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야관문 에탄올 추출물의 자외선 노출에 의한 피부 광노화 개선 효과

정희경, 최미옥, 김배진, 조성경, 정유석*
Hee Kyoung Jung, Mi Ok Choi, Bae Jin Kim, Seung Kyeung Jo, Yoo Seok Jeong*
Author Information & Copyright
(재)대구테크노파크 바이오헬스융합센터
Biohealth Convergence Center, Daegu Technopark, Daegu 704-801, Korea
*Corresponding author. E-mail : carrot2p@ttp.orgPhone:82-53-602-1885, Fax:82-53-602-1898

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Received: Feb 10, 2013; Revised: Feb 3, 2014; Accepted: Feb 6, 2014

Abstract

This study evaluated the improving efficacy of Lespedeza cuneata ethanol extract on skin photoaging induced by ultraviolet (UV) irradiation. The total polyphenol and flavonoid contents of the extract were respectively 134.98±1.70 and 16.20±0.05 mg/g, respectively. The superoxide anion radical scavenging activity and electron-donating ability of the extract were shown to be dependent on concentration, and the antioxidant ability was shown to be more effective in superoxide anion radical scavenging activity than in electron-donating ability under the same concentration conditions. In the in vivo test conducted using hairless mouse with skin photoaging induced by UVB irradiation, the skin erythema of the groups treated with the extract (AS) reduced to 28% of the control, and the skin moisture content increased to 131%.. The extract treatment of the UV-damaged skin improved the morphological and histopathological state of the skin. Furthermore, the SOD, GST and CAT activities in the skin tissue of the AS group increased, and the XO activity and TBARS generation decreased. With regard to the genes related to the photoaging skin, the expression of PAK, p38, c-Fos, c-Jun, TNF-α and MMP-3 in the skin of the AS group were found to have decreased. It was therefore concluded that Lespedeza cuneata ethanol extract can reduce wrinkle formation in the skin due to the regulation of the gene expression caused by the exposure to UVB light.

Keywords: Lespedeza cuneata; antioxidant activity; photoaging; skin aging; wrinkle

서 론

생활수준의 향상으로 인해 아름답고 건강한 피부를 유지 하려는 욕구가 증대되고 여가생활을 위한 야외활동시간이 증가하면서 남녀노소 불문하고 태양광선 노출로부터 야기 되는 피부손상을 저해하기 위한 관심도 증가하고 있으며 이에 따른 피부노화 억제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(1-3). 태양광선의 자외선(UVR, ultraviolet radiation)에 반복적이거나 장기간 노출 시 피부의 탄력 및 수분이 감소 되고 주름이 형성되는 등의 피부손상이 일어나게 되며 이런 현상을 광노화(photoaging)라 부른다(1,4). UVR은 그 파장 에 따라 ultraviolet A(UVA, 320∼400 nm), ultraviolet B(UVB, 280∼320 nm), ultraviolet C(UVC, 200∼280 nm)로 분류되며 그 중 UVB는 인체에 가장 쉽고 빠르게 영향을 나타내어 피부손상에 관여하며 건조 및 피부홍반, 색소침 착, 표피비후 등의 현상과 산화적 스트레스 및 항산화기전 의 불균형 유발을 통해 피부를 구성하는 지질, 단백질, 효소 등을 손상시킴으로써 염증반응과 피부암 및 광노화를 심화 시켜 피부손상을 초래한다(5,6). 특히 UVB 노출에 의해 생성이 유도되는 활성산소는 광노화 원인 중 하나로 세포내 신호전달 체계를 자극하여 DNA와 지질 및 단백질과 같은 생체분자에 산화적 스트레스 유발을 통한 피부조직 손상을 야기한다(7). 또한 활성산소는 표피 각질세포와 진피 섬유 아세포의 자극으로 activator protein-1(AP-1) 및 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells(NF-κ B)의 전사인자를 활성화하고 염증관련 cytokine을 분비토 록 하여 matrix metalloproteinase(MMPs)의 발현을 증가시 키고 피부조직을 구성하는 교원질과 탄력섬유의 분해를 촉진시킴으로써 주름형성을 유발하기도 한다(8). 따라서 체내에서는 활성산소에 의해 생성 및 활성화 된 지질과산화 물과 산화효소에 대한 방어로 catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD) 및 glutathione-s-transferase(GST) 등과 같 은 항산화효소가 작용하며(9), vitamin C, E 및 폴리페놀류 와 플라보노이드 등의 생리활성 물질이 활성산소에 의한 피부 손상을 방어 할 수 있다고 보고된 바 있다(10). 피부 광노화에 따른 피부조직 손상 및 주름의 개선에 있어 항산 화 물질의 역할과 중요성에 대한 관심이 집중되면서 장기간 사용에도 부작용이 없으며, 항산화 활성을 나타낼 수 있는 천연 기능성 소재 및 이를 이용한 제품의 개발이 활발히 일어나고 있다(2,11-14). 그 중 야관문(Lespedeza cuneata G. Don)은 우리나라를 비롯한 일본, 중국, 대만 등 아시아에 분포하는 흔한 식물로써 민간에서는 간과 콩팥 등의 기능 보호와 조루, 기침, 천식 등 치료용 약재로써 사용되었다. 야관문은 pinitol, avicularin, trifolin, quercetin, kaempferol, vitexin과 같은 플라보노이드 등 다양한 생리활성 물질을 함유하여 항균 및 항산화 활성을 나타낼 뿐만 아니라 피부 노화억제에 유용하다고 잘 알려져 있는 vitamin E 함량이 높다(15-19). 따라서 야관문 추출물의 피부 광노화 억제 (20), 항산화 및 미백효과에 대해 일부 연구가 이루어졌으나 (15-18) 실질적으로 화장품 조성물 내에 첨가되어져 유효적 인 피부 광노화 억제 및 개선을 나타내는지에 관한 연구결 과는 보고 된 바 없다. 본 연구에서는 야관문 에탄올 추출물 이 화장품 조성물에 첨가되어져 실질적으로 분자생물학적 수준에서부터 피부 형태학적 수준에까지 피부 광노화 개선 에 주요하게 유효성을 나타내는지 확인하고자 야관문 에탄 올 추출물의 생리 활성과 피부 광노화가 유발된 동물모델을 대상의 피부 광노화 개선 효능평가를 수행하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에서 사용되어진 야관문 에탄올 추출물(고형분 35%, 이하 야관물 추출물) 및 동물실험에 사용된 야관문 추출물을 함유한 화장품 조성물은 (주)소리소(Soriso Co., Gyeongsan, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 야관물 에탄 올 추출물은 야관문 100 g에 60% 에탄올 2 L를 가하여 60℃에서 6시간 추출 후 추출액을 50℃에서 1차 감압농축 후 원심분리하고 여과를 시킨 뒤 2차 감압농축한 것을 야관 물 에탄올 추출물로 하여 Table 1과 같은 배합비를 기초로 화장품 조성물을 제조하였다. 생리활성 물질의 함량 및 항 산화 활성 측정에 사용되어진 시료는 상기와 동일하게 얻어 진 야관문 추출물을 동결건조(FreeZone plus 12, Labconco, Kansas, MO, USA)하여 얻은 고형물을 50% ethanol에 녹여 사용하였다.

Table 1. Composition of formulations added with Lespedeza cuneata extract
Components Ratio (%)
Base sample (vehicle) Base sample containing Lespedeza cuneata extract
D. I. Water 56.75 56.55
EDTA-2Na 0.03 0.03
Allantoin 0.12 0.12
1,2-Hexanediol 3.00 3.00
Glycerin 5.00 5.00
Hydroviton 24 2.50 2.50
Konjac Mannan 5.00 5.00
Natrosol 250HHR (1%) 5.00 5.00
Hyaluronic Acid (1%) 10.00 10.00
Carbopol 940 (2%) 10.00 10.00
Ethanol 0.90 0.90
Emalex HC-40 0.70 0.70
Vitamin E Acetate 0.60 0.60
L-Arginine 0.20 0.20
Phenonip 0.20 0.20
Lespedeza cuneata extract (35%) 0.20
Total 100 100
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총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Min의 방법(21)을 변형하여 측정하 였다. 야관문 추출물 시료 1 mL에 10배 희석한 Folin- Ciocalteu reagent(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액 1 mL를 가하여 실온에서 5분간 방치한 후, 7.5% Na2CO3용 액 4 mL를 가하여 1시간 동안 추가 반응시켜 microplate reader(Infinite M200 PRO, Tecan, Männedorf, Switzerland) 를 이용하여 756 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페 놀 화합물 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 정량(mg of TAE/g)하였다. 총 플라보노이드 함량은 Jia 등의 방법(22)에 준하여 측정하였 다. 시료 1 mL에 5% NaNO2용액 150 μL를 가하여 실온에서 5분간 반응 후 10% AlCl3용액 300 μL를 넣고 5분 동안 추가 반응시켰다. 반응 종료를 위하여 1 M NaOH 1 mL를 가한 다음 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 총 플라보노이드 물질 함량은 catechin(Sigma-Aldrich)을 이용하여 작성한 표준곡선으로 부터 정량(mg of CAE/g)하여 결과를 나타내었다.

항산화 활성 측정

Yoon 등의방법(23)을변형하여1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH)법으로 야관문 추출물의 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 측정하였다. DPPH(Wako, Tokyo, Japan) 용액 5 mL에 50% ethanol을 이용하여 0.05, 0.1, 0.5, 0.75, 1 mg/mL의 농도로 용해시킨 야관문 추출물 0.5 mL를 혼합한 다음 15분 반응 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정되어진 흡광도는 다음 식을 통해 계산하여 전자공여능을 나타내었다.

EDA(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡 광도)×100

야관문 추출물의 superoxide anion radical 소거능 (superoxide anion scavenging activity, SSA)은 Na 등의 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법(24)을 변형하여 측정 하였다. 각 농도별 야관문 추출물 시료용액 0.1 mL에 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.4) 0.6 mL를 혼합 후, 0.4 mM xanthine(Sigma-Aldrich)과 0.24 mM NBT (Sigma-Aldrich)를 녹인 기질액 1 mL과 xanthine oxidase (0.049 U/mL) 1 mL를 가하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 1 mL 1 N HCl을 가하여 반응을 정지시킨 다음 microplate reader로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정되어진 흡 광도는 다음 식을 통해 superoxide aninon radical 소거능을 나타내었다.

SSA(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광 도)×100

실험동물 및 실험군

실험동물은 6주령 수컷(20∼27 g) HR-1 hairless mouse (Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan)를 분양받아 실험동물사 (온도 22.1±1℃, 상대습도 50±5%, 명암주기 12시간)에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험 전 기간 동안 사료와 물은 충분하게 공급하였다. 실험군은 Casagrande 등의 연구(25)를 참고하여 Table 2와 같이 5군으로 나누었 으며, 각 군당 3마리씩 사용하여 실험하였다. 동물실험 수 행에 관련된 모든 과정은 (재)대구테크노파크 바이오헬스 융합센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)원칙을 준수하여 수행하였다.

Table 2. Exper imental design of animals
Groups Experimental group
NO Non-UV treatment
CO UV treatment
AB UV treatment+vehicle
PCA UV treatment+vehicle containing 0.2% ascorbic acid
AS UV treatment+vehicle containing 0.2% Lespedeza cuneata
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피부노화 유발 및 시료도포

각 실험군별 마우스들을 자외선 조사용 cage에 가둔 후 60 mJ/cm2의 UVB 광량을 1 minimum erythema dose(MED) 로 하여 1주일 간격으로 1 MED씩 증가시켜 격일 간격으로 1주일에 3회, 5주 동안 배부에 조사하였으며, UVB 조사량 은 UV-radiometer(LP9021, Delta OHM, Padua, Veneto, Italy)로 측정하였다. 5주간의 광노화 유발 후, Table 2와 같은 조건의 시료 200 mg씩을 5주간 1일 1회 배부에 도포하 였다.

피부 홍반도 및 유수분 함량 측정

각 실험군별 마우스들의 피부 홍반도 측정은 Mexameter (MX18, CK electronic GmbH, Koin, Germany)를 사용하였 고, 피부 유분과 수분함량은 Sebumeter(SM825, CK electronic GmbH)와 Corneometer(CM825, CK electronic GmbH)를 사용하여 비침습적 방법으로 시료 도포기간 동안 주 1회 측정하였다.

피부조직의 형태학적 관찰

각 시료 도포 후 5주째 되는 날 실험동물들을 에테르 마취하고 주름 정도의 객관적인 평가를 위하여 실험동물 배부에 실리콘폴리머(SILFLO impression material, Flexico, Tokyo, Japan)를 이용하여 피부 주형(replica)을 제작하였으 며 skin visiometer(SV600, CK electronic GmbH)로 주름 형 태를 관찰하고 주름관련 인자 수치를 확인하였다.

피부조직의 조직병리학적 관찰

5주간의 시료 도포 후 조직병리학적 검사를 위해 각 실험 동물의 배부조직을 채취하여 10% 중성 formalin 용액에 24시간 동안 고정하였다. 고정된 조직은 피부전층을 포함 하는 절편을 취하여 탈수시킨 후, paraffin 블록에 포매하여 조직절편기(RM2125, Leica, Wetzlar, Germany)로 4 μm 두 께로 절단한 다음 polylysine으로 코팅된 slide에 붙여 사용 하였다. 조직절편은 xylene을 이용하여 paraffin을 제거하고 알코올과 증류수로 10분 동안 함수시켜 증류수로 세척한 후, 피부조직의 변화 양상을 관찰하기 위하여 Hematoxylin- Eosin(H&E) 염색을 실시하였다. 또한 진피 내 교원질 섬유 형태를 관찰하기 위하여 Masson trichrome 염색을 하였으 며, 피부손상 및 탄력정도는 Mucicarmine 염색을 통하여 관찰하였다.

피부조직내 항산화 효소활성 측정

피부조직 내 항산화효소 활성 측정을 위해 Biovision사가 제공하는 assay kit(BioVision Inc., Mountain View, Milpitas, CA, USA)를 이용하여 제공된 방법에 준하여 SOD, GST 및 CAT 효소활성을 측정하였으며, 각 시험 항목에 사용된 피부 조직 마쇄액 내 단백질 함량을 BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific Inc., Walham, MA, USA)를 사 용하여 정량하고 protein(mg)당 각 효소활성으로 계산하여 결과를 나타내었다.

피부조직 내 유해 산화효소 활성 및 산화물질 생성 저해 능 측정

피부조직 내 산화효소 활성 및 산화물질 함량 측정을 위하여 Biovision사가 제공하는 assay kit를 사용하여 xanthine oxidase(XO) 효소활성과 thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 지질과산화물 함량을 측정하였 으며, 각 시험 항목에 사용된 피부 조직 마쇄액 내 단백질 함량을 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하고 protein(mg)당 효소활성 및 함량으로 계산하여 결과를 나타 내었다.

피부조직의 유전자 발현량 측정

각 실험동물들의 배부부위에서 채취한 조직은 RNAlater RNA Stabilization Reagent(Qiagen, Hilden, North Rhine- Westphalia, Germany)를 사용하여 보관 후 본 실험에 이용 하였다. RNeasy fibrous tissue mini kit(Qiagen)를 이용하여 각 조직으로부터 추출한 RNA 2 μg을 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific Inc., Walham, MA, USA)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다. cDNA 0.5 μL, forward primer(10 pmole) 1 μL, reverse primer(10 pmole) 1 μL, SYBR Green supermix(Bio-rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) 12.5 μL, 멸균증류수 10 μL를 혼합 하여 PCR 반응액을 준비하였으며, 사용된 PCR primer의 염기서열은 Table 3과 같다(26). Bio-Rad iCycler real time PCR system(IQ5 Real time PCR detection system, Bio-rad Laboratories Inc.)을 사용하여 RT-PCR반응을 수행하였으 며, 각 실험군별 유전자들로부터 결과 되어지는 Ct(Threshold Cycle) 값에 근거한 GAPDH 유전자 대비 발현 량을 백분율(%)로 나타내었다.

Table 3. Oligo pr imer sequences of target genes for RT-PCR
Gene name primer sequence
GAPDH Forward 5'- GAG CCA AAC GGG TCA TCA -3'
Revese 5'- CAT ATT TCT CGT GGT TCA CAC C -3
c-Jun Forward 5'- GGC TAG ACT GCA GAT GAA CTC C -3'
Revese 5'- CAG TAA TCA GCT TTC ATC AAA TTA AAA -3'
c-Fos Forward 5'- TTG CTG CTT CCA ACC TCA GT -3'
Revese 5'- AGC TTC TCA GCC CCT CTC TC -3'
p38 Forward 5'- TCG GAG CTT CCA TGA TTT CT -3'
Revese 5'- CTG AAT TCC ATC CCC ATG AT -3'
JNK Forward 5'- AAC TGT TCC CCG ATG TGC T -3'
Revese 5'- TCT CTT GCC TGA CTG GCT TT -3'
PAK Forward 5'- TGA CAA TAT TCT GCT GGG AAT G -3'
Revese 5'- TGC ACA GAA TCC AAA GTC AGT T -3'
MMP-3 Forward 5'- TTG TTC TTT GAT GCA GTC AGC -3'
Revese 5'- GAT TTG CGC CAA AAG TGC -3'
TNF-α Forward 5'- AGT TCT ATG GCC CAG ACC CT -3'
Revese 5'- CGG ACT CCG CAA AGT CTA AG -3'
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통계분석

본 연구의 모든 실험 결과는 3회 반복 실험에 대한 평균값 (mean)과 평균의 표준편차(SD)로 나타내었으며, 각 그룹간 의 통계적 유의성은 SPSS(10.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 검정을 적용하여 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

결과 및 고찰

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

식물 내 페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로써 다양한 분자구조와 분자량에 의 해 정의된 플라보노이드, 안토시아닌, phenolic acid 등 다양 한 물질이 포함된다. 식물로부터 얻어지는 페놀성 화합물 은 안전한 천연 항산화제로써 알려져 있으며 이들이 가지는 phenolic hydroxyl(OH)기는 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여 항산화, 항염증, 항암, 항균작용 등의 다양한 생리활성 기능을 나타냄으로써 자외선 노출, 질병, 상처 등이 유도하는 산화적 스트레스 및 생물학적 손상에 대한 방어 작용에 기여한다(23,24,26,27). 본 실험에 사용되어진 야관문 추출물의 생리활성물질 함량을 측정한 결과, 총 폴 리페놀 함량은 134.98±1.70 mg/g으로 확인되었으며 총 플 라보노이드 함량은 16.20±0.05 mg/g으로 확인되었다. 본 결과는 Cho 등(18)이 야관문 잎 추출물의 총 페놀 및 플라보 노이드의 함량을 평가한 결과와 비교해 낮은 함량을 보였으 나 이는 원료 및 추출 용매조건이 상이한 영향으로 여겨지 며 본 실험에 사용되어진 야관문 추출물 역시 폴리페놀 및 플라보노이드 성분을 함유함으로써 유용한 생리 활성능 을 나타내는 소재로써 사료된다.

항산화 활성

과다한 자외선 노출에 의해 일어나는 피부조직 및 세포 에서의 생물학적 반응을 통해 생성되는 활성산소는 세포막 의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과산화 반응 을 일으켜 체내 과산화 지질의 축적을 야기하며 피부 내 항산화 방어체계를 손상시킴으로써 염증반응, 색소침착, 노화를 비롯한 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다 (29,30). 본 실험에 사용되어진 야관문 추출물이 함유하고 있는 생리활성물질이 가지는 항산화능을 평가하고자 활성 산소로부터 생성되어 체내 유해활성을 나타내는 oxygen free radical을 공여 및 소거할 수 있는 정도를 EDA와 SSA 측정을 통해 확인하였다(Table 4). 그 결과 야관문 추출물의 농도 의존적인 항산화능 효과를 확인하였으며, 0.05, 0.1 그리고 0.5 mg/mL 농도에서 각 항산화능 결과를 비교해 보았을 때 동일 농도조건에서 EDA에 의한 항산화효과 보 다 SSA에 의한 항산화 효과가 각 5배, 3.5배, 1.5배 높음을 알 수 있었다. 전자공여능은 free radical에 전자를 공여하여 지질과산화 반응을 억제함으로써 항산화 작용에 기여하는 정도로 평가 할 수 있으며(31), 산화적 스트레스 반응에 의해 생성된 superoxide anion radical은 생체에 독성이 강하 여 DNA 및 단백질 등 생체조직에 산화적 변성 및 손상을 유도함으로써 이 radical을 소거하는 정도 역시 항산화 작용 에 기여하는 정도로 평가 될 수 있다(32). Kim과 Kim(16)은 야관문 종자의 열수 및 에탄올 추출물로부터 얻은 에탄올 분획물(10 μg/100 mL)의 전자공여능이 각각 39.5%, 95.3% 로 높은 활성을 보이는 것으로 보고하였으며, Kim 등(17)은 야관문 메탄올 추출물과 용매 분획물이 가지는 SOD 유사 활성도를 보고한 바 있다. 본 실험에서 사용되어진 야관문 추출물도 전자공여능은 물론 특히 free radical 소거를 통한 항산화 작용이 우수한 항산화 소재로써 활용이 가능할 것으 로 사료되며, 자외선으로부터 유발되는 산화적 스트레스로 부터 피부를 보호 및 개선하는데 도움을 줄 것으로 기대된 다.

Table 4. Antioxidative activity of Lespedeza cuneata extract
Antioxidant ability Concentration of samples (mg/mL)
0.05 0.1 0.5 0.75 1
EDA(%) 6.10±0.28 12.49±0.39 55.79±1.57 73.91±2.07 87.25±1.03
SSA(%) 30.87±4.28 41.96±1.39 80.23±4.42 85.47±4.15 87.49±6.11

* Data represent mean±SD of triplicate determination.

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피부 홍반도 및 유수분 함량 변화

자외선에 과다노출 시 유도되는 산화적 스트레스에 의한 피부 손상은 각질층의 지질산화를 유발하면서 조직내 수분 과 유분을 유지하려는 능력을 저하시킴으로써 피부는 건조 해지고 주름이 증가하게 되고 결과적으로 노화가 촉진되게 된다(3,30,33). 또한 자외선 노출에 의해 임상적으로 관찰되 는 피부손상은 혈관확장 및 일광화상 등에 의한 피부 홍반 과 통증 및 소양증 등이 있으며(34,35), 홍반은 자외선 조사 에 의해 심화된 염증반응과 histamine의 방출로 인한 혈류량 증가로 발생된다(36). 자외선 노출과 시료처리 후 실험동물 모델에서의 홍반과 유수분함량 변화 결과를 Table 5에 나타 내었다. Jeon 등(36)의 연구에서 피부 광노화 유발을 위한 UVB 조사에 의해 홍반도가 증가된 바와 같이 본 연구에서 도 UVB 조사만 이뤄진 대조군(CO)의 홍반도는 아무런 처 리를 하지 않은 정상군(NO)에 비해 42% 유의하게 증가하 였다. UVB 조사 후 조성물 베이스 시료를 처리한 AB군과 UVB 조사 후 ascorbic acid가 첨가된 시료를 처리한 양성대 조군(PCA)은 CO군에 비해 유의적으로 낮은 홍반도를 나타 냈으며, 야관문 추출물이 첨가된 시료를 처리한 AS군 경우, CO군에 비해 홍반도가 유의적으로 28% 감소하여 정상군 과 유사한 홍반도를 나타내었다. 이는 야관문 추출물이 UVB 조사에 의해 발생되는 피부 홍반을 개선하는데 효과 가 있으며, 피부 홍반발생에 관여하는 염증반응을 경감시 키는 것에 기여하고 있는 것으로도 생각되어진다. 각 실험 군별 피부 유수분 함량 변화를 측정한 결과, NO군에 비해 CO군에서 수분은 약 51%, 유분은 약 76% 감소하였다. AB 군과 PCA군은 CO군과 비교해 수분함량은 각각 65%, 79% 유의적으로 증가하였으며, 유분함량은 증가하는 경향은 보 였으나 유의적이지는 않았다. AS군 역시 CO군에 비하여 수분함량은 유의적으로 약 131% 증가하여 정상군과 유사 한 수준을 나타냈으며, 유분함량은 증가하는 경향은 보였 으나 유의적이지는 않았다. 상기 결과를 통해 야관문 추출 물이 UVB 조사에 의한 피부손상으로 발생된 홍반과 수분 함량 손실에 빠른 개선효과를 나타내며 피부 광노화에 의한 피부손상을 개선 및 치유할 수 있는 제품개발 소재로써 적합한 것으로 사료된다.

Table 5. Changes in erythema index, moisture and lipid capacity of HR-1 hairless mouse skin after 5 weeks application of compounds
Groups Erythema (AU)1) Moisture (AU)1)) Lipid capacity (AU)1)
NO 143.15±18.79c 41.21±3.40ab 1.07±0.39a
CO 203.81±13.56a 20.07±2.00d 0.26±0.17b
AB 175.07±8.67b 33.14±6.37c 0.52±0.17ab
PCA 172.44±12.31b 35.88±3.33bc 0.55±0.40ab
AS 146.37±9.94c 46.42±4.17a 1.00±0.67ab

* Values are mean±SD of 3 mouse.

1) AU: Arbitrary unit.

a-d Values within a different superscripts letters are significantly different each other groups at a p<0.05.

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피부조직의 형태학적 변화

자외선 노출에 의한 피부손상으로 피부는 건조해지고 탄력성이 감소되고 주름이 형성되어 외형적으로 관찰되는 피부노화가 일어나게 된다(37,38). UVB 조사 및 시료처리 가 피부주름형성에 미친 영향을 형태학적으로 평가하기 위해 제작된 각 실험군의 피부주형은 Fig. 1과 같다. NO군 에 비해 CO군은 피부 표면에 굵고 깊은 주름이 형성된 것을 확인 할 수 있었으며, AB군은 CO군보다 가는 주름이 관찰되었으나 NO군에 비해서는 많은 주름이 형성된 것을 확인 할 수 있었다. PCA군과 AS군은 CO군에 비해 주름이 개선되었으며, 특히 AS군의 경우 NO군에 가까운 피부 형 태가 관찰 되었다. 수치적 피부주름 평가인자들을 비교 확 인한 결과(Table 6), AB군, PCA군, AS군 모두 CO군과 비교 하여 주름의 면적과 깊이가 감소하였으며, AS군의 경우 주름 면적과 깊이는 CO군에 비해 각각 약 75%, 46%로 감소되는 가장 큰 효과를 나타내었다. 또한, 주름형성 정도 를 의미하는 mean form factor에서는 AS군이 유의적으로 정상군과 유사한 결과를 나타냈다. 상기 결과로 야관문 추 출물이 자외선 노출에 의해 유발되는 주름형성 즉, 피부 광노화에 의한 미용적 피부손상에 대한 개선에 적합한 소재 인 것으로 사료된다.

Table 6. Changes in wr inkle related factors of HR-1 hairless mouse skin after 5 weeks application of compounds
Groups Total wrinkle area (mm2) Wrinkle depth (µm) Mean form factor
NO 0.78±0.16d 3889.13±565.95d 0.74±0.02a
CO 8.71±1.57a 11359.59±98.90a 0.60±0.02c
AB 5.66±1.38b 8029.61±977.86b 0.64±0.03bc
PCA 3.55±0.38c 8261.60±788.62b 0.67±0.02b
AS 2.15±0.69cd 6144.67±1105.25c 0.75±0.05a

* Values are mean±SD of 3 mouse.

a-d Values within a different superscripts letters are significantly different each other groups at a p<0.05.

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Fig. 1. Photographs of replica image of HR-1 hair less mouse skin after 5 weeks photoaging inhibition effect experiment. NO, Normal group; CO, UV treated group; AB, UV+vehicle treated group; PCA, UV+vehicle containing 0.2% ascorbic acid treated group; AS, UV+vehicle containing 0.2% Lespedeza cuneata treated group.
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피부조직의 조직병리학적 변화

자외선 노출은 활성산소종을 다량 생성하여 염증반응을 증가시켜 피부조직 구성성분의 불균형적 형성을 유발함으 로써 피부구성 조직파괴와 각질층 증가 및 표피 비후화 등의 피부조직손상을 유발한다(30,39,40). H&E 및 Masson trichrome 그리고 Mucicarmine 조직염색을 통해 각 시험군 의 조직병리학적 변화를 관찰하고자 하였다. H&E염색을 통해 관찰한 결과(Fig. 2A), NO군은 표피가 매끄럽고 진피 층을 구성하는 조직배열이 규칙적으로 나타난 반면, CO군 에서는 표피층이 NO군에 비해 비후해졌고 진피층 내 조직 배열이 불규칙적이며 염증관련 세포의 출현이 관찰되었다. AB군과 PCA군에서는 CO군에 비해 표피층의 비후와 염증 세포의 출현이 감소된 양상을 보였으며, AS군에서는 표피 및 진피의 손상이 거의 완화되어 NO군에 가까운 양상을 보였다. 진피층 내 콜라겐구성 조직 변화 양상을 Masson trichrome 염색으로 확인한 결과(Fig. 2B), NO군에서는 콜 라겐 섬유가 규칙적으로 구성되어 있었으나 CO군을 비롯 한 AB군과 PCA군에서 자외선 조사에 의한 콜라겐 조직의 파괴로 불규칙적인 배열을 나타내며 정상적인 조직형태를 이루지 못하였다. AS군에서는 NO에 가까운 콜라겐 섬유조 직형성과 진피조직형태를 보임으로써 처리되어진 시료가 손상된 진피조직의 재생에 효과를 나타낸 것으로 확인되었 다. 진피의 섬유성분과 세포들 사이에는 뮤신(mucin) 또는 점다당질(mucopolysaccharide)라고 불리는 세포외 물질이 수분 균형과 다른 조직 성분들을 지지하는데 도움을 주며 광노화에 의해 건조해진 피부에서 그 함량이 낮아진다고 보고된 바 있다(30). 상기 결과에서 야관문 추출물의 도포가 피부 수분 함량을 증가 시킬 수 있음을 확인하였으며, 이러 한 야관문 추출물의 보습 효과가 진피의 세포외 물질 함량 감소를 막음으로써 진피조직의 재생에 도움을 줄 수 있다. Mucicarmine 염색 결과(Fig. 2C), NO군에 비해 CO군과 AB 군에서 조직 내 뮤신이 감소된 반면 PCA군과 AS군은 NO군 과 유사한 정도의 뮤신 함유를 나타내었다. Nevia(41)은 현재 피부노화억제 및 개선에 잘 알려진 retinoid 라고도 불리는 vitamin A 유도체인 tretinoin이 피부 광노화에 대한 피부 재생효과에 있어서 항산화 작용(42) 외 muconous substance 증가에 도움을 준다는 긍정적 결과을 보고한 바 있으나 retinoid 피부염이라는 자극성 접촉피부염을 유발시 키는 부작용을 나타낸다고 결과도 보고되고 있다(43). 상기 결과를 통해 야관문 추출물이 광노화로 인해 손상된 조직개 선과 진피 내 수분함량과 조직구성에 기여하는 세포외 물질 형성에 유익하게 작용함을 확인함으로써 피부노화 개선 효과에 기여할 수 있는 대체 천연소재로써 가능성을 확인하 였다.

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Fig. 2. Histological observation on HR-1 hair less mouse skin after 5 weeks exper iment to evaluate the inhibitory effect of test compounds on photoaging. A, Hematoxylin-Eosin stain; B, Masson trichrome stain; C, Mucicarmine stain. NO, Normal group; CO, UV treated group; AB, UV+vehicle treated group; PCA, UV+vehicle containing 0.2% ascorbic acid treated group; AS, UV+vehicle containing 0.2% Lespedeza cuneata treated group.
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피부조직 내 항산화 효소활성

산화적 스트레스에 의해 생성된 활성산소에 의해 유도되 는 손상을 방어하기 위해 생체 내에서는 유해 산소화합물을 제거 및 분해를 위한 해독작용이 일어나며 SOD, CAT, GPX 및 GST 등과 같은 항산화 효소가 그 역할을 한다(44,45). 각 실험군의 피부 조직 내 산소 해독계 효소로써 알려진 SOD, GST 및 CAT 활성을 측정하였으며 그 결과는 Table 7과 같다. superoxide radical(O2-)을 산소분자(O2)와 과산화 수소(H2O2)로 변환시켜 생체 내에 유독하게 작용하는 활성 산소를 제거해 주는 역할을 하는 SOD 활성측정 결과, CO군 은 NO군 대비 약 17% 유의적으로 감소되었으며 CO군과 대비하여 AB군과 AS군에서는 SOD활성이 각 9.5%, 20.5% 유의적으로 증가하였고 AS군의 경우, NO군에 유사한 활성 을 나타냈다. 대사과정 중 생성된 활성산소 및 친전자성물 질을 glutahione과 함께 결합시켜 제거함으로써 항산화 기 작을 나타내는 GST의 활성측정 결과, CO군은 NO군 대비 21% 정도 유의적으로 감소하였으며, CO군과 대비하여 PCA군과 AS군은 각각 14.6%, 35.3% 유의하게 증가되었음 을 확인하였으며 AS군의 경우 NO군보다 더욱 향상된 GST 활성을 보였다. Lee와 Song(46)은 한방 소재인 자초 추출물 이 SOD 활성을 증가시켜 광노화를 억제시킨 효과를 보고 하였다. 또한 Kim과 Kim(47)은 UVB로 손상된 피부에 상엽 과 상지 추출물을 도포 시 UVB 조사 되어진 대조군에 비해 SOD와 GST 활성이 증가됨을 확인하여 항산화 활성물질의 도포가 피부의 활성산소 소거에 효과가 있음을 보고하였 다. 본 연구결과에서도 야관문 추출물의 생리활성물질에 의한 항산화 활성이 피부 조직에 영향을 주어 피부 조직 내 SOD와 GST 활성을 증가시키는데 기여한 것으로 사료된 다. 산화적 스트레스에 의해 생성된 대사산물인 과산화수 소를 물로 환원시키는 항산화 기작을 통해 생체 내 과산화 적 손상방어에 관여하는 CAT 활성측정 결과, CO군은 NO 군 대비 약 39% 정도 유의적으로 감소하였으며, CO군과 대비하여 AB군과 AS군에서는 각각 23%, 53% 유의적으로 증가하였고 AS군의 경우 NO군과 유사한 활성을 나타냈다. 이는 Lee 등(48)이 UVB 조사에 의해 손상된 CAT 활성이 탄닌 추출물 처리에 의해 유의적으로 증가한 보고와 일치하 였다. 따라서 야관문 추출물은 자외선 노출에 의해 손상된 피부조직 내 산화방어기전인 항산화 효소활성을 개선 및 증가시킴으로써 유해 활성산소 제거에 도움을 주어 피부조 직의 손상을 경감 및 개선시키는데 기여하는 것으로 사료된 다.

Table 7. Skin superoxide dismutase, glutathione and catalase activities after 5 weeks application of compounds
Groups SOD activity1) GST activity2) CAT activity3)
NO 18.17±0.09a 17.12±0.51b 1.00±0.09a
CO 15.11±0.29c 13.61±0.33d 0.61±0.02c
AB 16.54±0.46b 14.42±0.50d 0.75±0.02b
PCA 15.31±0.84c 15.60±0.25c 0.72±0.10bc
AS 18.21±0.51a 18.42±1.12a 0.93±0.01a

* NO, Normal group; Co, UV treated group; AB, UV+vehicle treated group; PCA, UV+vehicle containing 0.2% ascorbic acid treated group; AS, UV+vehicle containing 0.2% Lespedeza cuneata treated group.

* Values are mean SD of 3 mouse.

1) Unit: inhibition rate (%)/protein (mg).

2) Unit: µmol (mmol/min/mL)/protein (mg).

3) Unit: mU/protein (mg).

a-d Values within a different superscripts letters are significantly different each other groups at a p<0.05.

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피부조직 내 유해 산화효소 활성 및 산화물질 생성 저해능

XO는 생체에 존재하는 유해산소 생성계 효소로 superoxide anion radical 생성하며, UVB 조사에 의해 손상 된 피부 조직에서 그 활성이 증가하며, 생성된 유해산소는 생체 내 지질과산화물 축적을 유발하여 조직 손상 및 노화 를 초래한다(49-51). 따라서 XO 활성도 측정과 지질과산화 물 함량 측정은 산화적 스트레스에 의한 생체 손상정도를 예상할 수 있게 한다. 각 실험군의 XO 활성과 지질과산화 지표로 사용되는 TBARS 함량 측정 결과는 Table 8에 나타 내었다. XO 활성측정 결과, CO군은 NO군 대비 약 36% 유의적으로 증가하였으나 AB군과 PCA군은 약 21% 그리 고 AS군은 약 32%로 모두 CO군과 대비하여 유의적으로 감소된 활성을 나타내었다. TBARS 함량측정 결과, CO군 은 NO군 대비 64%의 유의한 증가를 나타내었으며, AB군 은 CO군 대비 약 13% 감소하였고 PCA군과 AS군은 CO군 대비 각 36%, 33%의 유의적인 감소를 나타내며 NO군 조직 내 지질과산화물 함량과 유사하였다. 이는 Kim 등(20)의 자외선 노출로 유발된 피부 광노화를 억제하기 위한 야관문 에탄올 추출물 도포 시 농도 의존적으로 XO 활성과 TBARS 함량이 유의적으로 감소하였다는 보고와 일치하였다. 이상 의 결과를 토대로 화장품 조성물 내 함유된 야관문 추출물 이 자외선 노출에 의해 발생되어 피부조직손상에 관여하는 산화효소 활성과 지질과산화물 형성을 저해 및 제거하는데 도움을 주어 피부 광노화를 개선할 수 있는 효능을 가지는 제품소재로써 개발이 가능할 것으로 사료된다.

Table 8. Skin xanthine oxidase activity and thiobarbitur ic acid tractive substance contents after 5 weeks application of compounds
Groups XO activity1) TBARS contents2)
NO 0.14±0.01bc 0.55±0.04c
CO 0.19±0.01a 0.90±0.04a
AB 0.15±0.01b 0.78±0.04b
PCA 0.15±0.01b 0.57±0.05c
AS 0.13±0.01c 0.60±0.06c

* NO, Normal group; Co, UV treated group; AB, UV+vehicle treated group; PCA, UV+vehicle containing 0.2% ascorbic acid treated group; AS, UV+vehicle containing 0.2% Lespedeza cuneata treated group.

* *Values are mean SD of 3 mouse.

1) Unit: mU/protein (mg).

2) Unit: nmol/protein (mg).

a-d Values within a different superscripts letters are significantly different each other groups at a p<0.05.

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피부조직의 유전자 발현량 변화

자외선 노출은 세포 성장인자 및 수용체들을 활성화시켜 extracellular signal-regulated kinase(ERK), c-jun aminoterminal kinase(JNK), p38등의 MAPKs(mitogen activated protein kinase) 신호전달체계를 활성화하여 피부손상을 유 도한다(52). JNK와 p38은 c-Jun 단백질 활성을 자극하여 c-Jun과 c-Fos 단백질로 이뤄진 전사인자인 AP-1 복합단백 질을 활성화 시켜 교원질 섬유를 분해시키는 MMPs의 활성 을 자극함으로써 피부조직 손상을 통한 주름생성을 촉진하 며, p21-activated kinase(PAK)가 MAPK 인산화에 관여하여 신호자극정도를 조절한다(26). 특히 MMPs 중 MMP-3는 자외선 노출에 의해 발현이 증가되어 교원질 및 proteoglycan, fibronectin과 같은 여러 종류의 기질단백질을 분해하여 주 름을 생성시킨다(52,53). 또한 피부의 자외선 노출은 산화 적 스트레스를 유발하여 전염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-α(TNF-α) 발현 증가를 유도하는 것으로 알려 져 있다(30,54). 따라서 본 연구에서는 야관문 추출물이 피 부 광노화에 의해 유도되는 유전자들의 발현에 어떠한 영향 을 미치는지 조사하였다(Fig. 3). MAPKs의 인산화효소로 작용하는 PAK 유전자 발현에서 CO군은 NO군에 비해 유의 적으로 약 20% 증가하였으며, PCA군과 AS군은 CO군 대비 각각 6%, 16%로 유의적인 유전자 발현 감소 결과를 나타내 었고 AS군의 경우 NO군과 유사한 PAK 유전자 발현정도를 나타내었다. p38 유전자 발현은 NO군 대비 CO군이 약 16% 증가하였으며, AB군, PCA군 그리고 AS군은 각각 CO군과 대비하여 약 5%, 9%, 11% 유의적으로 유전자 발현 감소 결과를 나타내었다. Chung 등(55)은 젊은층과 노인층들을 대상으로 피부 조직을 생검하여 유전자 발현을 조사한 결 과, 노인층에서 p38 유전자 발현이 증가되어 있음을 보고한 바 있다. 따라서 야관문 추출물에 의한 p38 유전자 발현의 감소는 야관문 추출물이 피부노화 개선에 효과가 있음을 분자 생물학 수준에서 보여준다. 자외선 노출에 의해 활성 화되는 전사인자로 알려진 AP-1 복합체를 구성하는 c-Fos 와 c-Jun 유전자 발현을 조사한 결과, AS군에서 CO군 대비 c-Fos 유전자 및 c-Jun 유전자 발현은 각각 29%, 11%로 유의적으로 감소하였다. 자외선 노출에 의해 피부조직을 구성하는 세포들이 분비하는 사이토카인들의 종류와 그 양은 조직손상과 치유에 중요한 의미를 지니며 이들 중 전염증상 사이토카인인 TNF-α는 MMPs의 발현을 증가시 켜 주름생성을 유도한다(56). 각 시험군의 피부조직 내 TNF-α 유전자 발현은 NO군 대비 CO군이 약 35% 증가하였 으며, PCA군과 AS군은 각각 CO군과 대비하여 약 11%, 18% 유의적으로 유전자 발현이 감소된 결과를 나타내었다. So 등(26)은 피부 주름 개선을 위해 개발한 홍삼 생약 복합 물에 의해 c-Fos, c-Jun 그리고 TNF-α 발현이 농도 의존적으 로 감소함을 보고한 바 있으며, 야관문 추출물도 이들 유전 자 발현 감소시킴으로 피부 주름개선에 효과를 일으키는 것으로 사료된다. 피부손상 및 주름형성에 직접 관여 하는 MMP-3 유전자의 발현은 Lee 등(57)의 보고와 같이 자외선 조사에 의해 MMP-3 유전자 발현은 증가되었으며, AS군의 경우 NO군과 유사하게 CO군 대비 18%로 유의적인 유전자 발현 감소결과를 나타내었다. 따라서 자외선에 노출된 피 부조직에 야관문 추출물의 도포는 p38과 PAK 유전자 발현 을 감소시키고 c-Jun 활성을 낮추어 MMP-3 분비를 감소시 킬 수 있으며 앞서 확인된 결과에서의 자외선 조사에 손상 된 피부 조직의 형태학적 및 조직학적인 회복은 야관문 추출물에 의한 MMP-3 유전자 발현 감소에 의한 것으로 사료된다. 야관문 추출물은 항산화성 생리활성물질 함유를 통해 자외선에 노출되어진 피부조직 내에서 산화적 스트레 스를 방어 할 뿐만 아니라 피부 광노화로 인해 유도되는 신호전달 및 염증반응과 교원질 손상에 관여하는 유전자들 의 발현을 억제 및 감소에 도움을 줌으로써 자외선 조사에 의해 손상된 피부조직 개선에 분자적 수준에서부터 형태학 적 수준까지 유효성을 가지는 소재임을 확인하였다.

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Fig. 3. Comparison in gene expression level of HR-1 hair less mouse skin after 5 weeks application of test compounds. A, PAK; B, JNK; C, p38; D, c-Fos; E, c-Jun; F, TNF-α; G, MMP-3. NO, Normal group; CO, UV treated group; AB, UV+vehicle treated group; PCA, UV+vehicle containing 0.2% ascorbic acid treated group; AS, UV+vehicle containing 0.2% Lespedeza cuneata treated group. The values are mean±SD of 3 mouse. The values within a different superscripts letters are significantly different each other groups at a p<0.05.
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요 약

본 연구에서는 화장품 조성물 내에 함유된 야관문 추출 물의 자외선 조사에 의한 피부 광노화를 억제 및 개선할 수 있는 효능을 조사하였다. 야관문 추출물 내 총 폴리페놀 함량은 134.98±1.70 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 16.20±0.05 mg/g 으로 정량되었다. 야관문 추출물은 농도 의존적으로 전자공여능 및 자유라디칼 소거능에 의한 항산 화 활성을 나타내는 것을 확인하였으며 동일 농도조건에서 전자공여능 보다 자유라디칼 소거능에 의한 항산화력이 더욱 높았다. 피부 홍반도는 대조군(CO)에 비하여 야관문 추출물이 함유된 시료를 도포한 시험군(AS)에서 28%의 홍반도 감소 효과를 보였으며, 피부 수분함량은 AS군에서 CO군과 비교하여 유의하게 증가하였다. 피부주형의 형태 학적 관찰을 통해 AS군에서 피부의 주름 면적과 깊이가 현저하게 감소하였음을 확인하였으며, 조직염색을 통해 AS군에서 자외선 조사에 의해 손상된 피부조직이 정상적 인 피부구성 조직과 유사하게 재생되었음을 확인하였다. 피부조직 내 유해산소 해독계 효소들인 SOD, GST와 CAT 활성은 CO군과 비교해 AS군에서 유의적인 증가를 보였으 며, 유해산소 생성계 효소 XO와 지질과산화물 함량은 유의 하게 감소하였다. 자외선 노출에 의해 발현이 유도되는 PAK, p38, c-Fos, c-Jun, TNF-α, MMP-3 유전자들은 CO군 대비 AS군에서 그 발현이 유의하게 감소함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 야관문 추출물은 항산화능을 나타내는 생리활성물질의 작용을 통해 피부 광노화에 의한 피부손상 과 주름형성을 개선하는데 분자적 수준에서 형태학적 수준 까지 효능을 나타내어 피부 광노화억제 및 개선 제품으로 활용이 가능 할 것으로 기대된다.

감사의 글

본 연구는 지식경제부의 지역산업기술개발사업(과제번 호: A000200004)의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드 립니다.

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