인지 및 기억 개선 기능성 식품으로서 산사의 효과

본 실험에 사용된 국산 산사는 ㈜옥천당(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 국산 산사는 에탄올의 함량, 온도, 시간이 길어질수록 높은 수득율을 나타내었으나 본 연구에서는 대량 생산시 안전성을 위하여 60% 프레타놀을 이용하여 60℃에서 5시간 추출 후 감압 여과하고, rotatory vacuum evaporator(Eyela, Tokyo, Japan)으로 감압 농축하여 농축물의 고형분 함량을 측정한 뒤 덱스트린과 1:1 비율로 분무 건조하여 가루 형태로 만들어 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다(Yield: 10.2%).

Scopolamine과 donepezil는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고 나머지 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.

4주령 수컷 ICR mouse를 대한바이오링크(Eumseong, Korea)로부터 공급받아 1주일 동안 순화 후 실험에 사용하였다. 사육기간 중 식이와 물은 자유 섭취시켰으며 사육실 온도는 23±1℃, 습도 50±5%, 조명시간 07:00-19:00(12시간 주기)로 환경을 유지하였다. 순환 기간을 거친 실험 동물에게 행동 실험 1시간 전 산사 분무 건조물(spray-dried Crataegus pinnatifida extract, SCP) 6.25-50 mg/kg를 단회 경구 투여하고 30분 뒤 scopolamine 1 mg/kg을 복강 투여하여 기억 손상을 유발하였다. 본 연구에서 진행된 동물실험 절차는 대구한의대학교 동물실험윤리위원회의 사전심의와 윤리 규정을 준수하여 수행하였다(승인번호: DHU2017087).

총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis(29)법에 따라 시료 0.1 mL과 증류수 0.9 mL을 혼합액에 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 0.1 mL을 첨가하여 3분간 반응 시킨 후 10% Na₂NO₃ 용액 0.2 mL과 증류수 0.7 mL을 가하여 상온에서 1시간 반응 후 725 nm에서 흡광도(Sunrise, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 측정하였다. 표준물질로써 tannic acid(Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성한 다음 정량하여 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 Moreno 등(30)의 방법에 따라 시료 0.5 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 80% ethanol 4.3 mL을 가하여 상온에서 40분간 반응 후 415 nm에서 흡광도(Sunrise, Tecan)를 측정하였다. 표준물질로써 quercetin(Sigma-Aldrich)을 사용하여 검량선을 작성한 다음 정량하여 계산하였다.

단기 기억력을 측정하는 실험으로 순차적으로 행동하는 능력을 평가하기 위한 방법으로 Y-maze test 실시하였다(31). 측정 장비는 세 개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지의 길이는 42 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고 세 가지가 접히는 각도는 120°이다. 이 장치는 검정색의 polyvinyl plastic으로 구성되어 있고, 세 개의 가지를 각각 A, B, C로 정한 뒤에 실험을 진행하였다. 실험동물을 넣고 8분 동안 각 가지에 실험동물의 꼬리까지 가지에 들어갈 때의 횟수와, 각 가지에 차례로 들어간 경우를 헤아려 1점(실제변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 세 가지 모두에 겹치지 않게 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 수학식에 의해 자발적 변경 행동력(spontaneous alteration)을 계산하였다.

해마의 조건화된 기억과 변연계와 관련 있는 기억에 관한 영향 및 working memory ability를 평가하기 위해 회피학습상자(Jeung Do Bio & Plant Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 실험을 하였다(32). 수동회피 상자는 어두운 방과 밝은 방으로 나누어져 있으며, 밝은 방에 실험동물을 넣으면 어두운 방으로 넘어가는데 그 순간 5초간 0.5 mA의 전기충격을 가한다. 전기충격을 가한 다음 날 실험동물을 밝은 방에 다시 넣었을 때 어두운 방에서의 전기충격을 기억하여 밝은 방에 머무르게 되는데, 이때 체류하는 시간(step-through latency)을 측정하여 기억력을 평가하였다.

해마 의존적 공간학습 및 장기 기억력 개선에 대한 실험으로(33) 원형으로 된 지름 90 cm, 높이 45 cm의 수조의 사분면 한 구역에 지름 9 cm, 높이 25 cm의 도피대를 설치하고 20±2℃ 깨끗한 물을 도피대 보다 1 cm 정도 위로 채운 뒤 실험 동물이 도피대를 찾아가는데 걸리는 시간을 측정하였다. 원형 수조에서 4개의 표지판을 설치하여 4분면으로 나누어 입수하는 위치를 다르게 하여 하루 4번씩 반복하여 60초간 진행하였으며 실험 동물이 60초 안에 도피대를 찾으면 실험을 완료하였고 찾지 못한 경우 손으로 위치를 안내해주어 10초간 머무르게 하였다. 실험 마지막 날 도피대를 제거하고 학습능력을 측정하기 위해 60초간 도피대가 있었던 구역에 머무르는 시간을 측정하였고 모든 실험은 Ethovision program(Noldus, Netherlands)을 이용하여 기록 및 측정하였다.

AChE 활성 억제능은 Ellman 등(34)의 방법인 acetylthiocholine iodide(ASCh, Sigma-Aldrich)를 기질로 사용한 비색분석법으로 실험하였다. 실험에 사용하지 않은 실험 동물을 경추 탈골 후 전체 뇌를 적출하여 차가운 sodium phosphate buffer(100 mM, pH 8.0)를 이용하여 균질화하고, 12,500 rpm, 20분간 원심분리 후 얻은 상층액으로 AChE 활성을 측정하는 효소로 사용하였다. SCP와 양성 대조군으로 사용한 donepezil(Sigma-Aldrich)을 단계별 희석하여 사용하였다. Sodium phosphate buffer 134 μL, 75 mM ASCh 1 μL, 10 mM Ellman’s 용액(5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid) 5 μL, SCP 또는 donepezil을 50 μL 넣고 25℃에서 10분간 반응 후 효소원 10 μL를 넣고 25℃에서 5분간 반응 후 405 nm에서 흡광도(Sunrise, Tecan)를 측정하였다. 대조군으로는 효소를 첨가하지 않고 sodium phosphate buffer를 첨가한 반응액을 사용하였고, ASCh를 첨가하지 않은 반응액으로 시료와 효소 활성용 시약간의 비특이적 반응이 일어나지 않았음을 확인하였다. 시료를 첨가하지 않은 반응액을 AChE의 활성도를 100%로 하였을 때 각 시료를 첨가한 반응액의 AChE 활성 저해도를 그래프로 나타내었다.

본 연구의 모든 실험 결과는 Prism 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 산출하였다. 그룹 간 유의성 검정은 일원배치분산분석(one-way analysis of variance)를 실시하고 Newman-Keuls test에 의해 유의수준 p<0.05 이상에서 사후검정을 실시하였다. 모든 결과는 mean±standard error of mean(SEM)으로 표시하였다.

식품공전에 따라 열량은 검체 100 g중의 조단백질, 조지방 및 탄수화물 또는 당질의 함량에 단백질 4, 지방 9, 당질 4의 계수를 곱하여 각각의 에너지를 칼로리(kcal)단위로 산출하고 그 총계로 나타내고, 탄수화물은 시료 전체를 100%로 하여 에테르추출법으로 측정한 조지방, 세미마이크로 킬달법으로 측정한 조단백질, 직접회화법으로 측정한 조회분, 상압가열건조법으로 측정한 수분을 제하여 나타내었다. 산사 추출물의 영양성분은 Table 1에 나타내었다. Park 등(27)의 연구와 유사하게 산사 100 g의 열량은 380.70 kcal이고, 식물체의 구성성분인 탄수화물과 과실류에 따른 당의 비율이 높았다. 또한 검출되지 않은 콜레스테롤을 비롯하여 지질 함량도 미비하여 건강 기능 식품으로 개발 가능할 것으로 판단된다.

페놀성 화합물은 방향성 화합물로 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사 산물로 고리구조상 hydroxyl기로부터 전자를 공여하여 페놀 고리 구조 공명에 의해 구조적 안정화가 되면서 항산화, 항염증, 항암 등 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다(35).

산사 추출물의 총 폴리페놀 함량을 정량한 결과를 Table 2에 나타내었다. 산사 추출물의 총 폴리페놀 함량은 9.8±0.3 mg TAE/g으로 나타났다. Nam 등(36)이 에탄올 농도별 추 출 조건에서 50% 에탄올 또는 70% 에탄올로 추출하였을 때 약 40 mg GAE/g으로 가장 높은 총 페놀 함량을 나타내었는데 본 연구의 총 폴리페놀과 차이가 나는 것은 실험에 사용한 표준물질의 차이 및 산사의 추출 조건, 건조 방법, 채취 시기, 재배 지역 등에 따른 차이에 의한 것으로 생각된다.

플라보노이드는 C6-C3-C6를 기본 골격으로 하는 담황색 또는 노란색 계통의 페놀성 화합물의 총칭으로 직접 항산화 효소 활성을 증가시키거나 free radical을 소거시켜 항산화, 항염증, 항암 등 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있다(37).

산사 추출물의 총 플라보노이드 함량을 정량한 결과를 Table 2에 나타내었다. 산사 추출물의 총 플라보노이드 함량은 18.94±0.4 mg QE/g으로 나타났다. Duan 등(38)이 보고한 70% 에탄올 추출물에서 1.12±0.08 mg QE/g와 본 연구의 총 플라보노이드 함량이 차이가 나는 것은 산사의 추출 조건, 건조 방법, 채취 시기, 재배 지역 등에 따른 차이에 의한 것으로 생각된다.

비선택적 무스카린성 아세틸콜린 수용체인 scopolamine는 실험 동물을 이용하여 AD 연구에 가장 많이 사용하는 약물로 blood-brain barrier를 통과하여 초기 AD 증상과 유사한 증상을 유발한다(39). Scopolamine을 투여한 기억력 감퇴 마우스를 이용하여 산사 추출물의 공간 학습 및 단기 기억 개선 효과를 확인하기 위하여 Y 미로 시험을 실시한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 정상인 NOR군의 자발적 변경행동력은 68.5±1.7%, scopolamine의 투여로 인한 기억력이 손상된 CON군은 51.3±3.0%로 NOR군과 비교하여 74.9% 수준으로 감소하여 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다(p<0.001), 이는 단기 기억이 손상된 것으로 판단되어 scopolamine으로 인한 기억 손상 모델이 잘 작성된 것을 의미한다. 추출물의 대량 생산을 가정하여 분무 건조한 산사 추출물 6.25, 12.5, 25 및 50 mg/kg을 투여한 SCP6.25군, SCP12.5군, SCP25군, SCP50군에서 자발적 변경행동력이 각각 51.8±1.4%, 56.1±1.0%, 61.4±1.0%, 57.3±1.7%로 나타났고 이는 NOR군의 75.5%, 81.8%, 89.7%, 83.7% 수준으로 회복하는 것을 나타내었다. 이는 각 가지에 들어간 총 입장 횟수에서 각 실험군당 유의한 차이가 없었음으로 약물에 의한 행동 변화 없는 산사 추출물에 의한 기억 개선 효과를 나타내었다. 또한 산사 추출물의 용량 효과 관계는 고농도에서 기억력 개선 효과가 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 산사 추출물이 인지 및 기억 개선 효과에서 전형적인 용량 의존적인 직선 관계가 아닌 엎어진 U형의 용량 의존 관계를 나타냈는데 이는 AChE 억제제에서 독특하게 관찰되는 현상으로 적절한 농도의 아세틸콜린은 기억을 강화시키지만 고농도에서는 콜린성을 차단하여 기억을 손상시켜 일어나는 것으로 알려져 있다(40).

Fig. 1. Comparison of effects between Crataegus pinnatifida on the short-term, spatial reference memory of scopolamine-treated mice in Y-maze test. A, spontaneous alteration; B, total entry. Mice were administered SCP (6.25, 12.5, 25, or 50 mg/kg) orally and intraperitoneally injected with scopolamine (1 mg/kg) after 30 min. Data are expressed as mean±SEM, n=9 in each group. ***p<0.001 compared with NOR group, ##p<0.01 compared with the CON group.

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Scopolamine을 투여한 기억력 감퇴 마우스를 이용하여 산사 추출물의 공포 자극에 대한 학습 능력 및 장기 기억 개선 효과를 확인하기 위하여 수동 회피 시험을 실시한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 학습을 진행한 날에는 모든 실험군의 머무름 시간이 유의적인 차이가 없었으나 기억을 검사한 날에는 정상인 NOR군이 291.6±5.7초, scopolamine의 투여로 인한 기억력이 손상된 CON군은 46.0±7.8초로 NOR군과 비교하여 15.8% 수준으로 감소하여 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다(p<0.001), 이는 scopolamine으로 인한 기억 손상 모델이 잘 작성된 것을 의미한다. 수동 회피 시험에서는 Y-미로 시험에서 가장 효과가 미비하였던 산사 추출물 6.25 mg/kg를 제외하고 실험을 진행하였다. 산사 추출물 12.5, 25 및 50 mg/kg을 투여한 SCP12.5군, SCP25군, SCP50군이 각각 165.9±3.2초, 253.4±3.2초, 183.6±5.1초로 나타나 NOR군의 56.9%, 산사 추출물 고농도에서 기억력 개선 효과가 감소하여 25 86.9%, 63.0% 수준으로 회복하는 것을 확인하였다. 이로서 mg/kg를 투여한 SCP25군에서 가장 좋은 기억 개선 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 2. Comparison of effects between Crataegus pinnatifida on the ability of learning and long-term memory of scopolamine-treated mice in passive avoidance test. Mice were administered SCP (12.5, 25, or 50 mg/kg) orally and intraperitoneally injected with scopolamine (1 mg/kg) after 30 min. Data are expressed as mean±SEM, n=7 in each group. *** p<0.001 compared with NOR group, ### p<0.001 compared with the CON group.

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Scopolamine을 투여한 기억력 감퇴 마우스를 이용하여 산사 추출물의 공간 학습 및 장기 기억 개선 효과를 확인하기 위하여 모리스 수중 미로 시험을 실시한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 모든 실험군이 학습을 진행할수록 도피대를 찾아가는데 걸리는 시간이 감소하였으나 scopolamine을 투여한 CON군에서는 다른 군과 비교하여 감소되는 시간이 첫날과 비슷한 수준이었고, 정상인 NOR군과 비교하여 유의하게 많은 시간이 걸렸다(p<0.001). 이는 scopolamine 투여로 인하여 도피대를 기억하지 못하는 것으로 판단되어 장기 기억 손상 모델이 잘 작성된 것을 의미한다. 산사 추출물을 투여한 모든 실험군에서 학습 셋째 날부터 CON군과 비교하여 유의하게 도피대를 찾아가는데 걸리는 시간이 감소하였으며 실험 마지막 날 진행한 probe test에서 NOR군은 22.5±3.2로 나타났고 CON군은 NOR군의 62.8% 수준인 14.1±1.0초로 감소하여 공간 지각력 역시 손상 받은 것을 확인 할 수 있었고, SCP12.5군, SCP25군, SCP50군이 NOR군의 87.0%, 95.2%, 88.4% 수준인 19.5±0.8초, 21.4±1.1초, 19.8±1.5초로 손상된 기억이 개선되었고 특히 산사 추출물 25 mg/kg를 투여한 군에서 유의한 기억력 개선에 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05).

Fig. 3. Effects of Crataegus pinnatifida on the long-term, spatial reference memory of scopolamine-treated mice in Morris water maze test. A, escape latency in acquisition phase; B, swimming time in target quadrant in probe trial. Mice were administered SCP (12.5, 25, or 50 mg/kg) orally and intraperitoneally injected with scopolamine (1 mg/kg) after 30 min. Data are expressed as mean±SEM, n=10 in each group. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 compared with NOR group, ##p<0.01, ### p<0.001 compared with the CON group.

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기억과 관련하여 cholinergic 신경계(41), glutamatergic 신경계(42), GABAergic 신경계(43), serotonergic 신경계(44), adrenergic 신경계(45) 등이 알려져 있으나 특히 cholinergic 신경계와 밀접하게 연관되어 있다. AD에서는 뉴런과 신경 접합부의 acetylcholine(ACh)의 수치가 중요한데 특징적으로 cholinergic neuron의 소실이 나타나며 신경 전달 물질인 ACh이 부족해지며 인지 및 기억 손상이 야기된다. 따라서 임상에서는 ACh의 분해하는 AChE를 억제함으로 감소된 ACh의 농도를 증가시킴으로써 AD의 증상을 치료하고 AD의 진행을 늦추고 있다(46).

균질화한 뇌의 상층액을 효소로 하여 분무 건조한 산사인 SCP의 AChE의 저해능을 확인한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. SCP의 IC₅₀값이 12.76 μg/mL로 나타났으며 양성 대조군으로 사용한 AChE 억제제인 donepezil의 IC₅₀ 값이 0.02345 μg/mL로 나타났다. 이는 분무 건조 시 들어간 덱스트린에 의하여 IC₅₀ 값이 높게 나타났을 것이라 판단되나 산사 추출물이 AChE의 활동을 억제를 통하여 기억력을 개선시키는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 4. Effects of Crataegus pinnatifida on the AChE activity.

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