제에 따라 처리 된 시료를 GC/MSD에 주입하여 분석하였고 분석조건으로 컬럼은 capillary column(HP-FFAP 0.25 um×30 m, 250 um), 주입구 온도는 230℃이고, 컬럼 온도는 60℃에서 1분 동안 반응 후 분당 20℃로 승온시킨 후 240℃에서 10분간 유지하 고 검출기 온도는 280℃로 하였다. Carrier gas는 헬륨(1.0 mL/min), splitless mode, solvent delay time은 3분으로 분석 하였다.

HPLC-PDA로 확인된 천연유래 보존료는 LC/MS/MS (Quattro premier, Waters, USA)를 이용하여 분석하였다. LC/MS/MS 분석조건은 Table 3 및 Table 4에 제시하였으며 정량분석 방법으로 천연물로 존재하는 보존료를 최종 확인 하였다.

HPLC-PDA 분석결과 표준액의 검량선으로 부터 얻어진 시료의 측정치를 이용하여 아래의 식으로부터 천연유래 보존료의 농도를 계산하였다.

보존료(mg/kg)=시험용액의 농도(mg/L)×정용량(mL) / 시료무게(g)

프로피온산과 그 내부표준물질 혼합용액을 제조하여 GC-FID로 분석하여 얻은 피크면적을 가지고 아래의 식을 이용하여 시료 중 프로피온산의 농도를 계산하였다.

PS ; 표준용액 중 프로피온산의 피크 높이 또는 면적

PA ; 시험용액 중 프로피온산의 피크 높이 또는 면적

PSis ; 표준용액 중 내부표준물질의 피크 높이 또는 면적

PAis ; 시험용액 중 내부표준물질의 피크 높이 또는 면적

SA ; 검체의 채취량(g)

CR ; 농축배수(= 취한 유액의 량 (mL) / 최종 시험용액의 량 (mL))

9종의 보존료 표준액에 대한 HPLC-PDA 크로마토그램 을 분석한 결과 각각 DHA, SA, BA, POBM, POBE, POBIP, POBP, POBIB, POBB의 유지시간은 3.443, 4.002, 4.967, 5.472, 7.105, 8.657, 9.013, 10.735, 10.997분 이었다(Fig. 1). 검량선을 위한 농도범위는 약 10.00～100.00 mg/kg의 범 위를 취하였고, 직선식을 통해 정량분석을 하였다. 각 검량 선의 R² 값은 0.990～0.999의 신뢰수준을 나타내었다 (Table 5).

Fig. 1. The chromatograms of preservatives analysis by HPLC-PDA and GC-FID.

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GC-FID 분석으로 얻은 프로피온산은 표준액의 피크 면 적과 내부표준물질의 피크 면적을 비교하여 농도값을 환산 하여 정량하였다(Fig. 1).

HPLC-PDA와 GC-FID의 분석으로 얻은 천연유래 보존 료 결과를 LC/MS/MS와 GC/MSD로 정성 확인을 하였다. 안식향산, 소르빈산, 프로피온산의 mass spectrum에서 표준 액과 같은 ion fragment 피크들을 확인할 수 있었다.

검량선을 통해 얻은 천연유래 보존료 함량은 Table 6과 같다. 전통적으로 떡이나 식품의 보존에 사용되었던 자생 식물류 15종 21건을 선정하여 분석한 결과 10종의 보존료 성분 중 프로피온산, 소르빈산, 안식향산을 확인할 수 있었 으나, 그 밖의 DHA, POBM, POBE, POBIP, POBP, POBIB, POBB은 불검출로 나타났다.

프로피온산의 경우, 15종 21건의 식물류 중 모시잎 2건에 서만 확인되었고, 불검출～62.726 mg/kg의 분포를 보였다. 그 함량은 평균 62.025±0.991 mg/kg으로 확인되었다(Table 6). 소르빈산은 불검출～24.995 mg/kg의 분포를 나타내었 으며, 대나무잎과 칡잎 2건에서 확인되었고 평균 15.312±13.693 mg/kg을 보였다. 안식향산의 경우는 불검 출～21.839 mg/kg의 분포를 나타내었으며 대나무잎, 모시 잎, 솔잎, 쑥, 칡잎, 잣나무잎 등 6종 8건에서 확인되었다. 이 중 모시잎에서 21.839mg/kg의 농도로 가장 높게 검출되 었다. 모시잎의 경우 안식향산과 프로피온산이 동시에 검 출되었으며 그 검출수준이 다른 식물류에 비하여 높게 확인 되었다.

대나무는 대나무벼과(Gramineae)에 속하는 식물로 한국, 일본, 중국 등 동남아시아에 분포하며 대나무잎에는 플라 보노이드 성분이 많이 함유되어 있어 항산화, 항노화 및 항균활성을 나타냄에 따라 약제 보조제, 미용 향장소재 및 식품첨가물 등으로 널리 사용되고 있는데(15) 본 실험 결과 대나무 잎의 경우 안식향산이 8.627～19.852 mg/kg으로 확 인되었다.

솔잎, 쑥, 칡잎의 경우는 각각 2건 중 1건에서만 안식향산 이 확인되었는데 이는 채취시기, 채취장소, 식물의 상태가 실험 결과에 영향을 미친 것이라 사료된다. 특히, 솔잎의 경우 최대 608 mg/kg의 안식향산이 검출되었다는 보고가 있으나, 이번 연구에서는 15.293 mg/kg의 결과를 얻었다 (16). Lee와 Han(17)의 보고에 따르면 솔잎의 추출물이 항산 화작용, 항암작용, 항미생물작용이 있는 것으로 밝혀져 있 는데 본 조사를 통하여 솔잎에서 유래된 안식향산이 항미생 물작용을 하여 보존효과를 높이는 것으로 사료된다.

조릿대, 망개잎, 구절초 추출물의 항균성 및 살균작용에 관한 연구를 통하여 식품의 저장성 향상이 입증된 바 있으 나, 실험결과 식품의 보존성에 영향을 줄 수 있는 성분은 확인되지 않았다(1,18-20).

안식향산의 경우 “식품첨가물 일반 및 안전 정보(I) 2005”에 따르면 1875년 항균작용에 관해서 처음 알려진 후 1890년 Leuck가 항균작용을 확인하였고(21) 기존의 연 구를 통해 볼 때 안식향산과 같은 저분자량의 carboxylic acid 들은 대사과정 중 쉽게 생성될 수 있는 물질들로서 식품가공공정 특히, 발효과정 중에 미생물에 의한 대사산 물로 생성되기도 하며, 또는 실제로 식품원료에 자연적으 로 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(6,8,10,21). 특히, 다 류원료 식물류 중의 하나인 백작약의 경우 654 mg/kg의 안식향산이 함유되어 있다고 확인되기도 하였으며 계피나 모과에서도 100 mg/kg으로 검출될 정도로 자연계에서 널 리 분포되어 있으며 식물류별로 농도범위차가 다양한 것으 로 알려져 있다. 본 실험에서는 안식향산은 소르빈산이나 프로피온산에 비하여 다양한 식물류의 잎에서 확인되었으 나(Fig. 2), 8.201～21.839mg/kg의 수준으로 식물류 별 검출 수준은 큰 차이를 나타내지 않았다(Table 7). 이는 식물의 여러 부위 중 잎 부분만의 결과에 국한되어 있었기 때문인 것으로 사료되며 기존의 다류 및 향신료의 경우 잎에서 12.5 mg/kg의 안식향산이 존재하는 것으로 보고된 사례 (6,7)와 유사한 14.323 mg/kg의 수준으로 확인되었다 (Table 7).

Fig. 2. The detected preservative levels in the wild plants. BBL(A) : Bamboo leaf A, BBL(B) : Bamboo leaf B, RL(A) : Ramie leaf A, RL(B) : Ramie leaf B, PN(A) : Pine Needle A, MW(B) : Mugwort B, KL(A) : Kudzu leaf A, KL(B) : Kudzu leaf B, NPL : Nut pine leaf

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일반적으로 프로피온산은 발효식품의 발효 및 숙성과정 중에 생성되는 것으로 알려져 있으며(8,22), 보고에 의하면 달래와 콩잎에서 약 5mg/kg 이하로 미량 검출되어 채소류 와 같은 식품원료에서도 프로피온산이 확인된 바 있다(22). 본 실험에서는 모시잎에서 프로피온산이 약 62 mg/kg이 검출되었다.

소르빈산의 경우 베리류나 과일에서 검출될 수 있다는 일부 보고(22) 이외에는 아직까지 연구가 미비한 실정이며 본 실험 결과 또한 대나무잎과 칡잎에서만 소르빈산이 5.630 및 24.995 mg/kg으로 검출되었다.