울릉도 섬더덕 추출물의 급여가 제2형 당뇨 동물의 지질대사 개선에 미치는 영향

본 실험에서 사용한 섬더덕은 울릉옥천식품에서 2010년 10월에 구입하여 사용하였다. 시료를 열풍건조 시킨 후 건 식분쇄기(HMF-3250S, Hanil, Seoul, Korea)를 이용하여 분 쇄한 다음 50 mesh 체로 쳐서 추출에 사용하였다. 추출은 건조 시료 30 g에 60% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 12시간 교반추출 하여 추출수율은 44.80%가 나왔다. 추출 물은 원심분리 및 여과하여 농축 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다.

생후 4주령(16～18 g)된 C57BL/6J mice계의 수컷 검은 쥐를 (주)오리엔트(Orient bio Co., Seoul, Korea)로부터 분양 받아, 1주간 Lab. chow pellet식이로 사육하여 적응기를 거 친 다음 정상식이군(ND)을 제외한 실험동물에 고지방식이 를 9주간 급여시켜 비만형 마우스로 유발시켰다. 고지방식 이 공급으로 비만에 의해 당뇨위험수치에 도달한 실험동물 에 한해 난괴법(randomized block design)에 의해 고지방식 이군(HFD), positive control로 사용된 0.05% metformin 첨가 군(PC), 2% 섬더덕 추출물 첨가군(UCL)으로 나누었으며, 당뇨를 유발시키지 않은 정상식이군(ND)을 포함하여 총 4군을 대상으로 5주 동안 동물실험을 수행하였다(Table 1). ND군은 정상식이(AIN76 normal diet)를 급여하였고 HFD 군은 고지방식이(high fat diet)를, UCL군은 고지방식이에 섬더덕 에탄올 추출물을 2% 수준으로 배합한 실험 식이를 공급하였으며 양성대조군으로는 0.05%의 metformin을 배 합하여 공급하였다(Table 2). 동물 사육실에 사육환경은 항 온(25±2℃), 항습(50±5%)을 유지시켰고, 12시간 간격으로 사육기간 동안 light cycle을 유지하여 개개의 stainless cage 안에서 사육하였다. 식이와 물은 자유 섭취시켰으며, 모든 실험 식이는 사육기간 동안 냉장 보관하였다. 식이섭취량 은 매일 일정한 시각에 측정해 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.

실험동물의 체중은 매주 같은 시간에 측정하였으며 실험 동물의 장기 및 지방조직의 중량은 희생 시에 채혈 후 즉시 적출하여 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하여 그룹별로 비교하 였다.

실험이 완료 된 동물은 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 에테르를 흡입시켜 마취시킨 다음 복부 하대정맥으로부 터 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에 방치한 뒤 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 실험동물의 장기조직은 채혈 후 즉시 적출하 여 PBS 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량 후, 즉시 액체질소로 급냉시켜 -70℃에 보관하였다.

콜레스테롤 정량은 Allain의 효소법(17)을 응용한 정량용 kit(Asan kit, Asan Co., Seoul, Korea)로 측정하였다. 혈청 콜레스테롤은 cholesterol esterase에 의해 지방산과 유리 콜 레스테롤로 전환되며, 전환된 유리콜레스테롤에 cholesterol oxidase를 반응시키면 H₂O₂와 Δ4-cholestenon이 생성된다. 이 중 H₂O₂를 peroxidase 및 phenol, 4-amino-antipyrine과 혼합하여 적색으로 발색시킨 후, 500 nm에서 흡광도를 측 정하여 콜레스테롤 표준용액(300 mg/dL)과 비교하여 정량 하였다.

중성지방의 정량은 McGowan 등의 효소법(18)을 이용한 발색법 원리에 따라 중성지방 측정용 시약(Asan kit, Asan Co.)을 사용하여 측정하였다. 중성지질은 lipoprotein lipase (LPL)를 이용하여 글리세린과 지방산으로 분해시킨 후 ATP와 glycerol kinase (GK)를 첨가하여 L-α -phosphoglycerol로 전환시켰다. 여기에 O₂, glycerophospho oxidase(GPO)를 첨가하여 반응시키면 H₂O₂가 발생하는데, 이에 peroxidase와 4-aminoantipyrin을 처리하여 적색으로 발색시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하여 글리세롤 표준 용액(300 mg/dL)과 비교하여 정량하였다.

혈장 및 간조직의 HDL-cholesterol은 HDL-콜레스테롤 측정용 시약(Asan kit, Asan Co.)을 사용하여 측정하였다. 시료 100 μL를 취하여 인텅스텐 나트륨 500 μL과 염화마그 네슘 1 mg을 처리하면 인텅스텐산과 마그네슘 양이온의 작용으로 지단백질 중 apo B를 포함하는 LDL 및 VLDL이 침전된다. 이를 원심분리한 후 상징액에 남은 HDL 중의 총콜레스테롤과 같은 방법으로 발색반응 시켜 500 nm에서 흡광도를 측정하고, 콜레스테롤 표준용액(50 mg/dL)과 비 교하여 정량하였다.

심혈관계 질환의 위험도 판정에 사용되는 TC/HDL-cholesterol ratio는 아래와 같은 식을 사용하였고, atherogenic index(AI)는 혈장 중 total cholesterol 농도에서 HDL cholesterol을 뺀 값에 대한 HDL-cholesterol 농도의 비로 아래와 같은 식에 의해서 산출되었다.

TC/HDL-cholesterol ratio = [(total cholesterol)/(HDL-cholesterol)]

Atherogenic index = (total cholesterol-HDL cholesterol)/HDL cholesterol)

Western blot 실험을 위하여 실험동물의 간 조직을 ice cold-PBS(phosphate buffered saline)로 2～3회 잘 세척한 후 pH 8.0, 150 mM tris NaCl, 0.02% sodium azide, 0.2% SDS (sodium dodecyl sulfate), PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 100 μg/mL, aprotinin 50 μg/mL, 1% NP-40, 100 mM NaF, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA로 조성 된 RIPA buffer 200 μL를 넣어 균질화 하고 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상징액을 분리 하였다. 20 μg으로 정량한 단백질은 sodium dodesyl sulfatepolyacryl-amidegel electrophoresis(SDS-PAGE)에 의 하여 분리되고, PDVF membrane으로 전이시켰다. 단백질 이 전이된 membrane을 5% skim milk가 포함된 TBST로 blocking한 후 TBST에 적당한 농도로 희석시킨 각각의 1차 항체(SREBP-1, PPARα, FAS, ACC, β-actin)로 4°C에서 밤 새 반응시킨 후 HRP conjugated 2차 항체로 실온에서 2시간 반응시켜 ECL solution을 이용하여 x-ray film에 현상하였다.

모든 실험 결과들은 3반복으로 수행하였으며, 본 실험의 모든 결과는 SPSS package program(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, 각 변인마다 평균과 표준오차를 구하였고, 다군 간의 차이는 Duncan's multiple range test에 의해 p<0.05 이상의 수준에서 사후검정을 실시하였으며 그 결과를 mean±standard deviation(SD)로 표시하였다.

실험 식이를 공급하기 전의 몸무게를 초기체중으로 측정 하였으며 최종체중은 희생 직전의 몸무게를 측정하였다. 실험 식이는 하루 당 약 3～5 g을 섭취하였으며 섬더덕 추출물을 공급한 군에서는 식이섭취량에 비해 몸무게가 감소하였다(Table 3). HFD군에서 실험 종료 전의 몸무게가 28.42 g에서 32.61 g으로 4.19 g증가하였고, PC군은 28.37 g에서 29.69 g으로 0.95 g증가하였다. UCL군에서는 몸무게 가 증가하지 않고 28.74 g에서 0.07 g정도 오히려 감소하였 다. 또한 식이섭취량에 비해 식이효율이 낮아 체중 증가 억제 효과가 있는 것으로 생각된다.

고지방식이와 섬더덕 추출물을 5주간 공급한 마우스의 장기 및 지방조직 무게를 비교한 결과는 Table 4와 같다. 고지방식이군에서 장기와 지방 무게가 증가한 것을 확인하 였으며, 섬더덕 추출물을 공급한 군에서 장기 및 지방의 무게가 전반적으로 감소함을 확인하였다. 그러나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며 지방 무게에서만 유의적인 차이 를 나타냈다.

지방조직은 중성지방의 형태로 지방을 저장하고, 유리지 방산을 배출하여 간에 제공하는 역할을 함으로써 체내 지질 대사에서 중요한 역할을 한다(19). 본 연구에서 고지방식이 군은 정상군보다 백색지방에 해당하는 신장지방과 부고환 지방의 무게가 4배 이상 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 신장지방과 부고환지방의 무게는 섬더덕 추 출물을 공급한 군에서 고지방식이군보다 각각 0.40 g, 0.87 g 정도 감소된 것을 확인하였다(Table 4).

Park (20)의 고지방식이를 섭취한 흰쥐에서 숙성더덕추 출물이 혈청지질농도개선 효과에 미치는 영향이라는 연구 에서는 고지방식이에 의한 간, 비장, 신장의 장기 무게 변화 는 있었으나, 숙성더덕추출물 투여에 의한 유의성 있는 무게 변화는 관찰되지 않았다는 보고와 유사한 것으로 나타났다.

고지방식이를 섭취하는 동물에서 섬더덕 추출물의 공급 에 따른 혈장 내 지질함량의 결과는 Table 5와 같다. 혈장 내 중성지질 함량은 정상식이군의 경우 62.36 mg/dL이었 고, 이에 비해 고지방식이군에서는 223.27 mg/dL로 약 160% 증가하였다. 고지방식이군이 정상식이군보다 혈장 중성지방 함량이 현저히 높게 나타났는데 이는 Cohen 등 (21)의 보고와 유사한 결과이며, 반면 섬더덕 추출물을 공급 한 군에서는 160.69 mg/dL로 고지방식이군에 비해 28% 정도 감소하였다. 혈장 내 총 콜레스테롤 함량은 일반 식이 를 공급한 정상대조군에 비해 고지방식이만 공급한 대조군 에서 약 2배 이상의 함량을 보였으며 섬더덕 추출물을 공급 한 군에서는 고지방식이군에 비해 총콜레스테롤 함량이 약 43% 감소한 것을 확인할 수 있었다.

사포닌은 콜레스테롤과 직접 작용을 하여 콜레스테롤의 흡수를 막는 불용성 화합물을 만들기도 하고 담즙산과 작용 을 하여 변을 통한 담즙산의 배설을 증가시킴으로써 간접적 으로 콜레스테롤 대사에 영향을 미쳐 콜레스테롤의 수준을 저하시킨다(22,23)고 알려져 있다. 또한 Han 등(24)과 Kang 과 Joo는(25) 더덕과 인삼의 혈청 콜레스테롤 강하 효과를 더덕과 인삼의 성분 중 사포닌의 작용으로 설명하고 있다. 본 실험에서 섬더덕 추출물을 공급한 군에서 콜레스테롤이 유의적으로 감소한 것은 더덕 에탄올 추출물 중 사포닌의 작용 때문으로 생각된다.

HDL-콜레스테롤은 항동맥 경화 지표로써 조직의 콜레 스테롤을 간으로 운반하여 제거하는 역할을 하며, 특히 심 혈관계 질환자의 경우 낮은 HDL-콜레스테롤 수준을 나타 내는 것으로 보고되어 있다(26). HDL-콜레스테롤의 함량 은 고지방식이군에 비해 약 40% 증가함을 알 수 있었다. 따라서 섬더덕 추출물은 혈청 지질개선 효과에 기인하는 것으로 생각된다.

심혈관계 질환의 위험도 판정에 사용되는 수치인 TC/HDL-chloesterol ratio에 미치는 영향을 비교 관찰한 결 과, ND군은 2.27 index, HFD군은 5.63 index로 나왔으며, UCL군에서는1.57 index로낮은수치를나타냈다. Atherogenic index에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, ND군(1.28 index) 보다 UCL군(0.57 index)에서 낮은 수치를 나타냄을 알 수 있었다. 본 실험 결과, 마우스에 섬더덕 추출물을 공급함으 로써 중성지방과 총콜레스테롤의 수치를 유의적으로 감소 시켰으며 HDL-콜레스테롤 수치는 증가시켰다. 동맥경화 지수 또한 낮추어 주는 것으로 나타났다.

섬더덕 에탄올 추출물을 첨가한 식이가 지방 생성에 미 치는 영향을 알아보기 위하여 간 조직에서 PPARα, SREBP-1, ACC, FAS 단백질 발현정도를 살펴보았다(Fig. 1).

Fig. (1). Representative western blotting analysis of Coconopsis lanceolata extract in liver . Values are means±SD (n=7). Means in the bars with different letters are significantly different at p＜0.05 by Duncan's multiple range test. ND, normal diet; HFD, high fat diet; PC, positive control(0.05% metformin); UCL, Coconopsis lanceolata in Ulleung 60% ethanol extract. (A): PPARα, (B): SREBP-1, (C): ACC, (D): FAS

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Lipogenesis가 일어나는 동안 SREBP-1과 fatty acid synthase (FAS)와 같은 지질 생성 관련 유전자의 발현이 증가한다(27,28). SREBP-1는 acyl-CoA carboxylase(ACC), FAS 및 SCD-1과 같이 지방산 합성을 조절하는 여러 유전자 의 발현을 제어함으로써 지방산 합성을 유도하게 된다(29).

본 연구결과 고지방식이군의 간 조직에서 PPARα, SREBP-1, ACC, FAS 단백질 발현은 증가한 반면, 섬더덕 에탄올 추출물을 첨가한 식이군에서 지방분해에 관여하는 PPARα의 경우 약간의 감소 수치를 나타내었다. 동물에서 체지방 조절에 결정적인 역할을 하는 SREBP-1과 간세포에 서의 중성지방 합성과 관련 있는 ACC, 지방산 합성효소 생산에 관여하는 FAS의 경우 모두 그 발현양이 고지방식이 군보다 각각 40%, 90%, 60%의 수치가 감소함을 알 수 있었 다. 섬더덕 추출물은 지방 생성 관련 단백질의 발현을 조절 하여 지방세포의 증식과 분화 기능을 억제함으로써 체내 지방 형성과 축적을 저해하는 것으로 생각되며, 본 결과는 섬더덕 추출물이 체중 감소에 기능성이 있음을 나타낸다.