불등풀가사리 다당류의 분자량에 따른 이화학적 품질특성 및 피부 주름 개선 효과

본 실험에 사용한 불등풀가사리는 전라남도 완도군에서 채취한 것을 (유)제일물산에서 구입하여 본 실험에 사용하 였으며, 흐르는 물에 씻고 열풍 건조기(OF-22, JEIO TEC, Daejeon, Korea)로 50℃에서 24시간 건조하였다. 건조된 불 등풀가사리는 분쇄기(FM-909W, Hanil, Co., Sejong, Korea) 로 분쇄한 후 60 mesh 이하의 분말을 -20℃냉동고에 보관하 면서 조다당류 추출용 시료로 사용하였다.

조다당류를 분리하기 위해 건조 분말 5 g에 증류수를 고형분 대비 50배 첨가한 다음 viscozyme(Viscozyme L, 100 FBG/g, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)을 기질 대비 3% 첨가하여 shaking water bath(BS-31, Jeio Tech., Daejeon, Korea)에서 150 rpm, 60℃, 14시간 교반하였다. 교반한 시료 는 원심분리(3,000 ×g, 30분)한 다음 회수하여 상등액을 감압 농축기(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 60 °Brix가 될 때까지 농축하였다. 농축액은 5배량의 에탄올을 첨가하여 24시간 교반하고 원심분리(3,000 ×g, 30분)하여 조다당류를 회수하였고 동결건조(Freezone 2.5, Labconco Co., USA)한 다음 -70℃이하에서 보관하면서 산가수분해 및 분자량별 분리 시료로 사용하였다.

불등풀가사리 유래 조다당류를 0.1 N HCl을 사용하여 1% 용액으로 조정한 다음 50℃에서 4시간 동안 shaking water bath(BS-31, Jeio Tech.)에서 교반하였다. 교반을 통해 가수분해된 다당류는 0.1 N NaOH를 사용하여 pH를 중성화 한 다음 다당류를 24시간 동안 투석하여 산가수분해된 다 당류를 제조하였다. 산가수분해 다당류를 분자량별로 분리 하기 위해 amicon Ultra-15 centrifugal filter(Merck Millipore, Tullagreen Carrigtwohill, Ireland)를 이용하여 10 kDa 이하, 10-100 kDa 및 100 kDa 이상으로 분리한 다음 동결건조 하여 실험에 사용하였다.

불등풀가사리로부터 추출한 조다당류와 조다당류를 산 가수분해한 다음 분자량별로 분리한 다당류의 수율은 동결 건조(FreeZone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)한 다 음 건물 중량을 구한 다음 시료 제조에 사용한 원료 건물량 에 대한 백분율로 나타내었다.

총 당 함량 분석은 Saha와 Brewer(13)의 방법에 따라 페 놀-황산법으로 분석하였다. 즉 5% phenol 1 mL(w/v, Duksan Pure Chemicals, Seoul, Korea)와 sulfuric acid(Duksan Pure Chemicals) 5 mL를 0.2 mg/mL 농도로 희석한 시료 1 mL와 반응시킨 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하 고 glucose(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 표준 곡선으로 이용하여 계산하였다.

총 단백질 함량은 Lowry 등(14)의 방법으로 측정하였으 며 bovine serum albumin(BSA, Sigma-Aldrich Co.)을 표준 곡선으로 이용하여 계산하였다.

Uronic acid 함량은 Cesaretti 등(15)의 방법에 따라 분석 하였다. 즉, 25 mM sodium tetraborate(Sigma-Aldrich Co.)를 진한 황산 용액으로 제조한 후 이 용액 0.2 mL와 0.2 mg/mL 농도로 희석한 시료 0.05 mL를 96-well plate에 넣고 잘 섞은 후 100℃에서 10분간 가열하였다. 그 다음 상온에서 15분 방냉한 후 0.125% carbazole(Sigma-Aldrich Co.) 0.05 mL를 가하고 100℃에서 10분간 가열한 다음 상온에서 15분 방냉하고 550 nm microplate reader(Asys UVM340, Biochrom, Eugendorf, Austria)로 흡광도를 측정한 후, galacturonic acid(Sigma-Aldrich Co.)로 작성한 표준곡선으로부터 함량 을 계산하였다.

Sulfate 함량은 Dodgson 과 Price(16)의 방법으로 분석하 였다. 시료 3 mg에 6 N hydrochloric acid(HCl, Duksan Pure Chemicals.) 10 mL를 가한 후 110℃에서 6시간 가수분해하 였다. 가수분해한 시료 0.2 mL에 3% trichloroacetic acid (TCA, Acros organics, Geel, Belgium)를 3.8 mL 및 BaCl₂-gelatin 용액 1 mL를 가하고 25℃에서 15분간 반응한 다음 360 nm에서 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co.)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, potassium sulfate(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으 로부터 계산하였다.

색도 측정은 분말을 표준색도은 Y=94.5, a=0.18, b=0.32 로 보정된 색차계(Chromameter CR400, Minolta Co, Osaka, Japan)를 사용하여, 밝기를 나타내는 L(lightness), 적색도를 나타내는 a(redness), 황색도을 나타내는 b(yellowness)값을 측정하였으며, 색차 ΔE는 조다당류 동결건조 분말을 대조 구로 하여 아래와 같이 계산하였다.

$\text{ΔE}=\sqrt{\Delta L^2+\Delta a^2+\Delta b^2}$

점도는 회전식 점도계인 first LR touch viscometer(Lamy Rheology Instruments, Champagne au Mont d'Or, France)를 사용하여, 0.5% 농도의 시료 용액을 spindle L-2로 25℃, 60 rpm에서 측정하였다.

ORAC(oxygen radical absorbance capacity)측정은 Talcott 와 Lee(17)가 항산화 활성 측정에 사용한 분석법을 이용하 였다. 분석용 시료 및 water soluble analogue of vitamin E, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox, Sigma-Aldrich Co.)를 농도별로 희석하였으며, 분석용 시료의 제조에는 중성 phosphate buffer(61.6:38.9, v/v, 0.75 M K₂HPO₄와 0.75 M NaH₂PO₄)를 사용하였다. 검량 곡선을 작성하기 위하여 항산화 활성 비교 표준액으로 trolox를 10 μL를 phosphate buffer 50 mL에 용해하여 제조하 였고, 측정기기는 fluorescent micro plate reader(Infinite M200 PRO, Tecan Co., Salzburg, Austria)를 사용하여 485 nm에서 전자가 여기(excitation)되고 538 nm에서 방출 (emission)되게 조절하여 본 실험에 적용되었다.

실험에 이용한 폐 정상세포(L132)는 한국 세포주 은행 (KTCC, Seoul, Korea)에서 구입하여 RPMI 1640(Welgene, Daegu, Korea) 배지를 사용하였고, 사람 진피 섬유아세포주 (HS68)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 분 양받아 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Welgene.) 배지에 10% FBS 및 100 unit/mL penicillin, 100 ng/mL streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-18AIC, SANYO Co., Sakata, Japan)에 적응시켜 각각 배양시켰다.

L132 및 HS68 세포에 대한 독성은 MTT assay로 측정하 였으며, 배양된 세포주를 5×10⁴ cell/well의 농도로 조정하 여 96 well plate에 100 μL씩 첨가하여 24시간 배양하고, 이후 새로운 배지에 시료를 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 methyl thiazol-2-YL-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT 5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co.)용액을 각 well에 10 μL씩 첨가 하고 다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 완전히 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO, Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan) 100 μL를 각 well에 첨가 하여 10분간 반응시켜 formazan 결정을 완전히 용해한 다음 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

L132 세포에 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 손상에 대한 세포보호 효과를 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였으 며, L132 세포를 96 well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주하고 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 시료를 처 리하고 24시간 동안 배양한 다음 H₂O₂(Duksan Pure Chemicals.)를 1 mM의 농도로 첨가하고 30분간 반응 후 L132 세포에 MTT(5 mg/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하 여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고 각 well에 200 μL의 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가한 다음 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 세포보호 효과는 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

Ultraviolet B(UVB)로 손상된 피부 세포로부터 다당류의 분자량에 따른 영향을 조사하기 위해, HS68 세포주에 UVB 를 조사한 후 광노화를 유도한 다음 24 well plate에서 5×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 24시간 배양하여 세포를 부착하 였다. 이후, UVB 조사는 UV 램프를 이용하여 UVB (280-320 nm)를 20 mJ/cm² 되게 조사하였다. 이 때, UVB 조사량은 Chiang 등(18)의 보고에 따라 세포 생존율에 영향 을 주지 않으면서 matrix metalloproteinase(MMPs) 유도가 일어나도록 설정하였으며 UV-radiometer(LP9021, Delta OHM, Padua, Veneto, Italy)를 이용하여 조사량을 측정하였 다. 시료에 의한 MMP-1 활성 변화는 상기와 같이 UVB를 조사한 세포에 배지와 함께 시료를 처리하고 24시간 추가 배양한 다음 원심분리(3,000 ×g, 10분)후 상등액을 회수하 여 matrix metalloproteinase-1(MMP-1) human biotrak에 대 해 ELISA system(Amersham life science, Arlington Heights, IL, USA)을 이용하여 MMP-1 발현을 측정하였다.

HS68 세포주에 분자량별로 분리된 다당류를 농도별로 처리한 다음 pro-collagen type I의 합성양을 측정하기 위해 24 well plate에 각 well당 5×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 24시간 배양하여 세포를 부착하였다. 이후, UVB 조사는 MMP-1 저해활성과 동일하게 진행하였으며, 배양된 배지 를 제거하고 분자량별로 분리된 다당류를 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다. 각 well 로부터 상등액을 회수하여 procollagen type-I c-peptide EIA kit(Takara-Bio Inc., Shiga, Japan)의 각 well에 첨가한 후 제조사의 방법에 따라 procollagen type I의 총 양을 측정 하였다.

실험결과는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었 고 SPSS(19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의 성(P<0.05)은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.

조다당류 및 산가수분해된 분자량별 다당류의 수율, 총 당, uronic acid, sulfate 및 총단백질 함량은 Table 1에 나타내 었다. 산가수분해된 분자량별 다당류의 수율은 100 kDa(GPA-Ⅲ) 이상에서 39.6%로 가장 높았으며, 10-100 kDa(GPA-Ⅱ) 8.4% 및 10 kDa(GPA-Ⅰ) 이하에서 10.4%를 나타내어 가장 낮은 수율을 나타내었다. 이는 Kim 등(19)의 Porphyra tenera(해조류, 김) 가수분해물의 분자량별 분획 수율에서 분자량이 감소할수록 수율이 감소한다고 보고하 여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다. 총당, uronic acid 및 sulfate 함량은 100 kDa 이상에서 각각 85.82%, 32.85 g/100 g 및 39.04%의 함량을 나타내어 가장 높았고, 10 kDa 이하 분자량에서 81.37%, 27.89 g/100 g 및 33.38%를 나타내 어 가장 낮은 함량을 나타내었다. 총단백질 함량은 0.35-3.16%의 함량이었고 분자량이 낮을수록 높은 단백질 함량을 나타내었다. 이는 Hou 등(20)의 laminaria japonica (다시마) 후코이단의 분자량별(1-144.5 kDa)연구에서 총당 및 sulfate 함량은 분자량에 따라 다르게 나타난다고 보고하 였으며, 다당류의 산가수분해 처리로 인해 증가한 총당, uronic acid 및 sulfate와 다양한 구성 성분에 의해 항산화 활성, 면역 및 항보체 활성 및 피부 미백 및 주름 개선에 영향을 미친다고 알려져 있다(21,22). 불등풀가사리 유래 조다당류의 산가수분해에 따른 유용물질 함량 증가와 분자 량의 차이는 다양한 생리활성에 영향을 줄 것으로 사료된 다.

조다당류 및 분자량별 다당류(10 kDa, 10-100 kDa 및 100 kDa)의 색도은 조다당류 L 값, a 값 및 b 값이 각각 69.28, -1.17 및 10.39를 나타내었으며, 산가수분해 다당에 서는 분자량이 감소함에 따라 L 값(81.75-85.96), a 값 (-0.63-1.50) 및 b 값(10.03-12.61)은 증가하는 경향을 나타내 었다. 특히 조다당류를 기준으로 본 ΔE 값은 GPA-Ⅲ에서 12.49로 가장 낮고 GPA-Ⅰ에서 17.04로 가장 높게 나타나 산가수분해 다당에서는 분자량이 감소할수록 색도의 변화 가 증가하였다. 이는 Fukumoto 등(23)의 사과 주스의 분자 량별 색도 변화 연구에서 저분자 물질과 당, 색소물질 및 혼탁물질에 의해 색도이 변화된다고 보고하였으며 불등풀 가사리사리 유래 조다당류의 산가수분해를 통해 분자량별 색상이 다른것으로 나타났다.

분자량별 다당류의 따른 점도는 분해 전 조다당류의 경 우 40.36 cP에서 10 kDa 이하인 GPA-Ⅰ은 18.33 cP로 점도 가 감소하였으며, GPA-Ⅲ이 33.41 cP로 점도가 가장 높게 나타났다. 이는 Lee 등(24)의 알긴산의 물성에 미치는 저분 자화 영향 연구에서 저분자화를 통해 점성은 저하되고, 유 화능 및 흡유능은 증가한다고 보고하였으며, 이는 분자량 과 밀접한 상관성 및 -COOH기 등의 기능기들의 노출 증가 에 의한 것으로 알려져 조다당류의 산가수분해를 통해 산업 적 활용도가 증대될 것으로 판단된다.

Oxygen radical absorbance capacity(ORAC) assay는 측정 방법이 간단하고 재현성이 뛰어나 폭넓게 활용되고 있는 방법으로, 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)로부터 유도된 peroxyl radical에 대한 소거활성을 형 광도로 측정하며, peroxyl radical 손상에 대한 억제 시간과 억제율을 모두 반영하는 측정 방법이다(25).

불등풀가사리 유래 산가수분해된 분자량별 다당류의 ORAC 분석 결과는 Fig. 1과 같다. 500 μg/mL의 농도에서 측정한 ORAC 값은 GPA-Ⅲ에서 180.07 μM로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었으며, GPA-Ⅰ 및 GPA-Ⅱ에서 각각 135.11 μM, 152.49 μM로 활성을 나타내어 조다당류 34.70 μM에 비해 높은 항산화 활성을 나타내었다. 이는 Lee와 Hong(26)의 추출조건에 따른 오만둥이 유래 다당류의 항산 화활성 연구에서 ORAC값은 295.07 μM의 활성을 나타내어 본 연구와 유사한 경향을 나타내었다. 또한, Hou 등(20)은 laminaria japonica 후코이단의 분자량별 항산화 활성 연구 에서 항산화 활성은 분자량에 따라 차이를 나타내었으며 80 kDa에서 가장 높은 활성을 나타낸다고 보고하였다. 이러 한 항산화 활성의 차이는 다당류의 공간구조 차이와 황산기 함량에 의한 것이라고 보고되고 있으며(27), 자외선에 의한 활성 산소종의 생성과 MMPs의 발현은 노화를 촉진하므로 불등풀가사리 유래 산가수분해된 다당류에 의해 피부 노화 개선과 MMP-1 합성을 효과적으로 저해할 수 있을 것으로 사료된다.Table 1

Fig. 1. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) of crude polysaccharide from Gloiopeltis furcata and its fractions with different molecular weight. GCP, crude polysaccharide; GPA-Ⅰ, polysaccharides with molecular weight <10 kDa; GPA-Ⅱ, polysaccharides with molecular weight 10-100 kDa; GPA-Ⅲ, polysaccharides with molecular weight >100 kDa.

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조다당류와 산가수분해된 분자량별 다당류를 폐 정상세 포(L132)에 농도별로 처리한 다음 MTT 방법으로 세포 독 성을 측정하였다(Fig 2A). 산가수분해 다당류 분자량별 시 료를 0.5-5 μg/mL 농도까지 유의적인 세포 사멸이 나타나지 않아 독성이 없음을 확인하여 세포 보호효과 실험 농도로 설정하였다. 불등풀가사리 유래 조다당류 및 분자량별 다 당류의 산화적 손상에 대한 세포 보호효과를 알아보기 위하 여, H₂O₂ 처리 후 L132 세포에 대한 산화적 손상을 유발 한 다음 세포 생존율을 측정하였다(Fig 2B). 세포 보호효과 분석에 사용되는 H₂O₂는 쉽게 원형질막을 통과하기 때문에 in vitro 또는in vivo 실험의 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 산화적 손상을 유발하는 독성 물질로 이용되고 있다(28). 산화적 손상 유발 후 분자량별 다당류의 세포 보호효과는 GPA-Ⅲ 0.5-5 μg/mL 농도에서 87.34-103.85% 로 가장 높은 세포 보호효과를 나타내었으며, GPA-Ⅰ 및 GPA-Ⅱ에서 각각 66.96-86.04% 및 77.03-94.76%의 활성을 보여주어 1 μg/mL 농도에서 조다당류(83.64%)에 비해 높은 세포 보호효과를 나타내었다. Lee(29)는 불등풀가사리에 의한 gDNA 산화 억제활성 연구에서 H₂O₂에 의해 산화된 DNA는 불등풀가사리에 의해 산화적 손상 감소 효과를 나 타낸다고 보고하였으며, 이는 ROS 소거활성과 관련된 것 으로 보고하였다. 따라서 불등풀가사리 유래 산가수분해된 다당류는 산화적 손상을 감소시킴으로써 세포 보호효과를 증가시키는 것으로 사료된다. Table 2

Fig. 2. Effect of crude polysacchar ide and polysacchar ides with different molecular weights from Gloiopeltis furcata on the cell viability of L-132 cell. (A), Cytotoxicity; (B), Protective effect against H₂O₂ induced cytotoxicity. GCP, crude polysaccharide; GPA-Ⅰ, polysaccharides with molecular weight <10 kDa; GPA-Ⅱ, polysaccharides with molecular weight 10-100 kDa; GPA-Ⅲ, polysaccharides with molecular weight >100 kDa.

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불등풀가사리 유래 분자량별 다당류를 HS68 세포주에 0.05-1 μg/mL 농도로 처리한 결과 독성이 없음을 확인하였 으며(Fig. 3A), UVB 처리를 이용한 MMP-1 활성을 측정하 였다. MMP-1은 type Ⅰ collagenase로도 불리며 세포외 기 질 및 type Ⅰ pro-collagen을 분해함으로써 collagen 합성을 저해하는 인자로 알려져 MMP-1 활성 저해는 곧 collagen 분해를 감소시켜 피부 탄력 유지 및 주름 형성을 억제 할 수 있다(30). HS68 세포주에 UVB를 조사하고 분자량별 다당류의 MMP-1 활성 측정 결과는 Fig. 3B에 나타내었다. HS68 세포주에 UVB를 조사한 CON+UVB 처리구간에서 180.47%의 MMP-1 활성을 나타내었으나, GPA-Ⅲ 구간 0.05-0.5 μg/mL 농도 처리를 통해 69.67-100.87%의 가장 높은 MMP-1 활성 저해를 나타내었다. 또한, GPA-Ⅰ 및 GPA-Ⅱ 구간에서도 78.28-156.56% 및 76.96-111.33%의 활 성을 나타내어 농도 유의적인 MMP-1 저해 활성을 나타내 었다. 이러한 결과는, 황산다당에 의해 MMPs(metalloproteinases) 와 특이적 저해제인 TIMPs(Tissue inhibitor of metalloproteinase)와의 결합을 증진하여 elastase 활성을 저 해한다고 보고되어 있으며(31), Cha 등(32)은 후코이단 분 자량이 화장품 기능성에 미치는 연구에서 분자량 31-160 kDa 구간 모두에서 우수한 활성을 나타내었으며, 특히, 100 kDa 분자량에서 다른 분자량보다 높은 저해 활성을 나타낸 다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서, 불등풀가사리 유래 산가수분해된 다당류는 피부 구조 단백질의 분해를 억제하여 피부 주름 생성 억제에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 3. Effect of polysacchar ides with different molecular weights from Gloiopeltis furcata on MMP-1 activity of HS68 cell. (A), Cytotoxicity; (B), MMP-1 activity. The expression of MMP-1 in the UVB irradiated human dermal fibroblasts. GPA-Ⅰ, polysaccharides with molecular weight <10 kDa; GPA-Ⅱ, polysaccharides with molecular weight 10-100 kDa; GPA-Ⅲ, polysaccharides with molecular weight >100 kDa.

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콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로 피부 세포 지탱, 세포 분활과 분화 유도 등의 기능 을 가지고 있다. 이러한 콜라겐은 중합 반응이 일어날 때 콜라겐 분자로부터 절단 및 분리되는 기능을 가진 것으로 알려져 있으며(33), 프로펩티드 함량 측정을 통해 세포내의 콜라겐 생합성 정도를 Fig. 4에 나타내었다. HS68 세포주에 UVB를 조사한 결과 CON(UVB 무처리)에 비해 CON+ (UVB 처리)에서 콜라겐 생합성을 44.42% 저해 하였다. UVB 조사 후 분자량별 다당류를 처리하였을 때 pro-collagen 생합성능은 GPA-Ⅲ 0.05-0.5 μg/mL 농도에서 64.92-77.80%로 가장 높은 생합성 증진을 나타내었으며, GPA-Ⅰ 및 GPA-Ⅱ 구간 0.05-0.5 μg/mL 농도에서도 각각 58.84-69.326% 및 58.64-70.17%로 pro-collagen 생합성을 농도 의존적으로 증진하는 것으로 나타났다. 이는, Shin 등(34)의 히알루론산나트륨의 분자량 크기에 따른 collagen 합성 및 피부 흡습 연구에서 분자량 크기(1-1500 kDa)가 증가함에 따라 콜라겐 합성률은 증가하였으며 100 kDa 이 하에서 인공 피부 투과율이 현저히 증가하여 피부 장벽을 통과하여 기저층을 지나 안쪽까지 흡수할 수 있다고 보고하 였다. 따라서, 불등풀가사리 유래 산가수분해된 다당류는 피부 주름 형성과 밀접한 관련이 있는 콜라겐 합성 촉진을 통해 피부 주름 개선 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.

Fig. 4. Pro-collagen synthesis of polysacchar ides with different molecular weights from Gloiopeltis furcata in HS68 cell. GPA-Ⅰ, polysaccharides with molecular weight <10 kDa; GPA-Ⅱ, polysaccharides with molecular weight 10-100 kDa; GPA-Ⅲ, polysaccharides with molecular weight >100 kDa.

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