숙성 기간에 따른 간장과 된장의 항당뇨 효과

전통 장류를 제조하고 있는 전국의 전통장류업체에서 숙성기간별로 간장 20종 및 된장 18종을 수집하였고, 일본 간장과 된장은 5년 미만의 제품을 국내 마켓에서 구입하여 냉장보관 후 실험에 사용하였다. 본 논문상에는 시판 제품임을 고려하여 제품명은 기재하지 않고 표 1과 같이 일련변호로 표기하였다. 본 제품은 숙성 기간에 따라 크게 4가지 숙성도로 하여 S(단기숙성)는 숙성기간이 5년 미만, M(중기숙성)은 10년 미만, L(장기숙성)은 15년 미만, E(초장기숙성)은 15년 이상으로 분류하였다. 시판되는 일본간장과 일본된장의 경우 숙성기간에 대한 정보가 없어 따로 표기하지 않았다.

α-Glucosidase inhibition assay 방법은 Tibbot과 Skadsen (28)의 방법을 이용하여 측정하였으며, 효소는 효모로부터 얻어진 α-glucosidase (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를, 기질은 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. α-Glucosidase는 0.2% BSA와 0.02% NaN₃가 포함된 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)에 0.7 unit이 되도록 녹여서 효소 용액으로 사용하였고, p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside는 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)에 10 mM이 되게 녹여서 기질 용액으로 사용하였다. 이 후 각 시료를 microplate에 50 μL 씩을 첨가하고 α-glucosidase 효소를 100 μL 취한 다음 25℃에서 5분간 실온에서 incubation하고 Multi Detection Reader (Infinite 200, TECAN Group Ltd, Switzerland)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 기질용액을 50 μL를 더하고 2분 뒤 multi detection reader (Infinite 200, TECAN Group Ltd)로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 저해율을 산출하였다.

실험동물인 ICR mice (6주령, male)은 (유)한일실험동물센터(Koatech, Seoul, Korea)에서 구입하여 7일간의 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 투여용량은 된장분말을 기준하여 1 g/kg으로 설정하였으며, 간장(액상) 1 g당 60 mg의 고형분이 확인됨에 따라 동일한 양을 계상하기 위하여 된장분말 1 g/kg 및 간장 60 mg(액상기준 1 g)/kg로 진행하였다. 이에 따라 각 실험군은 대조군, 간장 투여군(60 mg/kg)과 된장 투여군(1 g/kg)으로 구분하여 각 10두씩 임의 배치하여 실험을 진행하였다. 실험 식이는 일반 고형사료(Samtako, Gyunggi, Korea)를 급여하며 순화기간 중 음수는 필터링 된 음용수를 매일 갈아주며 자유롭게 섭취하도록 하였다. 사육기간 중 온도는 23±1℃, 습도 50±5%, 소음 60 phone이하, 조명시간 08:00-20:00 (1일 12시간), 조도 150-300 Lux, 환기는 시간당 10회-12회의 환경을 유지하였다. 본 실험은 원광대학교의 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다(승인번호 WKU17-65).

8시간 이상 절식한 실험동물은 미정맥에서 혈당기(Auto-check, Diatechkorea, Seoul, Korea)를 이용하여 공복혈당을 측정한 뒤 난괴법을 이용하여 군별로 임의배치하고 각각의 시료를 투여용량(1 g/kg)에 맞게 경구 투여하였다. 30분 후 다시 혈당을 측정한 후 실험방법에 따라 혈당상승인자(glucose)를 2 g/kg씩 모든 군에 투여한 후 이를 기점으로 30분 간격으로 120분까지 미정맥에서 혈당을 측정하였다. 이 후 혈당변화곡선의 면적(Area under the curve)을 구하여 각 실험군당 혈당변화를 분석하였다.

각 시험군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA (one-way analysis of variance test)를 실시한 후 유의성이 있는 경우, p<0.05 미만일 때 Ducan's multiple range test로 사후 검정하였다.

숙성기간별 간장과 된장의 항당뇨 효과를 확인하기 위해 먼저 α-glucosidase 억제 활성을 분석하였다. 100 μg/mL의 농도에서 간장의 α-glucosidase 억제 활성은 각 기간별로 단기 숙성(S)군 중 G2 실험군이 5.1%, 중기 숙성(M)군 중 G9 실험군이 17.4%, 장기 숙성(L)군 중 G11 실험군이 15.9%, 초장기숙성(E)군 중 G18 실험군이 4.3%, 일본 간장군 중 G21 실험군이 3.4%로 높게 나타났는데 이는 양성 대조군인 acarbose 실험군의 11.2%와 비교하였을 때 중기 숙성군과 장기 숙성군에서만 억제 활성이 더 높은 것으로 조사되었다(Fig. 1A). 이는 각 숙성기간별 간장 시료의 α-glucosidase 억제 활성의 평균값을 계산한 결과에서 더 두드러지게 나타났는데, 단기 숙성군이 4.8±0.3%, 중기 숙성군이 9.8±2.9%, 장기 숙성군이 12.8±1.8%, 초장기 숙성군이 3.5±0.4%로 장기 숙성군에서 억제 활성이 가장 높은 것으로 조사되었다(Fig. 1C).

Fig. 1. α-glucosidase inhibition activities of commercialized (A) 100 μg/ml of Ganjang and (C) aging period of Ganjang (B) 100 μg/ml of Doenjang and (D) aging period of Doenjang products in Republic of Korea. The data are shown as mean±S.E. ^a-dMean values not sharing a common superscript were significantly different among the groups (p<0.05).

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더불어 100 μg/mL의 농도에서 된장의 α-glucosidase 억제 활성을 분석한 결과 각 군별 가장 높은 활성을 보이는 실험군은 단기 숙성군에서 D2 실험군이 6.8%, 중기 숙성군에서 D11 실험군이 17.5%, 장기 숙성군에서 D14 실험군이 17.4%, 초장기 숙성군에서 D17 실험군이 6.2%, 일본 된장군에서 D20 실험군이 6.3%, 양성 대조군인 acarbose 실험군이 9.2%로 나타나 양성 대조 시료보다 중기 숙성군과 장기 숙성군에서 억제 활성이 더 높은 것으로 확인되었다(Fig. 1B). 이러한 양상은 각 숙성기간별 된장 시료의 α-glucosidase 억제 활성의 평균값을 계산한 결과에서도 유사하게 나타나 단기 숙성군은 5.3±3.6%, 중기 숙성군은 9.9±2.2%, 장기 숙성군은 16.3±0.6%, 초장기 숙성군은 3.6±1.8%로 숙성 기간별 억제 활성은 장기 숙성군에서 가장 높은 것으로 조사되었다(Fig. 1D).

체내 소장 상피세포에 존재하는 α-glucosidase는 소장에 존재하는 이당류의 소화 효소로써 섭취된 다당류는 α-amylase에 의해 이당류로 분해되고, 분해된 이당류는 α-glucosidase에 의해 단당류로 분해되어 흡수가 된다. 이때 α-glucosidase를 억제하여 이당류가 단당류로 분해되는 것을 막아 소장 융털에서의 흡수를 지연시켜 식후 혈당의 급격한 증가를 저해시켜 준다(39). 숙성 기간별 간장과 된장의 α-glucosidase 억제효과를 분석한 실험에서, 간장의 경우 100 μg/mL의 농도에서는 중기 숙성군과 장기 숙성군에서 높은 활성을 보였고 이를 바탕으로 숙성기간별 억제 활성을 평균값으로 계산한 결과에서 장기 숙성군은 중기 숙성군 보다는 높은 경향을 보였고, 단기 숙성군과 초장기 숙성군 보다는 유의하게 높은 것으로 조사되었다. 된장의 경우, 간장과 유사하게 100 μg/mL의 농도에서 중기 숙성군과 장기 숙성군에서 높은 활성을 보였는데 숙성기간별 평균값을 분석한 결과 장기 숙성군이 타 숙성기간과 비교하여 높은 경향을 보이거나 유의하게 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 간장과 된장 모두 10-15년 미만으로 숙성시키는 것이 식후 혈당의 급격한 증가를 감소시키는 데 이로운 효과를 보일 수 있음을 증명하는 근거가 될 수 있다.

경구포도당부하검사(Oral glucose tolerance test)를 실시하여 숙성기간별로 간장과 된장의 제품 한 종씩을 각각 선별한 후 혈당강하 효능을 비교하였다. 먼저 간장의 경우 시료를 투여하기 전인 공복혈당(-30 min)과 혈당 상승인자인 glucose를 투여한 직후 혈당(0 min)은 모든 시험군에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 30분 구간부터 각 시험군별로 유의한 차이를 보였다. 30분 이후의 모든 구간에서 대조군(Control)은 숙성기간별 간장을 투여한 시험군과 비교하여 가장 높은 혈당값을 보였는데, 이 중 각 시험군의 혈당 변화가 가장 두드러지게 나타난 30분 구간에서 대조군은 435.6±17.5 mg/dL, 단기 숙성(S)군인 G1 실험군은 407.4±29.9 mg/dL, 중기 숙성(M)군인 G8 실험군은 358.4±7.1 mg/dL, 장기 숙성(L)군인 G12 실험군은 290.6±25.8 mg/dL, 초장기 숙성(E)군인 G20 실험군은 351.4±41.8 mg/dL, 일본 제품인 G21 실험군은 333.4±26.6 mg/dL으로 나타나 장기 숙성군이 가장 낮게 조사되었다. 이러한 결과는 60분-120분 구간까지 비슷한 양상을 보였는데(Fig. 2A), AUC (area under the cuve) 분석에서도 유사하게 나타나 대조군이 34,070.6±1,717.4 mg/dL, 단기 숙성군(G1)이 30,838.2±1,961.8 mg/dL, 중기 숙성군(G8)이 28,115.1±213.3 mg/dL, 장기 숙성군(G12)이 23,756.9±1,421.5 mg/dL, 초장기 숙성군(G20)이 28,148.0±2,614.3 mg/dL, 일본 제품(G21)이 26,047.3±929.4 mg/dL으로 대조군에 비해 장기 숙성군이 30.27%의 혈당 감소를 보여 타 숙성군에 비해 가장 높은 항당뇨 효과를 나타내었다(Fig. 2B).

Fig. 2. Effect of five commercialized Ganjang products on oral glucose tolerance (OGTT) and the respective AUC. The fasting glucose level was used a baseline and the change in glucose level is plotted over time for 2.5 hours of the oral glucose tolerance test. The (A) level of serum glucose and (B) area under curves (AUC) of glucose were calculated. Treatment for the oral glucose tolerance test include 2 g/kg glucose solution either alone (Control), with Ganjang 1 (G1), with Ganjang 8 (G8), with Ganjang 12 (G12), with Ganjang 20 (G20) or with Ganjang 21 (G21). The data are shown as mean±S.E. ^a-dMean values not sharing a common superscript were significantly different among the groups (p<0.05).

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된장의 경우 간장에서와 마찬가지로 -30분 구간과 0분 구간에서는 각 시험군별 유의적인 차이가 없었으나 30분 구간 이후부터 유의적인 차이를 보이기 시작하였는데 특히 30분 구간에서 각 실험군별 혈당 변화는 대조군이 392.1±14.9 mg/dL, 단기 숙성(S)군인 D1 실험군이 323.3±17.1 mg/dL, 중기 숙성(M)군인 D10 실험군이 337.4±14.1 mg/dL, 장기 숙성(L)군인 D12 실험군이 287.3±12.6 mg/dL, 초장기 숙성(E)군인 D18 실험군이 339.4±15.9 mg/dL, 일본 제품인 D19 실험군이 329.1±18.1 mg/dL으로 나타나 장기 숙성군에서 가장 낮은 혈당을 보였다(Fig. 3A). AUC 분석 결과에서도 장기 숙성군인 D12 실험군은 24,400.0±1,106.7 mg/dL로 나타나 타실험군과 비교하여 단기 숙성군(27,469.6±1,248.1 mg/dL)보다는 낮은 경향을, 중기 숙성군(28,681.4±1,254.4 mg/dL)과 초장기 숙성군(28,576.0±1,435.3 mg/dL) 및 일본 된장 제품(28,534.1±1,710.6 mg/dL)보다는 유의하게 낮은 것으로 조사되었는데, 이 중 장기 숙성군의 경우 대조군(29,977.2±669.5 mg/dL)과 비교하여 30.3%의 혈당 감소를 보여 타 숙성군에 비해 가장 항당뇨 효과가 높은 것으로 확인되었다(Fig. 3B).

Fig. 3. Effect of five commercialized Doenjang products on oral glucose tolerance (OGTT) and the respective AUC. The fasting glucose level was used a baseline and the change in glucose level is plotted over time for 2.5 hours of the oral glucose tolerance test. The (A) level of serum glucose and (B) area under curves (AUC) of glucose were calculated. Treatment for the oral glucose tolerance test include 2 g/kg glucose solution either alone (Control), with Doenjang 1 (D1), with Doenjang 10 (D10), with Doenjang 12 (D12), with Doenjang 18 (D20) or with Doenjang 19 (D19). The data are shown as mean±S.E. ^a-cMean values not sharing a common superscript were significantly different among the groups (p<0.05).

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공복혈당, 식후혈당은 혈당조절의 정도를 반영하는 지표로 이용되고 있다. 고혈당증은 대혈관 합병증의 위험과 깊이 연관되어 있으며(40), 이는 당뇨 환자에서 사망률을 증가시키는 원인으로 보고되어 있다(41). 체내에 흡수된 glucose는 말초조직에서 연소되거나, glucose는 베타세포를 자극하여 insulin을 분비하게 함으로서 되먹이기 작용으로 혈당이 조절될 수 있다. 이와 같이 생체가 정상적으로 포도당을 대사할 수 있는 능력을 내당능 (glucose tolerance)이라 하며 고혈당증은 이러한 내당능의 저하에 기인할 수 있다. 그러므로 공시료의 혈당조절 효과를 검증하기 위해서는 개체에 대한 내당능 검사가 필수적으로 이루어져야 한다. 이에 따라 숙성기간별 간장과 된장의 내당능(경구 포도당 부하능)을 분석하기 위하여 각 숙성기간별 α-glucosidase 저해활성이 높았던 실험군을 선별 후 실험을 진행하였다. 그 결과 시료를 투여하지 않은 대조군은 혈당상승인자인 포도당을 투여한 시점인 30분 구간부터 120분 구간까지 가장 높은 혈당값을 보인데 반해 간장과 된장 모두 장기 숙성군인 G12 실험군과 D12 실험군에서 가장 낮은 혈당값을 나타내는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 10-15년 숙성시킨 간장과 된장이 당뇨로 인하여 증가되는 식후 혈당을 정상 수준으로 감소시키는 데 도움이 될 것으로 생각된다.

이상의 결과들을 종합해보면, 간장과 된장은 10년 미만과 15년 이상 숙성시키는 것과 비교하여 10-15년 숙성시킬 경우 α-glucosidase의 억제 활성과 내당능을 증가시킴으로서 식후 혈당을 정상 수준으로 조절하는데 더 효과적으로 작용하는 것으로 확인되었다.