국내 생막걸리에서 분리한 야생 효모의 특성

본 실험에 사용한 효모는 전국에서 수집한 34종의 생막 걸리에서 분리된 야생 효모 61균주와 누룩에서 분리된 야 생 효모 1균주를 사용하였다. 비교 균주로 시판 효모인 Fermivin(Saccharomyces cerevisiae, Oenobrands SAS, France), 송천효모(SCY, S. cerevisiae, Songcheon Yeast, Cheongyang, Korea), 충무효모(CM, S. cerevisiae, Chungmu Fermentation Ltd., Ulju, Korea)를 사용하였다. 누룩 10 g을 0.85% NaCl 90 mL 용액에 현탁한 후 YPD 한천 배지에 100 μL 도말하여 30℃에서 24-48시간 배양 하였고, 막걸리 도 YPD 한천 배지에 100 μL씩 분주하여 같은 방법으로 배양하였다. 그리고 YPD 한천 배지에 계대 배양 하여 순수 분리된 효모를 YPD 액체배지에 배양 후 글리세롤 20% 함유하도록 첨가해 -80℃에 보관하여 stock으로 실험에 사 용하였다. 실험에 사용된 배양 배지는 YPD 고체 및 액체배 지(YPD, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였고, 실험 에 따라 YPD 한천배지에 배양 후 4℃ 보관하여 실험에 사용하였다.

분리 효모의 동정은 26S rDNA 유전자의 D1/D2 부위 염기서열을 분석하였다. 프라이머는 NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG- 3') 및 NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3')을 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension cycle을 35회 수행 하였다. PCR 산물의 염기서열은 ㈜ZENOTECH사에 의뢰 하였다. National Center for Biotechnology Information (NCBI, RP, Bethesda, MD, USA)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 프로그램을 사용하여 기존에 보고된 균주의 염기서열과 상동성을 비교하였다. 계통학적 분석을 위한 multiple sequence alignment는 Lasergene pro software(Seqman Pro, Ver 8.1.5, DNASTAR inc., Madison, WI, USA)를 사용하였 고, multiple alignment의 정보량을 가장 손쉬운 형태로 축소 시켜 데이터를 취급하기 쉬운 장점이 있는 neighborjoining( NJ) method에 의한 계통수 작성 및 분석에는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA6.0) 프로 그램을 이용하였다(17,18).

황화수소 생성능을 알아보기 위해 -80℃에 보관하여 stock한 균주를 사용하였다. 96-well cell culture plat(SPL Co., Ltd., Pocheon, Korea)에 180 μL씩 YPD 액체배지를 분주한 후 stock 균주를 20 μL씩 일정하게 접종하였다. 이를 Biggy 한천배지(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 96 pin replicator(250520, Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA)를 이용하여 Biggy agar에 접종한 후, 25℃에서 48시간 배양하여 colony의 색깔 진하기에 따라 황화수소 생성능을 평가하였다(19).

분리된 야생 효모 stock 균주를 YPD 액체배지 5 mL에 20 μL씩 접종한 후 25℃에서 72시간 동안 배양하였다. 0시 간부터 72시간까지 12시간마다 배양액이 감소한 무게를 g 단위로 측정하였다. 72시간까지 감소하는 총 무게를 효모 의 CO₂생성량으로 판단하였고, CO₂ g/72 h로 표시하였다.

10 mL YPD 액체배지에 분리된 야생효모 stock 균주를 각각 10 μL씩 접종하여 25℃에서 48시간동안 정치 배양하 였다. YPD 액체배지를 제조하여 고압멸균(121℃, 15min)한 후, 배지 온도가 40-50℃ 되었을 때 무수 에탄올 농도를 0%, 5%, 10%, 15%, 20% (v/v)가 되도록 각각 첨가하여 배양된 야생 효모를 접종하였다. 25℃에서 48시간 동안 정 치 배양하였으며, 분광광도계(SYNERGY MX, Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측 정하였다(20).

분리된 야생 효모들의 응집성 실험은 Helm’s assay method에 따라 수행하였다(21). 배양된 효모 균주 5-6 g을 30 mL calcium sulfate에 현탁하여 원심분리 후 효모를 회수 하였다. 회수한 효모 1 g(약 1×10⁷-10⁸ cells/mL)을 15 mL centrifuge tube에 넣고 10 mL buffered calcium sulfate 용액 을 첨가하여 현탁 시킨 후 20℃의 water bath(VS-1321-80, VISION, Gyeonggi-do, Korea)에서 20분간 정치하고, 재현 탁하여 10분 간격으로 60분까지 침전된 균체의 부피를 측 정하였다. 균체의 부피가 1.0 mL 이상인 효모는 high flocculation type이며, 0.5 mL 이하인 것을 low flocculation type이라 하였다.

Cerulenin과 5,5,5-trifluor-DL-leucine(TFL)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 대한 저항성은 0.67% YNB(yeast nitrogen base), 2% glucose, 2% agar 조성 배지에 celurenin (25 μM)과 TFL(1 mM)을 각각 첨가하여 제조하였다. 96 well cell culture plat에 180 μL씩 YPD 액체배지를 분주한 후 stock으로 보관한 분리 균주를 20 μL씩 일정하게 접종하 여 30℃에서 48시간 배양 한 다음 colony 생성 여부에 따라 평가하였다(22). 효모가 생성하는 효소 분석은 API ZYM kit(REF 25 200, BioMerieux SA, Chemin de l'Orme, France) 를 이용하여 효소 활성을 측정하였다. YPD 한천배지에 3 0℃에서 48시간 배양한 균주들의 colony를 API ZYM kit의 suspension standard 5 탁도에 맞춰 균을 suspension medium 에 풀었다. 이를 cupule에 100 μL씩 분주한 후 30℃에서 4시간 동안 정치하였다. 4시간 후 ZYM A와 ZYM B를 한 방울씩 차례로 분주 후 효소가 발색하는 색의 유무를 측정 하였다.

효모의 알코올 내성과 CO₂ 생성의 상관성 및 특성의 상 관관계를 시각적으로 요약하기 위하여 주성분분석 (Principal Component Analysis, PCA)을 나타내었다. 주성분 분석은 XLSTAT(Paris, France)을 이용하여 분석하였다.

국내 생막걸리 및 누룩에서 분리한 효모들의 계통수는 Fig. 1과 같다. 이미 보고된 같은 속 균과 26S rDNA의 D1/D2 부위의 유전자 염기서열을 비교하였을 때 S. cerevisiae임을 확인 할 수 있었으며, 누룩에서 분리된 균은 P. kudriavzevii 로 확인 되었다. 생막걸리에는 최소 5% 이상의 알코올 함유 로 알코올 내성이 약한 효모들은 사멸되어 상대적으로 내성 을 가진 S. cerevisiae가 분리되었다. 하지만 누룩은 생막걸 리와 다른 환경으로 인해 S. cerevisiae 효모가 아닌 P. kudriavzevii가 분리된 것으로 보인다. P. kudriavzevii와 같은 non-Saccharomyces 효모들은 누룩이나 메주 등 발효식품에 주로 분리되는 균으로 보고되었다(8,14).

Fig. 1. Phylogenetic tree of yeast strains isolated from non-sterilized Makgeolli and Nuruk collected in Korea based on the nucleotide sequences of 26S ribosomal DNA. The tree was generated by the neighbor-joining method using the Mega 6.0 program. The numbers above or below branches mean the bootstrap supporting values.

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Biggy agar에 62종의 분리 효모와 3종류의 대조구를 접종 하여 25℃에서 48시간 동안 배양한 결과를 Table 1에 나타 내었다. 배양 후 효모 주위에 진한 갈색의 집락이 형성되면 황화수소 생성능이 있는 양성(+)으로 판단하였고, 집락 크 기에 따라(+, ++, +++)로 나눠 확인하였다. 효모 주위에 진한 갈색의 집락이 없이 배양되면 음성(-)으로 하였다. 발 효 시 효모는 단백질 합성을 위하여 필수적으로 황함유 화합물을 필요로 하며, 이 대사 과정의 부산물로 황화수소 가 만들어진다. 황화수소는 썩은 달걀 냄새를 내는 독성의 기체로 황화수소 생성능이 있는 효모는 알코올 발효의 부산 물로 생성되는 불쾌한 향을 생성함으로 인해 발효주의 품질 을 떨어뜨릴 수 있으나 사람이 느낄 수 있는 역치 값 미만으 로 생성하게 되면 발효주의 향기에 영향을 미치지 않을 수 있다(23). 대조구 중 하나인 CM과 62종의 분리 효모 중 31종의 효모가 황화수소 생성능이 있었고, 34개의 효모 는 황화수소를 생성하지 않았다. 분리원이 같고 같은 속의 효모라도 황화수소 생성능이 각각 다른 것으로 나타났다. 이 중 YM54와 YM57은 황화수소 생성능이 가장 높게 나타 났으며, 황화수소 생성능이 낮은 양성(+)인 효모는 14개로 확인되었다.

생막걸리에서 분리된 야생 효모의 CO₂ 생성과 알코올 내성은 Table 1에 나타내었다. 대부분 효모들은 12-24시간 사이 높은 CO₂ 생성능을 보였으며, 72시간 동안 대조구인 Fermivin, SCY, CM은 0.07-0.1 g을 감소하였다. 분리된 효 모 중 YM17, YM29, YM35는 0.17 g을 YM28, YM31, YM34 는 0.18 g 감소로 발효성이 높은 균주로 관찰되었다. CO₂ 생성량이 가장 낮은 효모는 YM53로 총 0.06 g이 감소하여 YM28, YM31, YM34와 3배의 차이를 보였다.

효모의 알코올 내성은 알코올 농도별(0, 5, 10, 15, 20%)로 효모의 생육정도를 흡광도로 측정하였다. 대조구 중 CM은 알코올 내성이 낮아 비교 균주에서 제외하였으며 알코올 첨가량이 10%인 배지에서 대조구 Fermivin, SCY의 평균값 인 0.549보다 높은 알코올 내성을 보유한 효모는 8개 균주 로 YM17, YM22, YM31, YM32, YM37, YM42, YM43, YM49로 확인되었다. 알코올 15%를 첨가한 배지에서 대조 구 평균값인 0.4 이상 알코올 내성을 보유한 효모는 5균주로 YM15, YM22, YM31, YM32, YM37이었고, 알코올 20%를 첨가한 배지에서 대조구 평균값인 0.321 이상 알코올 내성 을 보유한 효모는 YM31, YM32, YM37로 나타났다.

효모의 CO₂ 생성능과 알코올 내성의 상관성을 시각적으 로 요약하기 위해 주성분 분석(Principal Components Analysis)을 하여 Fig. 2에 나타내었다. 주성분 분석은 1주성 분(PC1)과 2주성분(PC2)으로 구분되어 각각 60.91%, 20.34%로 총 변동의 81.25%의 설명력을 갖는 것으로 분석 되었다. PC1 양의 방향으로 알코올 내성과 CO₂ 생성능이 부하되었고, PC2은 알코올 내성 0%와 5%는 양의 방향으로, 10%, 15%, 20%와 CO₂ 생성능은 음의 방향으로 부하되었 다. 시료들의 주성분 중 PC1 양의 방향에 부하되는 효모는 32개로 나타났다. 그 중 양의 방향으로 강하게 부하된 효모 는 대조구를 제외한 YM37, YM31, YM32, YM22로 0.14-0.18 g의 높은 CO₂ 생성능을 보였고 15% 이상 알코올 에서도 내성이 있어 서로 양의 상관관계가 있음을 확인하였 다. 양조효모의 주된 역할은 신속하고 효율적으로 당화액 의 당을 전환하고 에탄올 및 이산화탄소를 만드는 것이다 (5). 주성분으로 분석한 4개의 효모들은 높은 알코올 내성과 CO₂ 생성능으로 주류 제조에 적합한 야생 효모로 판단되었 다.

Fig. 2. PC loadings and scores of the 62 wild yeast, alcohol tolerance and CO₂ produce evaluated by the descriptive pane in the PCA plot.

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효모는 발효 시 강한 응집성을 갖으며, 응집성이 높을수 록 발효 후 효모를 효율적으로 분리할 수 있기 때문에 양조 시 중요한 역할을 한다(24). Burns(25) 등은 효모를 10분 정치 후 침전량이 1 mL보다 크면 강응집성 효모로 분류하 여 보고하였다. 본 실험에서는 Helm(21)과 Burns(25) 방법 에 따라 60분 후의 효모 침전량이 1.0 mL 이상이면 high flocculation type 효모로, 0.5-1.0 mL 사이이면 flocculation type 효모로 0.5 mL 이하이면 Low flocculation type으로 분류하였다. 실험 결과 모든 효모가 시간이 경과함에 따라 침전량이 증가하였으며, 60분 후 1.0 mL 이상의 High flocculation type의 효모는 없었다. 46개의 효모는 0.5-1.0 mL 사이의 flocculation type이었으며 대조구 SCY를 포함한 16종의 효모는 low flocculation type으로 나타났다.

Cerulenin 및 5,5,5-trifluor-DL-Leucine(TFL) 내성은 Table 1에 나타내었다. Cerulenin는 균이 자라면 양성(+)으 로, 균이 자라지 않으면 음성(-)으로 하였으며 균의 크기에 따라(+, ++, +++)로 나타내었다. Cerulenin 1% 첨가한 배지 에서는 YM33을 제외하고 대조구를 포함한 64종의 균이 자랐고, 2%를 첨가한 배지에서는 36종의 균이 자라 cerulenin에 저항성을 갖는 것으로 나타났다. Ethylcaproate 의 생산은 지방산 생합성 효소가 촉진하는 것으로 알려져 있고 지방산 생합성 효소는 cerulenin에 의해 저해되기 때문 에 cerulenin 저항성 균주를 찾는다면 ethyl caproate 생산 균주를 찾을 때 유용하게 이용할 수 있다고 보고되었다(26). TFL을 첨가한 배지에서 모든 균주가 자라 TFL의 저항성을 보였다. Isoamyl acetate 또한 과일 향과 달콤한 향을 내는 주요 성분으로 L-leucine이 과잉 생산되는 균주는 에스테르 와 고급 알코올류의 생산이 증가하여 isoamyl acetate 역시 증가한다. 이러한 균주는 L-leucine의 유사물질인 TFL을 이용하여 저항성 균주를 선발하는 방법이 보고되었다(26). API ZYM kit를 이용한 효모의 효소활성의 결과는 Table 2와 같다. Esterase, esterase lipase 외 5개 효소가 62개 균주 에서 활성을 나타냈고, α-fucosidase 외 5개 효소의 활성은 발견되지 않았다. Ester는 맥주와 와인과 같은 발효 음료에 서 미량 화합물이지만 음료의 향미에 매우 중요한 역할을 한다. 발효주에서 향기성분의 주요 지표로서 사용되는 ester 는 esterase(EC3.1.1.1)에 의한 가수분해 반응과 alcohol acetyltransferase(EC2.3.1.84)를 포함한 합성반응의 상호작 용에 의해 이루어지며 효모는 이에 영향을 미치는 가장 중요한 요소 중 하나이다(26,27).