원지(Polygala tenuifolia)의 항비만 효과

본 실험에 시료로 사용 된 원지(Polygala tenuifolia Willd.) 는 ㈜옴니허브(Yeongcheon, Korea)에서 구입하여 사용하 였다. 본 실험에 사용 된 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였고, 세포 배양에 사 용한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal calf serum(FCS), fetal bovine serum(FBS) penicillin/streptomycin, trypsin-EDTA는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. DPPH(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), DMSO(dimethyl sulfoxide), Folin-ciocalteau reagent, bovine serum albumin(BSA), tannic acid, insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-methyl xanthine(IBMX), oil red-O reagent, MTT(3- [4,5-methylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra zolium bromide), potassium persulfate, trizol reagent는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, ABTS{2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)} 시약은 Wako Chemical (Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였으며, western blot에 이용한 1차, 2차 항체는 Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

원지의 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물은 원지 100 g씩을 파쇄하여 준비하고, 열수 추출물의 경우 1 L의 증류 수를 넣어 100℃에서 4시간 동안 환류 냉각법으로 추출하였 고, 70% 에탄올 추출물의 경우 1 L의 70% 에탄올을 넣어 실온에서 12시간 동안 3회 반복하여 추출하였다. 각각의 추출물은 원심분리 및 여과한 후 감압 농축하여 동결 건조 한 후 실험에 사용하였다.

원지의 일반성분분석은 AOAC법(27)에 준하여 분석하 였다. 수분은 105℃ 상압건조법, 회분은 회화법, 지질은 Soxhlet 추출법, 단백질은 Kjeldahl 법, 식이섬유는 total dietary fiber kit(Megazyme, Co., Wicklow, Irland)를 이용하 여 측정하였으며, 탄수화물 함량은 100 g 중에서 조수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 식이섬유 함량을 감한 값으로 하였다.

단백질 함량을 구하기 위하여 Lowry 등의 방법(28)에 따라 원지 추출물 100 μL에 Lowry 시약을 이용하여 발색시 킨 후, 분광광도계를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 측정된 흡광도는 BSA를 이용하여 작성한 표준곡 선으로부터 시료 중의 단백질 함량을 추정하였다. 유리 아 미노산 함량은 원지 추출물 100 μL와 0.55 M Na₂CO₃용액을 1 mL을 시험관에 넣고, Folin-Ciocalteau reagent를 넣어 실온 에서 30분간 반응 시킨 후 흡광도 750 nm에서 측정하였다.

총당 함량은 페놀 황산법(29)을 이용하여 측정하였다. 시약은 5% (v/v) phenol(Shinyo pure chemicals Co., Ltd.)을 사용하였다. 실험 방법은 시험관에 원지 추출물 500 μL, 5% phenol 500 μL, sulfuric acid 2.5 mL를 넣고 끓는 물에 10분간 반응 후 냉각 처리하여 490 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 총당 함량의 검량곡선은 sucrose를 이용하여 작성 하였다. 환원당 함량은 DNS법(30)을 응용하여 측정하였다. 시약은 dinitrosalicylic acid(DNS) 시약과 40% potassium sodium tartrate solution을 사용하였으며 DNS 시약은 증류 수 1 L에 dinitrosalicylic acid 10 g과 phenol 2 g, sodium sulfite 0.5 g을 넣어 제조하였다. 환원당 함량은 추출물 1 mL에 DNS 시약 3 mL를 넣은 후 끓는 물에 5분간 반응을 시키고 바로 꺼내서 냉각시킨 후 흡광도 575 nm에서 측정 하였다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(31)에 준하여 정량하 였다. 시료 100 μL에 Folin-Ciocalteu phenol reagent 100 μL 를 가하고, 0.75 M Na₂CO₃ 100 μL를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고 750 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광 도 값과 비교하여 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 Blois의 방법(32)을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2 mL에 0.2 mM의 DPPH 시약 1 mL을 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. DPPH 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2 로 환원시키는데 필요한 시료의 농도 값(RC₅₀)으로 나타내 었다.

ABTS 라디칼 소거활성을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolourization assay 방법(33)에 의하여 시행 하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 최종농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하 여 ABTS를 형성시킨 후 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4) 로 희석하였다. 희석된 용액 100 μL에 시료 50 μL를 가하여 5분 동안 방치한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였 다. ABTS 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구 의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도 값 (RC₅₀)으로 나타내었다.

3T3-L1 세포배양은 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin 이 첨가된 DMEM 배지에 2×10⁵cells/mL농도로 부유시켜 48시간 동안 배양하여 confluent 상태가 되도록 37℃ CO₂ incubator에서 배양하였다. 지방세포분화는 분화유도배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 5 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine)를 2일간 교체하여 배양하였다. 2일간 분화 유도 후 1 μg/mL의 insulin이 함유된 10% FBS-DMEM으로 2일간 배양하였다. 그 후 2일마다 4회 10% FBS-DMEM으로 교체하였다. 시료 의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다.

지방세포에 대한 원지 추출물의 세포독성은 MTT assay 를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포를 96 well culture plate에 100 μL의 배지와 함께 24시간 배양한 다음, 원지 열수와 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하 였다. 각 well에 10 μL의 MTT 용액(5 mg/mL)를 첨가한 후 3시간 동안 배양하면서 환원 반응을 유도하였으며, 100 μL의 DMSO를 첨가하여 형성된 formazan 결정을 용해하였 다. 발색 정도는 분광광도계를 이용하여 570 nm에서 흡광 도를 측정하였다.

지방전구세포 분화 시에 형성된 지방의 함량은 oil red-O 염색법에 의해 측정하였다. 8일 동안 분화 후에 배지를 제거 한 뒤 분화된 세포표면을 PBS로 2회 세척한 다음 10% formalin/PBS로 30분간 고정하고 PBS로 세척하였다. 각 well에 oil red-O 용액 1 mL을 첨가하고 실온에서 1시간 염색한 다음, 염색된 세포는 100% isopropyl alcohol에 용해 한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

원지 열수 추출물을 첨가하여 분화시킨 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 두번 세척한 후 trizol reagent를 처리하여 Total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA에 각각의 primer (Genotech, Daejeon, Korea)와 One step SYBR PrimeScript^TM RT-PCR kit(Takara, Ohtsu, Japan)를 넣고 Real-time PCR Detection System(ECO^TM, Illumina, CA, USA)을 이용하여 증폭하였다. 유전자 발현 분석에 사용된 primer의 서열은 Table 1과 같이 나타내었으며, PCR 조건은 초기변성 95℃ 30초, 변성은 95℃ 5초, annealing은 57℃ 15초, 신장반응은 72℃ 10초로 하여 40 cycle을 진행했다. 용해 곡선은 55℃에 서 시작하여 95℃를 종말점으로 0.5℃씩 상승시키며 80번 을 반응하여 원하는 형광 값을 검출하였다. mRNA의 상대 적 발현량은 control에 대한 sample의 상대적 유전자 발현 값으로 나타내었다.

3T3-L1 cell 에서 발현되는 SREBP-1c, PPARγ, CEBP/α, FAS, ACC의 단백질 발현에 대한 원지 열수 추출물의 효과 를 조사하기 위해 western blot을 수행하였다. 지방분화가 끝난 세포는 PBS로 세척한 후 RIPA buffer를 이용하여 단백 질을 추출하였다. 추출된 단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동 시킨 후 polyvinylidene fluoride(PVDF) transfer membrane으로 400 mA로 1시간 40분 동안 transfer 시켰다. Transfer가 끝난 membrane은 5% skim milk로 1시간 동안 blocking한 후 1:200의 비율로 1차 항체인 SREBP-1c, PPARγ, CEBP/α, FAS, ACC를 첨가하여 저온에서 overnight 동안 반응시키고, TBST로 5분 간격으로 3회 세척하였다. 1:1000의 비율로 희석한 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후, TBST로 10분 간격으로 3회 세척한 다음 ECL 용액을 이용하여 X-ray film에 감광시켰다. Film 상의 밴드는 Quantity One® 1-D Analysis Software(Biorad, CA, USA)를 이용하여 정량화 하였다.

데이터의 통계분석은 SPSS version 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었고, 실험군 간의 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 의해 검정을 실시 하였다.

원지의 일반성분 함량을 분석한 결과 탄수화물 21.72%, 조단백질 18.5%, 조지방 14.48%, 조회분 2.42%, 식이섬유 42.87%가 함유되어 있었다(Table 2). 원지의 성분 중에서는 식이 섬유 함유량이 가장 높았으며, 원지에 포함된 식이섬 유 39.45% (습부량 기준)중 불용성 식이섬유 38.18%, 가용 성 식이섬유 1.77% 로 불용성 식이섬유를 많이 함유하고 있었는데, 불용성 식이섬유의 경우 심혈관 질환, 위장질환, 대장암, 혈당반응의 위험을 낮추는 효과와 콜레스테롤 저 감 효과가 보고 되어있다(35-37). 이러한 결과를 통해 원지 는 식이섬유 공급원으로서 충분한 기능적 가치를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

산업적 측면을 볼 때 천연물의 추출 수율은 부가 가치적 측면에서 매우 중요한 요소로 작용한다(38). 원지 열수 추출 물과 70% 에탄올 추출물의 추출 수율은 각각 26.2%, 32.0% 로 열수 추출물 보다 에탄올 추출물에서 추출 수율이 더 높은 것으로 나타났다(Table 3). 식품 중에 존재하는 당류는 화학적으로 환원성을 갖는 환원당과 환원성을 갖지 않는 비환원당으로 나눌 수 있으며 이를 합쳐서 총당이라고 한 다. 원지의 총당의 함량은 열수 추출물에서 353.0 mg/g, 에탄올 추출물은 281.9 mg/g, 환원당은 열수 추출물, 에탄올 추출물이 각각 114.2 mg/g, 46.7 mg/g으로 나타났다. 단백질 함량은 열수 추출물이 275.0 mg/g, 에탄올 추출물이 220.0 mg/g, 유리 아미노산은 열수 추출물이 29.8 mg/g, 에탄올 추출물이 28.9 mg/g으로 측정되었다. 이와 같이 원지에 포 함된 가용성 단백질과 유리아미노산은 아미노산 급원으로 서 영양학적으로 충분한 가치가 있을 것으로 추정된다.

식물체에 함유되어 있는 페놀성 화합물들은 항산화, 항 암, 고혈압 억제 등의 다양한 생리활성을 가진다(39). 원지 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 항산화 효과를 알아보 기 위해 총 폴리페놀, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다(Table 4). 원지의 총 폴리페놀 함량은 tannic acid를 기준물질로 하여 측정하였으며 그 결과 원지 열수 추출물 26.6 mg/g, 70% 에탄올 추출물 17.8 mg/g으로, 열수 추출물이 70% 에탄올 추출물보다 총 폴리페놀의 함량 이 높은 것으로 확인하였다. 원지의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물에서 각각 3.29 mg/mL, 4.43 mg/mL의 농도에서 RC₅₀값이 관찰되었고, ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 열수 추출물 0.95 mg/mL와 70% 에탄올 추출물 2.47 mg/mL의 농도에서 RC₅₀ 값이 관찰되어 열수 추출물이 70% 에탄올 추출물보다 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 우수한 것으로 확인되었 다. 식물 기원의 시료에서 페놀 화합물은 그 함량이 많을수 록 항산화 활성이 높으며(40), 식물시료의 변색에 주된 영향 을 미치는 인자로 알려져 있다(41). 따라서 원지 물 추출물 이 70% 에탄올 추출물보다 높은 총 폴리페놀 함량을 나타 내어 원지 물 추출물의 DPPH, ABTS 라디칼 소거능이 높은 것으로 사료된다.

원지 추출물의 3T3-L1 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같이 나타내었다. 추출물을 처리하지 않은 대조군의 세포 증식율을 100% 로 하였을 때, 원지 열수 추출 물과 70% 에탄올 추출물의 경우 100 μg/mL의 농도에서 90% 이상의 세포증식이 유지되었고, 그 이상의 농도에서는 세포독성이 유발되었다. 그 결과 세포 증식에 크게 영향을 미치지 않는 100 μg/mL 이하의 농도로 10, 50, 100 μg/mL로 3T3-L1세포에 처리하여 지방세포분화 억제능을 측정하였다.

Fig. 1. Cell viability of water extract (PTW) and 70% EtOH extract (PTE) from P. tenuifolia in 3T3-L1 preadipocytes cell. 3T3-L1 cells were treated with PTW at various concentrations for 48hr. Cell viability was measured by the MTT assay. Each value is expressed as the mean±SD of three independent experiments. Values with the same superscript letters are not significantly different from each other at p<0.05

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지방세포(adipocyte)는 지방선구세포(preadipocyte)상태 로 존재하다가 적절한 환경하에서 분화되어 지방세포가 되어 세포 내 지방을 축적하는데 지방세포의 크기 또는 수적 증가가 비만의 정도를 결정짓는 하나의 요인으로 간주 되고 있다(42-43). 원지 추출물의 지방 분화능을 측정한 결 과, 열수 추출물은 10 μg/mL의 농도에서 대조군 대비 40.1% 의 억제율을 나타내었고, 에탄올 추출물의 경우 10 μg/mL 의 농도에서 대조군 대비 22.4% 의 억제율을 나타내어 에탄 올 추출물 보다 열수 추출물의 지방분화 억제 효과가 우수 하였다(Fig. 2). Lee 등(44)이 보고한 마치현 추출물의 경우 10 μg/mL의 농도에서 15.5%의 지방분화 감소를 나타낸 연구결과와 비교하였을 때 원지 물 추출물의 우수한 지방분 화능 억제 효과를 관찰할 수 있었다.

Fig. 2. Inhibitory effect of water extract (PTW) and 70% EtOH extract (PTE) from P. tenuifolia on the lipid accumulation in 3T3-L1 adipocyte. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing differentiating culture mixture[MDI treatment : 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1μM dexamethasone and 1 μg/mL insulin]. Following 8-d differentiation, differentiated adipocytes were fixed and stained with oil-red O in order to visualize lipid droplets. Each value is expressed as the mean±SD of three independent experiments. Values with the same superscript letters are not significantly different from each other at p<0.05.

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SREBP-1c는 지방과 간조직의 지방산과 콜레스테롤대사 에 매우 중요한 역할을 가지는 전사인자이며(45), 지방세포 에서 PPARγ와 CEBP/α 의 발현을 유도하여 지방조직 생성 을 촉진 시킨다. 또한 지방산 생성에 관여하는 효소인 FAS, ACC 등의 발현을 조절하고 중성지방 생성과 관련된 단백 질 발현에도 영향을 끼침으로써 인슐린 의존적인 지방 합성 을 유도한다(46). 원지 물 추출물에 의한 지방축적의 감소가 지방 생성의 억제로부터 유도되는 지를 조사하기 위하여 시료를 지방세포에 농도별로 처리한 후 지방생성과 관련된 유전자들의 mRNA 발현을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3. mRNA expression effects of P. tenuifolia water extract (PTW) on adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells confirmed RT-PCR. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing differentiating culture mixture[MDI treatment : 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1μM dexamethasone and 1 μg/mL insulin]. Total RNA was extracted and cDNA was prepared. Equivalent amounts of cDNA were amplified using primers specific for SREBP-1c(A), PPARγ(B), CEBP/α(C), FAS(D), ACC(E) and β-actin. Each value is expressed as the mean±SD of three independent expriments. Values with the same superscript letters are not significantly different from each other at p<0.05.

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시료를 처리하지 않은 대조군에서는 분화유도에 따라 각 유전자들의 발현량이 증가하였지만, 원지 열수 추출물 을 농도 별로 처리하였을 경우 농도 의존적으로 발현이 감소됨을 확인하였다. 원지 열수 추출물은 50 μg/mL의 농 도에서 SREBP-1c의 발현량을 53.9%로 감소하였으며, 같은 농도에서 PPARγ와 CEBP/α의 발현을 각각 98.2%, 94.4% 로 감소시키는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 보아, 원지 열수 추출물이 상위 발현 유전자인 SREBP-1c, PPARγ, CEBP/α의 mRNA 발현량을 감소시킴으로써 하위 인자인 FAS와 ACC mRNA의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 원지 열수 추출물은 3T3-L1 지방전구세포 에서 지방세포화 인자(adipogenic factor)인 각 유전자 발현 을 억제시킴으로써 지질의 합성 수송, 저장에 관여하는 FAS, ACC의 발현에 영향을 미쳐 지방분화를 억제시킨 것 으로 생각된다.

원지 열수 추출물의 지방 생성 및 분해와 관련된 단백질 발현과의 연관성을 확인하기 위해 western blot을 이용하여 SREBP-1c, PPARγ, CEBP/α의 발현량을 측정하였다(Fig. 4). 이 중 SREBP-1c는 지방조직에서 발현하여 PPARγ의 프로모터에 결합하여 PPARγ의 발현을 조절하며, 지방산 대사물을 생성함으로써 지방세포 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다(47). 또한, CEBP/α는 PPARγ의 활성화 및 지속 적인 유지를 도와줌으로써 성숙한 지방세포의 생성을 위해 인슐린 감수성에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있어, 지방세포 분화과정에 있어서 중요하게 작용하는 전 사인자로써 비만 연구에 널리 이용되고 있다(48). 원지 물 추출물을 처리하지 않은 대조군은 SREBP-1c, PPARγ, CEBP/α, FAS, ACC의 발현이 증가하는 것으로 나타내었고, 원지 열수 추출물을 농도 별로 처리하였을 때 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다. 특히 원지 열수 추출물은 50 μg/mL의 농도에서 SREBP-1c의 발현을 47.2% 로 감소시키 는 것을 확인하였고, 와 CEBP/α의 발현을 각각 87.4%, 86.2% 감소하는 것을 나타내었는데, 이와 같은 결과는 원지 열수 추출물이 SREBP-1c의 발현을 억제 함으로써 하위인 자인 PPARγ와 CEBP/α의 발현에 영향을 준 것으로 생각된 다. 원지 열수 추출물은 비만 관련 인자들의 전사단계에서 발현을 제어하여 관련 단백질의 발현량이 감소되는 것을 확인하였고, 이에 따라 전지방세포의 지방분화 억제 및 지 질함량이 감소되는 것을 확인하였다.

Fig. 4. Protein expression effects of P. tenuifolia water extract (PTW) on adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells confirmed western blotting. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing differentiating culture mixture[MDI treatment : 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1μM dexamethasone and 1 μg/mL insulin]. Western blotting was perfomed using 30 μg of each sample. The loading control was assessed using β-actin antibody. The relative intensities SREBP-1c (A), PPARγ(B), CEBP/α(C), FAS(D), ACC(E) expression compared with the β-actin expression were determined using quanity One Software. Each value is expressed as the mean±SD of three independent expriments. Values with the same superscript letters are not significantly different from each other at p<0.05.

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