농식품자원 및 가공식품에 대한 비타민 D 함량 분석

본 연구에서 비타민 D 추출을 위해 사용된 피로가롤 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 에탄올, 메탄올 및 n-헥산은 Honeywell(Morris plains, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 표준품인 비타민 D2와 비타민 D3는 Sigma사의 순도 98% 이상의 HPLC급을 구입하여 사용하였으며, 그 외 실험에 사용된 시약은 특급 이상을 사용하였다.

본 연구에서 사용된 시료는 국민건강영양조사를 통해 생산되는 국민건강통계를 참고로 하여 국내 다소비, 다빈도 이용식품과 통계청의 농림어업 총 조사 등을 활용하여 선정한 농식품자원 및 가공식품을 선별하였고, 이렇게 선정된 시료들은 2018년 농촌진흥청이 국가표준 식품성분표 제 10개정판을 발간하기 위한 연구사업의 일환으로 선정되었다.

곡류 및 관련제품(8종), 감자 및 전분류(1종), 당류(5종), 두류(5종), 견과 및 종실류(5종), 채소류(11종), 버섯류(10종), 과일류(31종), 난류(12종), 유지류(1종), 차류(1종), 조리가공식품류(1종), 식용곤충 등 기타(5종)의 총 96종이었다. 확보된 시료는 국립농업과학원 기능성식품과(Wanju, Korea)에서 전처리 및 단순 가공 처리하여 균질화 과정을 거쳐 동결 후 배송되었으며, 배송된 시료는 –70℃ 냉동고에서 저장하여 분석에 사용하였다.

비타민 D 함량 분석을 위하여 균질화된 시료를 수산화칼륨과 피로가롤·에탄올 용액을 이용하여 검화시킨 후 동시 추출하였다(18). 갈색 검화 플라스크에 균질화된 시료 1-3 g을 정밀히 취한 후, 10% 피로가롤·에탄올 용액 40 mL을 가하여 약하게 진탕 혼합하였다. 여기에 90% 수산화칼륨용액 10 mL을 가하고 진탕 혼합하였다. 검화플라스크에 환류냉각관을 부착하여 비등수욕 중에서 60분간 가열하여 검화하였다. 검화 완료한 시료는 즉시 실온으로 냉각하고 갈색 분액깔때기로 옮긴 후 헥산 50 mL을 가하여 10분간 강하게 진탕 혼합하였다. 일정시간 방치하여 층 분리가 되면 상등액은 수집하고 남은 하층에 헥산 50 mL을 가하여 2회 더 반복 추출하여 상등액을 수집하였다. 수집된 전체 상등액에 1 N 수산화칼륨용액 100 mL을 가하여 진탕혼합한 후 방치하여 층 분리를 진행 후 혼탁한 물층을 제거하였다. 헥산층에 0.5 N 수산화칼륨용액 40 mL을 가하여 진탕한 후 방치하여 층 분리가 되면 물층은 다시 버리고 헥산층은 세척액이 페놀프타레인 시약에 알칼리반응이 나타나지 않을 때까지 충분히 세척하였다. 수세가 끝난 헥산층은 무수황산나트륨으로 탈수하여 갈색 감압농축플라스크에 옮겨 40℃ 이하에서 감압농축하였다. 농축하여 얻어진 잔류물에 메탄올 2 mL을 가하여 재용해시켜 0.45 μm membrane filter로 여과한 후, 비타민 D 분석용 시험용액으로 사용하였다.

비타민 D 분석은 시험용액을 HPLC-MS/MS(High performance liquid chromatography Mass Spectrometry, Triple Quad 4500 AB Sciex Instruments, Redwood city, CA, USA)로 분석하여 비타민 D2 및 D3 함량을 정량하였다. 분석조건으로는 C₁₈ column(Kinetex C₁₈, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 이용하여 이동상(5 mM ammonium acetate:methanol=5:95)을 40℃에서 0.7 mL/min으로 흘려주었으며, 질량분석기는 ESI positive 조건에서 capillary 온도 500℃, collision 가스는 Ar, nebulizer 가스는 N₂를 사용하였다. 이때 모든 시료는 3회 반복 분석하였으며, 비타민 D2 및 D3 함량의 평균값으로 나타내었다.

본 실험의 유효성 검증을 위하여 직선성(linearity), 정확도(accuracy), 정밀도(presision), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ) 및 회수율(recovery)을 측정하였다. 직선성은 비타민 D2와 D3 표준용액을 5, 10, 50, 100, 150, 200, 500 ng/mL의 농도가 되도록 메탄올에 희석한 후, LC-MS/MS에 주입하여 얻어진 피크면적으로부터 검량선을 작성하고, 직선성(R2>0.98)을 구하였다. 정확도와 정밀성 평가를 위하여 정기적으로 표준인증물질로 CRM(Certified Reference Material)인 SRM 1849a(Infant/Adult Nutritional Formula, NIST(National Institute of Standards and Technology), Gaithersburg, Maryland, USA)와 BCR-122(Margarine, IRMM(Institute for Reference Materials and Measurements), Geel, Belgium, EU)를 이용하여 분석방법의 정확성 및 회수율을 검증하였다. 또한 기기검출한계와 정량한계를 구하기 위하여 비타민 D2와 D3 표준용액을 각각 5 ng/mL농도로 6회 반복측정하여 각각의 표준편차에 3에 해당하는 농도를 검출한계로 하였으며, 10에 해당하는 각각의 농도를 정량한계로 계산하였다.

분석방법의 정밀도(precision)을 평가하기 위하여 품질관리시료로 건조표고버섯과 브로콜리 및 조제분유를 매회 분석하여 분석결과에 대한 품질을 관리하였다. 95% 수준의 경고한계(2SD: standard deviation)를 넘을 경우 재분석으로 판정하였으며, 99% 수준의 조절한계(3SD)를 넘을 경우 실험방법, 실험환경 등을 시정하여 허용범위에 들도록 관리하였다.

각 비타민 D의 분석 정량 값은 IBM SPSS Statistics 25 (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 시료간의 차이 유무를 분산분석(ANOVA)을 시행한 후, Duncan's multiple range test (p<0.05)를 실시하여 각 시료 간의 유의성을 검증하였다.

일반 곡류 5종, 곡류가공품 3종, 전분류 1종, 견과류 5종을 대상으로 분석한 비타민 D2 및 D3 함량의 평균값은 Table 1과 같다. 세계 3대 작물 중 하나인 옥수수는 단위면적당 곡실 수량이 가장 많고 어디서나 쉽게 재배가 가능하기 때문에 오래전부터 주요 식량작물로 재배하여 왔다. 옥수수의 종자에 따른 비타민 D 함량은 강다옥(건조)에서 비타민 D2가 4.11 μg/100 g 검출되었고 그 외 대학(생것, 삶은 것), 광평옥(건조), 다안옥(건조) 품종에서는 비타민 D가 검출되지 않았다. 이는 옥수수 품종에 따라서 비타민 D 함량의 차이가 있었으며, 또한 광평옥, 강다옥 품종은 농촌진흥청에서 사료용 옥수수로 개발되어 보급된 우수한 품종으로(19) 특히 강다옥 품종에서 비교적 높은 비타민 D2 함량이 존재함을 알 수 있었다.

곡류가공품 중 도토리묵에서 1.83 μg/100 g의 비타민 D2가 검출되었고, 견과류에서는 가공된 밤에서 0.85 μg/100 g, 도토리묵 가루에서 2.46 μg/100 g의 비타민 D2가 검출되었고 그 외 시료에서는 검출되지 않았다. 특히 도토리묵과 도토리묵 가루에서 비타민 D2가 확인되었고, 그 중 도토리묵 가루에서 더 높은 비타민 D2 함량을 나타내었다. 이는 도토리묵에서 낮은 비타민 D2 함량이 검출된 것은 원료 내의 다량의 수분함량에 기인한 것으로 판단되었다.

당류 5종, 두류 5종, 유지류 1종, 차류 1종, 조리가공식품류 1종을 대상으로 비타민 D2 및 D3 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 당류 중 땅콩 카라멜 함유 초코바, 쿠키 카라멜 함유 초코바 및 라이스 시리얼 함유 초코바에서 비타민 D2 함량이 각각 3.39 μg/100 g, 2.22 μg/100 g, 5.50 μg/100 g로 검출되었으나, 젤리 및 초콜릿은 비타민 D2가 검출되지 않았다. Kuhn 등(20)의 연구결과에 따르면 4종의 코코아 제품과 9종의 코코아 기반 식품의 비타민 D를 분석한 결과, 4종의 코코아 제품 중 코코아 파우더에서 2.98±1.65 μg/100 g, 다크 초콜릿에서 3.95±1.58 μg/100 g으로 비타민 D2가 가장 높은 함량을 나타내었다. 그러나 본 연구에서는 초콜릿에서는 비타민 D2가 검출되지 않았고, 초코바(땅콩, 쿠키, 라이스 시리얼)에서 비타민 D2가 검출되었다. 이는 초콜릿 내의 코코아 함량에 의한 차이로 인해 검출되지 않은 것으로 생각되며, 또한 초코바의 경우 땅콩, 쿠키, 라이스 시리얼의 함유와 함께 코코아 함량의 차이로 인해 비타민 D2 함량이 검출된 것으로 사료되었다. 이는 코코아 콩 자체에 비타민 D2의 전구체인 ergosterol를 함유하고 있어, 코코아기반 식품에서도 비타민 D를 함유하고 있다고 보고와 유사한 경향이었다(20).

또한 두류 중 팥빙수용 팥에서 1.52 μg/100 g의 비타민 D2가 검출되었고, 특히 두유에서는 비타민 D2와 D3의 함량은 각각 5.30 μg/100 g, 0.83 μg/100 g로 나타났다. 반면에 연두부, 녹두묵, 냉동유부, 현미유, 녹차라떼, 잣죽, 두부, 팥묵, 동결건조 두부에서는 비타민 D가 불검출 되었다. 미국, 케나다, 유럽에서 일일 비타민 D 섭취량은 15 μg/day(600 IU), 영국은 10 μg/day(400 IU)로 70세 이하의 모든 연령에 대하여 권고하고 있다(21). 그러므로 콩류 가공식품 중에서 두유와 초콜릿 가공제품은 부분적으로 비타민 D를 보충할 수 있는 우수한 식품소재로 판단되었다.

채소류 11종과 버섯류 10종을 대상으로 비타민 D2와 D3 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 아스파라거스(생것, 데친것), 비트(생것, 데친것), 산마늘 장아찌, 락교, 콜리플라워(생것, 데친것), 무씨싹(생것), 바질잎(생것, 데친 것) 등 11종의 채소류에서는 비타민 D가 모두 검출되지 않았다. 반면에 버섯류에서는 노루궁뎅이버섯(데친 것)과 아위버섯(데친 것)을 제외한 모든 버섯에서 비타민 D 함량이 검출되었다.

먼저 느타리버섯(생것), 느타리버섯(열풍건조), 느타리버섯(자연건조)에서 비타민 D2 함량이 3.85-644.72 μg/100 g 범위로 나타났으며, 생것보다 건조 후에 비타민 D2의 함량이 약 1.5-160배로 크게 증가하는 것으로 나타났다. 즉 열풍건조(느타리버섯)와 자연건조(느타리버섯)에 의해서 각각 6.04 μg/100g, 644.72 μg/100으로 비타민 D2의 함량의 큰 차이를 보이면서 자연건조한 느타리버섯이 영양학적으로 중요한 비타민 D2를 고농도 함유한 식품 소재로 판단되었다. 그러나 비타민 D3 함량은 느타리버섯(생것)에서 3.54 μg/100 g, 느타리버섯(열풍건조)에서 2.75 μg/100 g으로 약간 감소되었으며, 느타리버섯(자연건조)에서는 검출되지 않았다. 이는 느타리버섯 내에 존재하던 미량의 비타민 D3 함량이 건조과정을 거치면서 파괴되는 것으로 생각되었고, 특히 열풍건조보다 오랜 시간이 소요되는 자연건조 방식으로 생산된 느타리버섯에서 비타민 D3가 더 크게 손상된 것으로 사료되었다. 또한 Choi(22)의 연구에서 느타리버섯을 포함한 7종의 버섯에서 자외선조사에 의해 비타민 D2의 함량이 크게 증가하고, 특히 팽이버섯과 느타리버섯(갓)에서 비타민 D2의 함량이 크게 증가하였으며, 버섯의 표면적과 비타민 D2의 합성에는 연관성이 있다고 보고하였다. 본 연구에서도 생 느타리버섯보다 건조한 느타리버섯에서 비타민 D2의 함량이 크게 증가하였고, 특히 자연 건조한 느타리버섯에서 약 160배로 비타민 D2의 함량이 크게 증가하는 유사한 경향을 보임을 확인하였다.

동충하초는 배지로 사용된 원료에 따라 귀리 동충하초, 번데기 동충하초, 현미 동충하초 3종에 대해 비타민 D 함량을 분석하였다. 3종의 동충하초(생것)에서 비타민 D2가 3.15-8.22 μg/100 g함량으로 검출되었고, 번데기 동충하초에서는 비타민 D3 함량도 1.89 μg/100 g 검출되었다. 또한 노루궁뎅이버섯(생것)에서 비타민 D2가 1.14 μg/100 g으로 검출되었고, 아위버섯(생것)에서도 비타민 D2가 7.15 μg/100 g으로 나타났다. 반면에 노루궁뎅이버섯(데친 것) 및 아위버섯(데친 것)에서는 불검출로 나타났으며 이는 공기중 산소에 의해 산화작용이 일어나 비타민 D2가 검출되지 않은 것(23)으로 판단되며, 또한 데치는 과정에 의한 높은 수분함량에 의해서 검출되지 않은 것으로 판단되었다.

Krzyczkowski 등(24)의 연구에 따르면 건조된 노루궁뎅이버섯에서 ergosterol peroxide의 함량이 16±0.78 mg/100 g으로 나왔으며, Yokoyama 등(25)의 연구에서는 아위버섯 에탄올 추출물에서 ergosterol peroxide의 함량이 18 mg 함유되어있다고 보고하였다. Ergosterol은 비타민 D2의 전구물질로 생육방법, 보관방법 등에 따라 일부 비타민 D2로 전환되므로, 본 연구에서도 노루궁뎅이버섯과 아위버섯의 생것에서 비타민 D2가 존재함을 알 수 있었다.

과일류 31종(오미자청, 매실청, 감귤류 4종, 포도류 24종, 사과주스 1종)의 비타민 D2와 D3함량을 분석한 결과는 Table 4와 같다. 그 결과, 오미자청에서는 비타민 D2가 1.28 μg/100 g 검출되었으며, 감귤류 중 하례조생, 궁천조생 및 일남 1호에서 0.30-1.43 μg/100 g의 비타민 D2가 검출되었다. 반면에 매실청, 귤(유라조생), 사과주스 그리고 홍단, 진옥 등의 국내 및 국외 포도류 품종 24종에서는 비타민 D가 검출되지 않았다. 국내에서 가장 많이 재배되고 있는 품종인 온주밀감류에서 농촌진흥청이 개발해 보급한 신품종인 하례조생은 당도가 높고 신맛을 내는 품종으로 비타민 D2 함량도 1.43 μg/100 g으로 가장 높은 값을 나타내었고, 감귤 일남1호의 과육부분에서도 1.10 μg/100 g의 비타민 D2 함량을 나타내었다. 지금까지 감귤류에 대한 비타민 D 함량이 검출된 연구 보고는 없는 실정으로, 본 연구에서는 LC/MS 분석기술을 적용하여 미량의 비타민 D의 분석이 가능해 짐으로서, 국내에서 재배되는 감귤 품종에 따른 비타민 D2가 미량 검출되어진 것으로 사료된다.

그리고 난류 12종 및 기타 식품 5종의 비타민 D2와 D3 함량을 분석한 결과는 Table 5와 같다. 먼저 난류는 메추리알, 달걀, 오리알을 난백과 난황으로 분류하고 생것과 삶은 것으로 구분하여 각각 분석하였다. 그 결과 모든 난류의 난백에서는 비타민 D가 검출되지 않았으나, 난황에서는 메추리알, 오리알, 달걀 순으로 비타민 D3 함량이 높은 값을 보였다. 즉 메추리알의 난황에서 3.59-4.99 μg/100 g, 오리알의 난황에서는 20.85-22.30 μg/100 g, 달걀의 난황에서는 63.96-95.04 μg/100 g으로 가장 높은 함량의 비타민 D3를 함유하였다. 또한 메추리알, 오리알 및 달걀의 난황을 생것과 삶은 것으로 구분하여 비타민 D3 함량을 비교하면 알의 종류에 관계없이 열처리된 난황(삶은 것)에서 비타민 D3 함량이 더 증가하는 경향을 보였다. Schmid와 Walther (26)의 연구에서 동물성 식품 중 달걀의 노른자에서 비타민 D3의 함량은 0-56 μg/kg, 달걀 전체의 비타민 D3의 함량은 0-30 μg/kg으로 보고하였는데, 국내에서 생산된 계란의 난황에서 비타민 D3가 63.96-95.04 μg/100 g로 더 높은 값을 나타내었다. 이는 LC/MS의 분석기술을 적용하여 아주 미량의 비타민 D의 분석이 가능해짐으로서 얻어진 결과로 사료된다. 또한 메추리알, 오리알, 달걀에서 모두 생 난황보다 삶은 난황에서 비타민 D3의 함량이 더 높게 나타난다.

비타민 D가 풍부한 계란의 영양성분은 양계사료의 조성과 관련이 있어 사료에 비타민을 첨가함으로써 계란의 비타민을 강화하는 연구가 보고되었다(27). 즉 비타민 D가 강화된 양계 사료를 섭취한 닭으로부터 얻어진 계란은 최고 500 IU 비타민 D를 함유하고 있어서 하루 성인의 비타민 D 요구량을 제공할 수 있다고 한다. 또한 닭의 사육에서 제공되는 사료뿐만 아니라 닭의 품종, 사육조건 등에 따라서 비타민 D를 포함한 계란의 성분에 차이가 있을 수 있다고 하겠다. 따라서 국민 다소비 식품 중 비타민 D3가 가장 많이 함유된 식품은 계란의 난황이었고, 국내에서 생산된 달걀 내에 비타민 D 함량도 매우 높음을 알 수 있었다. 따라서 1일 섭취량이 15 μg인 미국 권장량을 기준으로 하루에 달걀 1개의 섭취는 우리 몸에서 필요로 하는 비타민 D를 충분히 공급할 수 있다고 판단되었다.

그리고 미래 식량자원으로 각광 받고 있는 식용곤충(쌍벌귀뚜라미, 누에 번데기, 누에유충, 벼메뚜기, 장수풍뎅이)을 포함하는 기타 식품류에서는 비타민 D 함량이 검출되지 않았다.

식용곤충으로 쌍벌귀뚜라미는 단백질 함량이 64% 이상으로 고단백질 식품이며 지방 함량 중에서 불포화지방산 함량이 60% 이상을 함유하는 유용한 식품소재이다(28). 식용곤충의 양식이 주로 실내에서 이루어져 비타민 D 합성이 제대로 이루어지지 않아, 식용곤충에서 비타민 D가 검출되지 않은 것으로 사료된다.

비타민 D 분석방법에 대한 유효성을 검증하기 위해, 참값이 알려진 SRM 1849a(Infant/Adult Nutritional formula)와 BCR-122(Margarine)를 이용하여 비타민 D의 회수율 및 정확성을 확인하였다. 그 결과 Table 6 및 Fig. 1과 같이, 비타민 D의 회수율은 96.15-108.18%이었고 RSD는 0.84-1.60%로 분석에 대한 높은 정확성을 확인하였다. 또한 비타민 D2 및 D3에 대한 LOD는 각각 2.052 μg/kg, 1.312 μg/kg이었고, LOQ는 각각 6.840 μg/kg, 4.372 μg/kg으로 측정되었다. 그리고 비타민 D 분석 값의 품질관리를 위해 분석품질관리도표(QC 차트)를 작성하여 분석 결과에 대한 신뢰도를 검증하였다(Fig. 2). 즉 분유(비타민 D3)와 브로콜리, 표고버섯 가루(비타민 D2)를 16회 이상 반복하여 비타민 D를 분석한 결과, 모든 데이터가 경고한계 범위 내로 유지되어 분석 품질에 대한 신뢰도를 확인하였다(Fig. 2).

Fig. 1. HPLC chromatogram of (A) vitamin D standard and (B) SRM 1849a.

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Fig. 2. Quality control (QC) chart of (A) broccoli & shiitake (vitamin D2), and (B) infant formula (vitamin D3) for accuracy of vitamin D analysis. when QC values deviate outside the 3SD confidence interval or showed a trend, the analytical run was rejected and corrective action taken.

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