서 론
포도(Vitis vinifera)는 세계적으로 광범위하게 재배되는 과실 중 하나로써 과실생산량의 대부분을 차지하며, 우리나라에서는 포도 생산량의 90%가 생과로 소비되고 있다(Park과 Kim, 2000). 또한, 포도를 이용한 음료, 주류 가공품 등으로도 다양하게 이용되고 있다. 포도에는 카테킨, 퀘르세틴, 안토시아닌 등의 폴리페놀 성분이 풍부하게 함유되어 있는데, 이러한 페놀화합물들이 건강에 유익한 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2014). 포도에 있는 페놀화합물 중 레스베라트롤(3,5,4’-trihydroxystilbene)이 주요 기능성 성분으로 알려져있다. 레스베라트롤은 미생물 감염에 의한 생물학적 또는 비생물학적 스트레스에 반응하여 식물에서 자연적으로 생성되는 방어물질 중 하나로 항암, 항바이러스, 신경보호 등의 다양한 효과가 보고되었으며(Kim 등, 1999; Romero-Perez 등, 2001), 주요 공급원으로는 포도, 땅콩, 오디, 적포도주 등이있다. 이 중 적포도주는 제조 및 발효과정의 차이로 인해 백포도주에 비해 그 함량이 많은 것으로 보고되었다(Orea 등, 2001). 포도에는 레스베라트롤뿐만 아니라, 식물성 페놀류인엘라그산 또한 함유되어 있는데, 엘라그산(ellagic acid)은 식물체 내에서 전구물질인 엘라기탄닌(ellagitannin)의 형태로존재한다. 엘라그산은 피부, 전립선, 췌장 등에서의 암세포활동을 억제하는 것으로 밝혀졌으며(Jang 등, 1998), 포도, 석류, 딸기 등에 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 국내에서는 포도의 기능성 성분 함량을 종자, 과피, 과육, 송이가지 등의 부위별로 분류한 연구가 많았으며(Cho 등, 2003; Kim 등, 2003), 엘라그산 분석은 주로 석류, 딸기등의 식물에서 국한하여 분리 정량한 연구가 보고되었다(Kim 등, 2013; Kim 등, 2012). 이에 본 연구에서는 송이가지를 제외한 포도의 가식부위 전체를 대상으로 하여 분석법의 유효성을 검증하였고, 포도에서의 엘라그산 분리정량을통해 포도의 다양한 생리활성을 살펴보았다. 또한 국내 유통되는 여러 종류의 포도주 및 포도주스 등의 포도가공식품에함유되어 있는 기능성 성분의 분석방법을 검증하여 그 함량을 보고자 하였다.
재료 및 방법
포도는 2019년 4월부터 10월까지 경기도 내 대형마트, 로컬푸드 매장, 전통시장, 농원에서 67건을 수거하였다. 포도의 품종은 MBA(MuscatBaileyA), Seedless(Sweetsapphire, Sables, Redglobe, Crimson, Muscat(Shine Muscat, Alexandria), Campbell Early, Kyoho, Green grape(Seneka, Niagara)로 분류하였다. 포도가공식품은 경기도 내 대형마트 및 백화점에서 시판되는제품을 구입하였으며, 와인은 원산지별로 알코올 농도 12-13.5%의 제품으로 제한하여 12건(레드와인 7건, 화이트와인 5건), 포도주스는 농축과즙이 함유된 과채주스 13건을 구입하였다. 포도는 세척 후 송이가지를 제외하고 동결건조를 진행하였다. Resveratrol과 ellagic acid 표준시약은 Sigma-Aldrich Co.(St.Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
포도(과피, 씨 포함)는 동결건조 후 막자사발에 분쇄하여시료 1 g 정량 후 80% MeOH 용액 10 mL를 가하여 ultrasonicator(5210R-DTH, BRANSONIC, Danbury, CT, USA)로 20°C, 10분간 추출하였다. 20분간 원심분리(Mega 17R, Hanil Science Industry, Incheon, Korea)하여(20°C, 10,000 rpm) 상징액을 취한 후 0.45 μm 주사기(syringe filter, Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과 후 HPLC(Agilent 1260 series, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다. 와인과 포도주스는 여과지(Adventec No.1, Adventec, Tokyo, Japan)로 여과 후 0.45 μm 주사기(syringe filter, Whatman International Ltd.)를 이용하여 여과한 후 분석하였다. 엘라그산은 dimethyl sulfoxide(Fisher scientific, Pittsburgh, PA, USA) 로 녹여 표준원액을 제조 후 methanol(Merk, Darmstadt, Germany)로 희석하여 표준용액을 제조하였다(Lee와 Kim, 2018). 제조된 표준원액과 표준용액은 냉장보관 하였으며, 용액의 특성을 고려하여 실험은 최대한 빛이 차단된 환경에서 이루어졌다.
HPLC 분석은 Agilent series HPLC(Agilent 1260 series, Agilent Technology)를 이용하였다. 레스베라트롤과 엘라그산의 분석칼럼은 각각 Symmetry(C18, 4.6×250 mm, 5.0 μm, Waters Co., Milford, MA, USA), Capcell pak(C18, 4.6×250 mm, 5.0 μm, Shiseido, Tokyo, Japan) 을 사용하였다. 레스베라트롤의 이동상 조건은 acetonitrile과 water를 40:60으로 혼합하였으며, 이때 유속과 칼럼의 온도는 0.3 mL/min, 30°C로 하였고, DAD/UV 검출기의 검출파장은 306 nm로 하였다. Ellagic acid의 이동상 용매 A는 1% formic acid, 용매 B는 100% acetonitrile을 사용하였다. A 용매를 7분간 90%에서유지(B 용매 10%), 21분간 45%(B 용매 55%), 4분간 30%(B 용매 70%), 8분간 다시 90%(B 용매 10%)의 기울기로 용출하는 조건이며, 0.5mL/min, 30°C의 조건으로 분석하였다. 이때 UV 검출기의 파장은 254 nm로 하였다.
검량선 작성을 위해 순차적으로 5개의 농도로 희석하였다. 표준용액의 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 농도별 면적에 대해 검량선을 작성하였으며, 검량선은 높은 직선성을 보였다(R2>0.999). 직선성 검증으로부터 얻어진 검량선의 기울기(S)와 표준편차(SD)를 이용해 검출한계(limits of detection, LOD)와 정량한계(limits of quantification, LOQ)를 확인하였으며, 표준용액을 각 3회 반복 측정하였다. Resveratrol의 LOD, LOQ는 각각 0.08 μg/mL, 0.24 μg/mL, ellagic acid의 LOD, LOQ는 각각 0.26 μg/mL, 0.55 μg/mL이었다.
총폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(Amerine과 Ough, 1980)을 이용하여 비색 정량하였다. 추출시료 0.1 mL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분간 방치하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하고, 30분 후 반응액의 흡광도 값을 UV-spectrophotometer(specord 205 BU, analytikjena AG, Thuringia, Germany)를 이용하여 750 nm에서 측정하였다. 페놀 화합물 함량은 표준물질인 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였고, gallic acid equivalent(GAE)로나타내었다.
총플라보노이드 함량은 aluminium chloride법(Moreno 등, 2000)을 이용하여 비색정량 하였다. 시료용액 0.5 mL에 95% 에탄올 1.5 mL, 10% aluminium chloride 0.1 mL, 1M potassium acetate 0.1 mL 및 증류수 2.8 mL를 첨가하여 혼합한 후, 실온에서 30분간 정치하여 반응시킨 다음 UV-spectrophotometer(specord 205 BU, analytikjena AG)를 이용하여 415 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드함량은 quercetin을 표준물질로 하여 작성한 표준검량곡선을통해 시료 추출물의 플라보노이드 함량을 환산하여 quercetin equvalent(QE)로 나타내었다.
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거능은 Blois (Blois, 1958)의 방법을 일부 변형하였다. 시료용액 160 μL에 0.2 mM DPPH액 40 μL를 가하여 혼합하고, 실온에서 30분간반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광도 비(%)로 나타내었다. 양성대조군은 ascorbic acid를 사용하였으며, 시료의 DPPH 전자공여능(electron donating activity, EDA)은 아래와 같이 나타내었다.
A: (Sample+DPPH) 30분 후 흡광도
B: Sample 흡광도
C: Control 흡광도
2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능은 ABTS cation decolorization assay법(Re, 1999)을 일부 변형하여 측정하였다. ABTS 용액 7.4 mM과 potassium persulphate 2.6 mM을 혼합한 다음, 암소에서 24시간 동안 방치 후 라디칼을 형성시켜 냉장보관 하였다. ABTS 용액은 실험 전 732 nm에서 흡광도가 0.70±0.03이 되도록 메탄올로 희석하였다. 추출물 40 μL에 ABTS 용액 960 μL를 첨가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량 곡선은 trolox를 사용하였다.
A: (Sample+ABTS) 30분 후 흡광도
B: Sample 흡광도
C: Control 흡광도
결과 및 고찰
포도의 레스베라트롤과 엘라그산의 함량은 Table 1에 나타내었다. 본 연구에서 분석한 포도 67건의 레스베라트롤 평균함량은 81.43±3.51 μg/g 이었다. 기존 연구(Kim, 등 2006)에 비해서는 낮은 함량을 보였다. 품종별 레스베라트롤은 Seedless, Green grape, Campbell Early, MBA(Muscat Bailey A), Muscat, Kyoho 순으로 함량이 높았으며, Seedless (143.66 μg/g)는 Kyoho(37.86 μg/g)에 비해 약 3.8배 높은 함량을 나타냈다. 레스베라트롤은 주로 포도의 과피에 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며(Woo 등, 2006), Seedless는 주로 껍질째 섭취하기 때문에 레스베라트롤을 더 많이 섭취할 수 있을 것으로 여겨진다. Jung 등(2020)에 따르면, Seedless 품종에 해당하는 Crimson SDS 품종의 레스베라트롤 함량이 가장 높게 나타나 본 연구와 동일한 결과를 보였다. 포도를 부위별로 분석한 기존 연구에서는 과육에서 레스베라트롤이 거의 검출되지 않았으며, 과경과 과축에 주로 고농도로 분포하는 것으로 나타났다(Lee와 Choi, 2009). 포도송이가지의 우수성이 알려져 있지만(Choi 등, 2017), 일반적인 포도의 가식부위를 고려해 본다면 과피와 과육을 활용한연구의 필요성이 증대될 것이라 여겨진다. 엘라그산의 평균함량은 6.89±0.51 μg/g 이었으며, 산딸기(34.35-55.25 mg/100 g FW)의 엘라그산 함량을 본 기존의 연구결과보다는 적은 함량을 보였다(Lee 등, 2014). 품종별로는 MBA, Green grape, Muscat, Campbell Early, Kyoho, Seedless 순으로 많이 함유했으며, 그중 MBA는 19.56 μg/g으로 Seedless(5.02 μg/g)에비해 약 3.9배 높은 함량을 보였다. 국내에는 주로 엘라그산의지표성분 개발에 관한 연구가 보고되었는데(Chea 등, 2014; Kim 등, 2012), 엘라그산의 기능성과 분리정량에 관한 연구가 더 필요할 것이라 여겨진다.
포도의 과피 색상은 Seedless 품종을 각각 포함하여 흑색계통은 Kyoho, Campbell Early, Sweetsapphire, 청색계통은 Muscat, Green grape, 적색계통은 Redglobe, Crimson, Sables를 분석대상으로 분류하였다(Table 2). 레스베라트롤은 청색계 품종이 108.13 μg/g으로 가장 많이 함유하고 있었으며, 흑색계 품종이 63 μg/g으로 가장 적은 함량을 나타내었다. 기존연구에서도 마찬가지로 레스베라트롤이 흑색계 품종에서 적은 함량을 보였으며, 성분별로 전혀 검출되지 않는 품종도 존재하였다(Chang 등, 2011). 전반적으로 청색계통의 청수 품종이 부위별로 각각 가장 낮은 함량을 보인 기존 연구(Chang 등, 2013)와는 상이한 결과를 보였는데, 이와 같이 과피색상에 따른 레스베라트롤의 함량 차이는 포도 품종의 유전적 배경이나 재배 원산지의 환경에 따라 달라지기 때문인 것으로여겨진다(Iacopini 등, 2008). 엘라그산은 흑색계 품종이 7.21 μg/g으로 가장 많이 함유했으며, 적색계 품종은 4.96 μg/g으로 가장 적은 함량을 보였다.
| Color | Resveratrol (μg/g) | Ellagic acid (μg/g) |
|---|---|---|
| Black | 63.02±13.211)b2) | 7.21±2.24 |
| Green | 108.13±8.67a | 6.83±0.67 |
| Red | 82.74±14.11b | 4.96±0.37 |
포도에서 총폴리페놀 함량 및 총플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 총폴리페놀 함량은 Campbell Early, Kyoho, MBA, Green grape, Seedless, Muscat 순으로높게 나타났으며, Campbell Early가 129.57 mg GAE/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었고, 가장 낮은 함량을 나타낸 Muscat(38.22 mg GAE/100 g)에 비해 약 3.4배 유의적으로높았다. 총 플라보이드 함량은 Campbell Early, Kyoho, Green grape, MBA, Muscat, Seedless 순으로 높게 나타났다. 총폴리페놀과 마찬가지로 Campbell Early가 82.43 mg QE/100 g으로 가장 높았으며, Seedless(8.55 mg QE/100 g)에 비해 10배 이상 높게 나타났다. Moon 등(2003)에 따르면, 총폴리페놀과 총플라보노이드의 함량은 일반적으로 포도의품종, 재배원산지, 재배환경, 숙성시기 등에 따라 달라진다는결과를 고려할 수 있으나, Campbell Early가 동일하게 다른품종에 비해 유의적으로 높은 함량을 보였다. 포도의 과피색상별 총폴리페놀과 총플라보노이드의 함량을 비교한 결과, 모두 흑색계 > 청색계 > 적색계 순으로 많이 함유했다. 특히총폴리페놀은 흑색계(116.86 mg GAE/100 g)가 적색계(43.89 mg GAE/100 g)에 비해 약 2.7배 유의하게 높은 함량을 나타냈다. 포도의 과피색은 과피에 축적되는 안토시아닌색소의 함량과 종류 등에 의해 결정되는데, 안토시아닌의 축적량이 많을수록 흑색으로 나타난다. 기존 연구에 의하면 총안토시아닌 함량은 총폴리페놀 화합물의 함량과 비교적 높은상관관계를 가지고 있으며(Kim 등, 2019; Yun 등, 2018) 이에 따라 안토시아닌 함량이 높은 흑색계 품종이 총폴리페놀함량 또한 높게 나타난 것으로 여겨진다.
Radical은 기질에 따라 선택적으로 작용을 하는 페놀성 물질이 존재하기 때문에, DPPH와 ABTS 두가지 모두 측정하여활성을 비교하였다. DPPH와 ABTS radical을 이용한 항산화력 측정 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 양성대조군인 ascorbic acid와 동일 농도(100 mg/mL)로 비교했을 때의 DPPH 소거활성은 각각 MBA(98.57%), Campbell Early(84.42%), Kyoho (76.1%), Seedless(57.13%), Green grape(55.59%), Muscat (30.43%)으로 나타났다. 이 중 MBA는 ascorbic acid(91.99%)보다 높은 활성을 보였다. ABTS 소거능은 양성대조군인 Trolox와 동일 농도로 비교 시 소거활성은 각각 MBA (102.98%), Kyoho(95.46%), Campbell Early(92.22%), Green grape(83.95%), Seedless(55.95%), Muscat(30.38%)로 나타났다. 항산화 활성은 모두 MBA 품종이 가장 우수하게 나타났다. 이는 머루 계통 과립의 추출물(101.4%)이 L-ascorbic acid (97.7%)보다도 뛰어난 소거능을 보였으며(Jeong 등, 2007), 산머루 종자 추출물의 DPPH radical 소거능이 Campbell Early에 비해 높았다는 결과와 일치했다(Park 등, 2003).
Table 4와 Table 5에 12종류의 와인과 13종류의 포도주스에 대한 레스베라트롤 및 엘라그산의 함량을 나타내었다. 레스베라트롤은 120-6,410 μg/L의 함량분포를 나타냈으며, 엘라그산은 60-6,740 μg/L의 함량분포를 보이며 레스베라트롤에 비해 높은 함량을 나타내었다. 레스베라트롤, 엘라그산 모두 적포도주가 백포도주에 비해 높은 함량을 나타냈으며, 기존의 연구 결과(Gerogiannaki-Christopoulou 등, 2006; Kim 등, 2009)와 일치했다. 와인을 만드는 품종이나 재배환경, 숙련도, 제조과정 등 여러 가지 환경요건에 의한 차이가 있으며, 적포도주의 특성상 포도의 과피를 포함하여 제조하고, 1, 2차의 발효과정이 추가되기 때문에 적포도주와 백포도주의함량 차이가 나는 것으로 사료된다. 포도주스의 기능성 성분함량은 시료간의 유의적인 차이는 없었으나, 100% 농축된 주스일수록 레스베라트롤과 엘라그산의 함량이 높았으며, 이는 포도주스 제조 시 농축의 과정을 거치며 그 함유량이 높아진 것으로 여겨진다.
포도주의 레스베라트롤과 엘라그산의 함량을 조사하기 위해 서로 다른 지역에서 제조된 포도주(알코올 농도 12-13.5%)를 구입한 후 분석하였다(Table 6). 분석 결과, 레스베라트롤의 함량은 프랑스(6,414 μg/L), 아르헨티나(3,690 μg/L), 호주(3,380 μg/L), 칠레(880 μg/L), 스페인(340 μg/L), 포르투갈(120 μg/L) 순으로 높았으며, 전혀 검출되지 않은 지역도 있었다. 엘라그산은 아르헨티나(6,740 μg/L), 스페인(5,334 μg/L), 프랑스(3,987 μg/L), 호주(3,682 μg/L), 칠레(1,530 μg/L), 포르투갈(411 μg/L), 이탈리아(355 μg/L), 독일(242 μg/L) 순으로, 레스베라트롤과 비슷한 경향을 나타냈다. 포도는 품종이나 지역 및 환경조건의 변화에 영향을 많이 받기 때문에, 재배 지역의 기후, 토양, 강수량 등의 여러 가지 다른 자연환경의 차이가 이러한 함량의 변화에 영향을 준 것으로 여겨진다.
Table 7에 따르면, 총폴리페놀과 총플라보노이드 모두 포도주가 포도주스의 2배 이상 높게 나타났다. 이러한 결과는포도주의 제조 공정에서 발효와 숙성을 통해 포도주에 함유되어 있는 페놀화합물의 함량이 증가된 것으로 여겨지며, 국내에서 유통되고 있는 포도주스는 대부분 수입산 농축과즙이사용되므로 제조방법에 따른 차이 또한 있을 것으로 사료된다. 포도주와 포도주스의 평균 DPPH 소거능은 각각 87%, 35%이며, ABTS 소거능은 90.12%, 70.66%로 나타났다. 포도주는 동일농도의 ascorbic acid(80.05%)보다 높은 DPPH 소거능을 보였으며, ABTS 소거능에서는 포도주와 포도주스모두 동일농도의 trolox(60.54%)보다 더 높은 ABTS 소거능을 보였다. 또한, DPPH, ABTS 활성 모두 포도주가 포도주스에 비해 높게 나타났다(Fig. 2).
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Total phenolics (GAE mg/L) |
Total flavonoids (QE mg/L) |
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|---|---|---|
| Wine | 347.64±17.511)*2) | 712.50±5.34* |
| Grape juice | 115.67±20.09 | 312.47±11.48 |
