팽화미분 이용 이소말토올리고당 제조 및 이화학적 품질특성

본 실험에 사용한 팽화미는 남원지역에서 재배한 신동진 품종으로 제조한 튀밥제품을 이용하였으며, 이를 가정용분쇄기(HR2095, PHILIPS, Amsterdam, Netherlands)로 분말화하여 50 mesh 표준체에 고르게 내렸다. 준비된 팽화미분 시료는 PE 비닐백에 밀봉하여 냉동고(WSM-1242RF, Woosung INC, Namyangju, Korea)에 보관하며 이소말토올리고당 제조에 사용하였다.

팽화미분을 이용한 이소말토올리고당의 제조에 필요한 기질로 사용하였으며, 반응을 촉매하는 효소는 시중에 판매하는 상업용 효소인 maltogenase L(Novozyme, Copenhagen, Deanmark), Promozyme D2(Novozyme), Transglucosidase(L Amano, Kanagawa, Japan)를 각각 기질의 0.5%(v/w) 사용하였다. 이때, 제조조건별 생성물의 차이를 확인하기 위하여 기질과 물 혼합액(slurry)의 알파미분 함량(15%와 20%, w/v)과 효소반응에 필요한 온도(60℃, 65℃) 조건을 각각 달리하여 4가지 실험군을 설정하였다(PR15-60, PR20-60, PR15-65, PR20-65). 이후, 시간별로 이소말토올리고당 생성 정도를 확인하기 위하여 설정한 온도를 유지시켜주며 0, 6, 24, 48시간동안 반응시켜 채취한 시료를 통해 이화학적 품질특성을 분석하였다.

환원당 함량은 DNS 법(21)으로 측정하였다. 즉, 시료액을 500배 희석하여 0.5 mL 취한 뒤, DNS 시약을 0.5 mL 첨가하여 항온수조에서 15분간 끓여 반응시킨 후 얼음물로 10분간 급속 냉각하였다. 반응이 끝난 시료의 흡광도를 MicroPlate reader(Tecan, Infinite M200, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 550 nm에서 측정하였으며, 표준물질로 사용된 포도당의 검량곡선을 작성하기 위해 0.5, 0.25, 0.125 mg/mL로 희석하여 회귀방정식을 구한 뒤 값을 계산하였다. DE(포도당 당량) 측정은 식품공전 시험법(26)에 따라 이소말토올리고당 제조액을 105℃ oven에 넣어 항량이 될 때까지 건조시킨 후 고형분 함량을 구하여 아래의 식을 통해 나타내었다.

팽화미를 이용하여 제조한 이소말토올리고당액의 가용성고형분 함량은 반응시간별 시료를 일정량 취해 휴대용 굴절당도계(Hand refractometer, PAL-1, Atago, Minato-ku, Japan)를 이용하여 °Brix로 표시하였고, 모든 분석은 3회 반복으로 측정한 수치를 평균값으로 나타내었다.

시간에 따른 시험용액의 변화를 확인하기 위해 Thin Layer Chromatography(TLC)분석을 실행하였다. 제조조건별 효소처리 반응물을 0.2 μm syringe filter(PVDF Filter, Wahtman, Buckinghamshire, England)를 이용하여 통과시킨 후 TLC Plate(HPTLC silica gel 60 F254)에 점적하여 전개용매(Nitromethane:1-prophanol:H₂O=2:5:1.5)가 담긴 TLC Chamber(125×145 mm)에서 2차 전개하였다. 발색시약으로는 10% sulfuric acid 용액으로 반응시켜 105℃ oven에 20분간 가열 건조하였으며, 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 이용하였다.

정량 분석에 사용된 18종의 표준물질 중 fructose, glucose, sucrose, nigerose, maltose, kojibiose, isomaltose, maltotriose, panose, isomaltotriose, maltoheptaose는 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA), maltotetraose, isomaltotetraose, maltopentaose, isomaltopentaose, maltohexaose는 TRC사(Toronto, Canada)에서 isomaltohexaose, isomaltoheptaose는 Omicron사(Amherst, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 표준물질로 사용된 시약은 분석용 등급이상을 사용하였으며, 각각의 18종 표준물질 20 mg을 바이알에 정밀히 달아 1 mL의 증류수에 용해시켜 stock standard solution이 20,000 μg/mL가 되게 하였다. 표준용액은 시험용액의 농도를 고려하여 500, 1,000, 2,000 μg/mL가 되도록 희석하여 검량선을 작성한 후 정량 분석하였다. 이소말토올리고당 함량 비교 분석을 위해 대조구로 사용되어진 시판 올리고당은 유통업체에서 상온상태에서 판매중인 제품을 구입하여 사용하였다. 검체는 팽화미분으로 제조한 이소말토올리고당액을 냉장플로어원심분리기(Himac CR21GⅡ, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 원심분리(11,180 ×g, 20분) 한 뒤, 상등액을 취하여 여과, 정제 후 분석에 사용하였다. 정제 과정은 이온교환수지(Amberlite IR-120, Amberlite IRA-67, Sigma Aldrich)를 유리관 컬럼에 충진 후 통과하여 반응액의 전기전도도(Almemo 2890-9, Ahlborn, Holzkirchen, Germany) 값의 감소를 통해 간섭물질의 제거를 확인하였으며, 정제과정을 거쳐 0.2 μm syringe filter(PVDF Filter, Wahtman, Buckinghamshire, England)로 반복 여과 후 1 mL씩 정밀히 취하여 시험용액을 조제하였다.

정량 분석 조건을 설정하기 위하여 HPLC system(Agilent Technologies 1260 infinity, Palo Alto, CA, USA)과 ELSD(Palo Alto, CA, USA)를 사용한 분석조건을 Table 1에 나타내었다.

모든 실험의 통계처리는 12.0 K SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package 프로그램을 사용하였으며 측정값은 기술통계분석으로 평균값과 표준편차를 산출하였다. 시료간의 유의성 검정은 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, Duncan’s multiple range test를 실시하여 p<0.05 수준에서 확인하였다.

환원당은 glucose, maltose 등의 당류를 총칭하며 반응성이 있는 알데히드기나 케톤기를 갖고 금속염 알칼리 용액을 환원시키는 성질을 갖는 당을 말한다(22). 반응 0시간째 실험군별 환원당의 함량은 5.76-7.77%로 기질 혼합물의 농도 및 반응온도에 따라 모두 유의적인 차이를 보였고(p<0.05), 기질 혼합물의 농도가 15%인 PR15-60, PR15-65 실험군의 환원당 함량이 PR20-60, PR20-65 실험군의 환원당 함량보다 낮은 경향을 보였다. 이는 PR15-60, PR15-65 실험군보다 PR20-60, PR20-65 실험군에 포함된 기질의 양이 많고 필요한 효소의 양이 충분한 결과로 보이며, Lee와 Yi(19)의 연구에서도 알파화된 팽화미분의 첨가량이 증가할수록 환원당이 높았다는 결과와 일치한다. 반응시간이 경과함에 따라 환원당 함량은, 반응 1시간째 7.40-10.62%, 6시간째 11.05-15.64%, 24시간째 13.89-21.21%로 48시간까지 지속적으로 증가하였으나 PR15-60, PR20-60 실험군에서는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(Fig. 1).

Fig. 1. Reducing sugar of isomaltooligosaccharides manufactured by One-step method with puffed rice flour. ^{A-D, a-d}Different letters within the same bar are significantly different from each other (A-D, between experimental group; a-e, between different reaction time) by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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DE는 전분을 기질로 하여 당화 처리를 하였을 때 당의 분해된 정도를 나타내며 당화 반응시간이 경과함에 환원당량과 함께 증가한다(23). 팽화미분을 이용하여 One-step 제조방법으로 제조한 이소말토올리고당의 DE 값은 제조 조건별로 0시간째 36.56-41.63%으로, 기질 혼합물의 농도 및 반응온도별 모두 유의적인 차이를 보였다(p<0.05)(Fig. 2). 이후, 반응시간이 경과함에 따라 환원당 함량은, 반응 1시간째 49.44-58.33%, 6시간째 71.55-77.39%, 24시간째 83.28-97.00%로 지속적으로 증가하였으나 48시간째 84.24-93.53%로 대체적으로 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 반응이 장시간 지속되면서 환원성 말단을 가진 포도당, 맥아당 등 이 전이효소 작용 시 transglucosidse의 수용체 혹은 공여체로 참여하여 총량대비 소폭 감소하는 경향을 나타낸 것으로 보인다.

Fig. 2. Dextrose equivalent (DE) of isomaltooligosaccharides manufactured by One-step method with puffed rice flour. ^{A-D, a-d}Different letters within the same bar are significantly different from each other (A-D, between experimental group; a-e, between different reaction time) by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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팽화미분을 이용하여 One-step 제조방법으로 제조한 이소말토올리고당의 반응 0시간째 실험군 별 당도는 12.33-15.80 °Brix로 기질과 물의 배합비에 따라 유의적인 차이를 보였고, 기질 함량 같은 비율에서 반응온도가 다른 실험군간 유의적 차이가 없었으며 기질의 함량이 높은 PR20-60, PR20-65의 당도가 더 높았다(Fig. 3). 반응 초기 기질 혼합물의 농도가 같은 실험군의 유의적 차이가 없었으나 반응 6시간째 PR20-60, PR20-65 실험군을 제외하면 반응 1시간부터는 모든 실험군별 당도의 유의적인 차이를 보였다. 반응시간이 증가함에 따라 대체로 모든 실험군의 당도가 증가하는 경향을 보였으며 반응 48시간째 당도는 14.33-19.70 °Brix로 PR20-65 실험군이 가장 높았고, 다음으로 PR20-60, PR15-65, PR15-60 순으로 나타났다. PR20-60, PR20-65 실험군이 유의적으로 높은 당도를 보이는 것은(p<0.05) 기질인 팽화미분에 효소가 작용하여 가수분해된 결과 당도가 증가한 것(25)과 같은 맥락으로 기질혼합물의 농도가 20%인 PR20-60, PR20-65 실험군의 기질 함량이 더 높으며, 이 때 필요한 효소의 농도가 충분하기 때문인 것으로 보인다.

Fig. 3. Total soluble solids of isomaltooligosaccharides manufactured by One-step method with puffed rice flour. ^{A-D, a-d}Different letters within the same bar are significantly different from each other (A-D, between experimental group; a-e, between different reaction time) by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

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팽화미분을 이용하여 One-step 제조방법으로 제조한 이소말토올리고당의 구성당 및 올리고당 생성여부를 확인하기 위해 TLC로 분리하였으며, 기질 혼합물의 농도 및 반응온도, 반응시간(0, 1, 6, 12, 24, 48시간)에 따른 포도당, 맥아당 및 그 이상 중합도를 가진 당의 생성여부를 확인하였다. Fig. 4와 같이 각 실험군 사진의 제일 왼쪽열에 0.1% 농도의 표준용액을 통해 표시된 포도당, 과당, 자당, 맥아당의 위치를 확인했고, 0시간부터 48시간까지 반응액을 표시된 순서와 같이 점적하여 생성된 당이 분리된 결과, 반응시간별 포도당 위치의 점의 크기가 크고 진해지는 것을 통해 반응시간이 경과함에 따라 포도당이 많이 생성된 것을 확인하였다. 모든 실험군이 반응 6시간째부터 표준물질의 분자량보다 중합도가 큰 생성물이 진하게 표시되어 나타나는 것을 확인하였고, 기질의 함량이 높은 PR20-60, PR20-65 실험군이 PR15-60, PR15-65 실험군 보다 상대적으로 더 진하게 나타났다. 반응온도별로는 반응온도가 높은 PR15-65, PR20-65 실험군에서 더 spot이 진하게 확인되는 것으로 보아 포도당 및 올리고당의 함량이 더 높은 것으로 판단되며, 이는 앞서 제시한 환원당, DE 및 가용성고형분 분석 결과와 일치하는 경향을 띄었다.

Fig. 4. TLC analysis in experiment groups of enzyme-substrates reaction product.

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팽화미분을 이용하여 One-step 제조법으로 제조 시 제조조건별 생성물의 구성당 및 함량의 정량·정성 분석 결과 동일 반응시간 샘플에서 PR20-65 실험군의 구성당 및 이소말토올리고당 함량이 최대로 확인되었으며(data not shown), 이러한 PR20-65 실험군의 반응시간별 생성물의 변화를 관찰하기 위해 반응 0시간부터 1, 6, 24, 48시간 동안 반응물의 분석결과를 Table 2에 나타내었다. 확인된 이소말토올리고당은 nigerose, isomaltose, panose, isomaltotriose, isomaltotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose로, 이 외에도 glucose, maltose, imaltotriose, maltotetraose, maltopentaose가 함께 검출되었다. PR20-65 실험군에 포함된 총 당류의 함량은 반응시간이 경과함에 따라 0, 1, 6 시간째, 각각 202.63 mg/mL, 207.87 mg/mL, 219 mg/mL 로 증가하였으나, 이 후 24시간, 48시간째에는 각각 170.36 mg/mL, 122.22 mg/mL 으로 감소하였다. 총당 중 이소말토올리고당의 함량 및 비율은 0시간(24.54 mg/mL, 14.12%), 1시간(56.40 mg/mL, 34.31%), 6시간(135.00 mg/mL, 66.11%), 24시간(115.48 mg/mL, 68.04%), 48시간(76.07 mg/mL, 63.28%)으로 총이소말토올리고당 함량은 반응 6시간째에 최대치를 보였고, 총당 대비 이소말토올리고당 함량비율은 반응 24시간째 최대 함량비를 차지하는 것으로 확인되었다. 반응 6시간의 경우 isomaltose가 약 66.40 mg/mL로 가장 높은 수준으로 검출되었고 isomaltotriose (23.15 mg/mL), panose(21.10 mg/mL), isomaltotetraose (11.45 mg/mL) 순으로 검출되었으며, isomaltopentaose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose는 미량 검출되었다. 이는 기존 연구결과와 같이 이소말토올리고당을 함유한 올리고당에 isomaltose와 panose가 가장 많이 함유하고 있다는 결과(24,25)와 일치하였으며 반응 1시간째부터 포도당이 분지결합으로 4개 결합된 isomaltotetraose가, 반응 6시간째부터 5개 이상 결합된 isomaltopentaose, isomaltohexaose 등이 검출되었다.

알파미분을 이용하여 One-step 방법으로 제조한 이소말토올리고당이 기존 방식으로 제조되는 이소말토올리고당 제품과의 품질 차이를 비교하기 위하여 시중에서 유통중인 Two-step 방법으로 제조한 이소말토올리고당(대한민국 공개특허 제 10-2012-0045298호) 제품을 대조군으로 하여 각 각의 이소말토올리고당 구성당 및 함량분석을 실시하였으며 이를 Table 3에 나타내었다. One-step 방법으로 제조한 이소말토올리고당의 경우 glucose가 19.6%이었으며 maltose 및 중합도 3 이상의 올리고당이 미량 검출 되었고 그 외 중합도 2 이상의 가지결합(α-1,6) 형태의 이소말토올리고당 함량이 약 70% 이상으로 검출되었다. Two-step 방식으로 제조한 시판 이소말토올리고당 제품의 경우 glucose가 26.3%이었으며 maltose는 8.7%, 중합도 3 이상의 올리고당이 13.8%, 그리고 중합도 2 이상의 가지결합(α-1,6) 형태의 이소말토올리고당 함량이 51%로 나타났다. 비록 대조구로 선택한 시판 올리고당의 제조에 사용한 효소조합과 반응조건이 상이한 까닭에 절대적인 품질비교는 어려우나 One-step 방식으로 제조한 이소말토올리고당의 포도당 함량이 낮을 뿐만아니라, 이소말토올리고당이 약 20% 더 포함된 것을 확인 할 수 있었다.