복숭아 품종별 성숙정도에 따른 항산화 및 항염증 효과간의 상관관계

본 연구에 사용한 복숭아는 2014년 경상북도 농업기술원 청도복숭아시험장에서 수확한 품종으로 외관이 양호하고 신선한 것으로 균일하게 선정하였다. 미숙과는 5월 하순에 적과한 것을 이용하였고, 성숙과의 경우 미황(Mihwang)은 6월 하순, 가납암백도(Kanoiwa Hakuto)와 천홍(Cheonhong) 은 7월 하순에 각각 수확하여 실험에 사용하였다. 각 품종별 과실 특성은 Table 1과 같다.

미숙과는 경핵 이전의 상태이므로 통째로 사용하였고, 성숙과는 핵과 과육을 분리한 후 과육 부분만을 사용하였 다. 이들을 동결 건조한 후 분쇄하여 분말화한 것을 polyethylene bag으로 포장하여 -40℃에서 냉동 보관 후 사 용하였다.

분석 시료는 건조 분말 5 g에 80% 에탄올 용매를 1:10 비율로 넣고 1일간 진탕배양기에서 추출한 후 여과지(No. 2, Whatman^TM International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하 여 얻은 용액을 감압농축기(OSB-2000, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후 동결 건조하여 100 mg/mL의 농도를 최종 농도로 설정하여 실험에 사용하였다.

분석을 위해 3종의 플라보노이드 화합물인 amygdalin, catechin, chlorogenic acid를 사용하였으며, 검량선 작성을 위하여 상기 3종의 플라보노이드 표준 화합물을 메탄올에 녹여서 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도의 표준액을 제조한 후 UPLC chromatogram을 산출하였다(R²>0.990).

전 처리한 각각의 시료 1 g을 메탄올 40 mL에 녹이고 40℃에서 2시간 동안 초음파 분쇄를 한 후 여과한 다음 rotatory evaporator를 이용하여 감압 하에 농축시키고 동결 건조하였다. 건조된 추출물을 증류수 및 메탄올에 각각 25 mg/mL의 농도로 녹이고 0.2 μm syringe filter에 여과한 후 1 μL를 Acquity UPLC H-Class(Waters, Milford, MA, USA) 를 이용하여 분석하였다(21). 이동상으로는 용매 A(1% formic acid in water) 및 용매 B(0.1% formic acid in methanol)를 사용하였다. 유속은 0.3 mL/min으로 일정하게 흘려주었으며, gradient elution은 다음과 같이 수행하였다. 7%의 B용매로 시작하여 2분까지 7%, 5분까지 17%로 증가 시킨 후 10분까지 17%를 유지하였다. 그리고 12분까지 25%로 증가시킨 후 17분까지 25%를 유지하였으며, 19분까 지 50%로 증가시킨 후, 24분까지 50%를 유지하였다. 이어 서 26분까지 90%로 증가시킨 후, 30분까지 90%를 유지하 였으며 다시 1분 동안 7%로 되돌아온 후 4분간 안정화시켰 다. 검출기는 UV 검출기를 사용하였고 고정된 파장 259 nm에서 검출하였다.

Total phenol 함량 측정은 Folin-Denis 방법(22)을 변형하 여 측정하였다. 96-well plate에 농도별 시료액 2 μL를 증류 수 20 μL와 Folin Ciocalteu's phenol reagent를 10 μL 첨가하 여 실온에서 6분간 incubation 시킨 후 7% Na₂CO₃ solution 100 μL와 증류수 70 μL를 첨가하여 실온에서 90분간 incubation 시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로는 gallic acid를 사용하였으며 시료와 동일한 방법으 로 분석하여 검량선을 작성한 후 total phenol 함량을 산출하 였다.

Total flavonoid 함량 측정은 Zhishen 등(23)과 Singleton 등(24)의 방법을 변형하여 측정하였다. 96-well plate에 농도 별 시료액 2 μL를 증류수 100 μL와 5% NaNO₂ solution 5 μL를 혼합하여 실온에서 10분간 incubation 시키고, 10% AlCl₃·6H₂O solution 10 μL를 첨가하여 다시 실온에서 10분 간 incubation 시킨 후 1 M NaOH 40 μL와 증류수 45 μL를 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 catechin을 사용하였으며 시료와 동일한 방법으로 분석하 여 검량선을 작성한 후 total flavonoid 함량을 산출하였다.

DPPH 라디컬 소거 활성 측정은 Blois의 방법(25)을 변형 하여 측정하였다. 96-well plate에 농도별 추출물 2 μL를 주입하고 50% 메탄올에 녹인 40 mM DPPH solution을 198 μL 가하여 총 부피가 200 μL가 되도록 하였다. 이 반응액을 실온에 약 10분간 방치한 후 분광광도계로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성도는 추출물의 첨가구와 무 첨 가구의 흡광도를 통해 백분율로 나타낸 다음 농도별 검량선 에 대비하여 IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)으로 나타내었다.

$\text{DPPH radical scavenging activity(\%)=(}\frac{\text{A control-A sample}}{\text{A control}}\text{)×100}$

Ferric ion reducing antioxidant power(FRAP) assay는 Benzie와 Strain의 방법(26)을 변형하여 측정하였다. 실험을 위한 FRAP solution은 acetate buffer(pH 3.6, 300 mM), 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ) 10 mM, FeCl₃·6H₂O 20 mM 을 10:1:1의 부피비로 섞어 실험 직전에 만들어 사용하였다. 양성 대조군은 ascorbic acid를 사용하였고, 시료를 96-well plate에 각각 6 μL 주입한 후 FRAP solution 194 μL를 가하여 실온에서 빛을 차단한 상태로 10분 동안 incubation 시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Cupric ion reducing antioxidant capacity(CUPRAC) assay 는 구리 이온의 환원력을 이용하여 radical을 환원시킬 수 있는지의 활성을 확인하는 방법으로 Apak의 방법(27)을 변형하여 측정하였다. DW:10 mM CuCl₂:75 mM Neocuproine 을 100:1:1의 부피비로 혼합하여 실험 직전에 사용하였다. FRAP assay와 마찬가지로 양성 대조군은 ascorbic acid를 사용하였고, 시료를 96-well plate에 각각 6 μL 주입하고 CUPRAC solution 194 μL를 가한 후 37℃에서 빛을 차단한 상태로 20분간 incubation한 후 450 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

Re의 방법(28)을 변형하여 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid) 양이온 소거능을 측정하였다. 1 mM AAPH와 2.5 mM ABTS 용액을 68℃에서 30분간 반응 시킨 ABTS solution을 만들어 실험에 사용하였다. 각 시료 를 100, 200, 400 μg/mL 농도로 만들어 20 μL를 취해 980 μL ABTS solution에 첨가한 뒤 일정 시간동안 반응시키면 서 734 nm에서 감소하는 흡광도 값을 측정하였다. 대조군 은 메탄올 20 μL를 첨가해 흡광도를 측정하였으며, 활성도 는 DPPH 방법과 마찬가지로 IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)으로 나타내었다.

$\text{ABTS radical scavenging activity(\%)=(}\frac{\text{A control-A sample}}{\text{A control}}\text{)×100}$

본 실험에 사용된 대식세포주인 murine macrophage RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 10% FBS, penicillin G (100 IU/mL)와 streptomycin (100 μg/mL)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 CO₂ incubator(5% CO₂, 95% air)에서 37℃ 의 조건으로 배양하였다.

RAW 264.7 세포에서 복숭아 추출물의 세포 독성을 확인 하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.7 세포를 5×10⁵ cells/mL의 농도로 96-well plate에 접종하고, 1시간 배양 후 시료 2 μL를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양하 였다. 시료가 처리된 세포에 LPS를 1 μg/mL의 농도로 처리 한 후 37℃에서 22시간 배양하였다. 배지에 희석된 MTT 용액(0.5 mg/mL)을 세포에 1시간 처리한 후, MTT를 환원시 켜 생성된 formazan이 배지에서 분리되지 않도록 배지를 제거하였다. 생성된 MTT-formazan은 DMSO에 용해시켜 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하 였다.

RAW 264.7 세포를 5×10⁵ cells/mL의 농도로 96-well plate 에 접종한 후 농도별로 시료를 처리하고 LPS를 1 μg/mL이 되도록 가하여 24시간 배양하였다. 세포 상등액에 생성된 NO의 양은 griess reagent(1% sulfanilic acid:1% napthylamine =1:1)를 이용하여 상등액과 1:1의 비율로 혼합한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리는 각 그룹 간의 차이를 보기위해 SAS프로그램 을 이용하여 분산분석(analysis of variance)을 실시하고 유 의수준 p<0.05에서 유의적인 차이를 보인 경우 Duncan의 다중범위 시험법(Duncan’ multiple arange test)을 적용하여 사후분석을 실시하였다.

성숙 정도에 따른 품종별 복숭아의 총 페놀 및 플라보노 이드 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 페놀 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있으며 분자 내 다수의 phenolic hydroxyl기를 가지고 있고, 단백질 및 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있어 항산화 효과 및 항암, 항염증 효과가 있는 것으로 보고되었다(29-31). 미황, 가납암백도, 천홍 미숙과의 총 페놀 함량은 각각 24.34±0.53 mg GAE/g, 24.75±1.56 mg GAE/g, 64.99±0.22 mg GAE/g으로 나타나 천홍 미숙과의 페놀 함량이 다른 품종들에 비해 약 2.7배 더 높은 함량을 보였다(p<0.05). 반면, 성숙과의 총 페놀 함량은 미황, 가납암백도, 천홍 각각 15.86±0.29 mg GAE/g, 9.02±0.35 mg GAE/g, 9.30±0.29 mg GAE/g으로 미황 성숙 과가 다른 품종에 비해 약 1.7배 더 높은 함량을 나타냈다 (p<0.05). 플라보노이드는 식물체에 다양하게 존재하는 색 소로서 페놀에 속하는 성분이다. 항산화능이 높으며 병원 균 억제, 자외선 차단, 항염, 항균, 항바이러스, 지질저하 작용, 항알레르기 등의 효과가 알려져 있다(32-34). 미숙과 의 품종별 플라보노이드 함량은 미황, 가납암백도, 천홍 각각 24.17±9.73 mg CE/g, 25.41±1.19 mg CE/g, 68.24± 10.86 mg CE/g 으로 나타나 천홍 미숙과가 다른 품종들에 비해 약 2.8배 높은 총 플라보노이드 함량을 나타냈다 (p<0.05). 반면 성숙과의 품종별 플라보노이드 함량은 미황, 가납암백도, 천홍 각각 8.25±0.21 mg CE/g, 5.92±0.00 mg CE/g, 4.83±0.17 mg CE/g으로, 미황 성숙과가 다른 품종에 비해 플라보노이드의 함량이 높은 것으로 나타났다. 이에 따라 미숙과와 성숙과의 플라보노이드 및 페놀의 함량을 비교하였으며, 미숙과가 성숙과에 비해 항산화성 물질인 플라보노이드 및 페놀의 함유량이 더 높다는 결과를 얻을 수 있었다.

복숭아 품종별 성숙도에 따른 항산화 활성 결과는 Table 3과 같다. 복숭아 품종별에 따른 미숙과의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 결과, 천홍 미숙과가 264.0 μg/mL의 농도 에서 IC₅₀을 보여 가장 높은 활성을 나타냈으며, 천홍 다음 으로 미황, 가납암백도 순으로 나타났다. 성숙과 중에서는 미황이 가장 높은 412.9 μg/mL의 농도에서 IC₅₀을 나타냈으 며, 미황 다음으로 천홍, 가납암백도 순으로 나타나 미숙과 와 성숙과의 항산화 활성이 차이가 나타났다. 항산화 관련 연구에 따르면 높은 페놀 함량이 높은 항산화 활성을 나타 내는 것으로 보고되어 있으며(35), 이는 총 페놀과 플라보노 이드 함량이 가장 높은 천홍 미숙과가 DPPH 라디칼 소거능 이 우수한 것으로 나타나 DPPH 라디칼 소거능은 총 페놀과 플라보노이드 함량과의 관련이 있음을 시사한다(Table 4).

ABTS 용액과 potassium persulfate를 암실에서 반응시키 면 청록색 ABTS 라디칼(ABTS·+)이 생성되고 시료 중에 항산화 활성을 갖는 물질이 존재하면 ABTS 라디칼이 소거 되어 탈색되면서 흡광도 변화를 나타내게 된다. 이 방법은 친수성 및 소수성 물질의 항산화 활성 측정에 모두 적용할 수 있으며, 단 시간 내에 라디칼 소거능을 측정함으로써 다른 작용기를 갖는 항산화 능력을 측정할 수 있는 장점이 있다. 복숭아 품종별 미숙과와 성숙과의 ABTS 라디칼 소거 능을 측정한 결과, 미숙과에서 천홍, 가납암백도, 미황 순으 로 각각 242.7, 467.3, 490.2 μg/mL의 농도에서 IC₅₀을 나타 낸 반면 성숙과에서는 활성이 관찰되지 않았다. 천홍 미숙 과가 가장 우수한 ABTS radical 소거능을 보였으며, 이는 천홍 미숙과의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 다른 품종 에 비해 가장 높았기 때문에 항산화 활성에 영향을 준 것으 로 판단된다.

FRAP 활성은 화합물의 환원력(ferric reducing ability)을 측정하는 것으로 ferric tripyridyltriazine(Fe³⁺-TPTZ)이 환원 제에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine(Fe²⁺-TPTZ) 으로 환원되는 원리를 이용한 것이며, 이는 DPPH 및 ABTS 실험방법과는 다른 메커니즘의 항산화 활성 측정 방법이다 (35). 복숭아의 성숙정도에 따른 품종별 FRAP value를 확인 한 결과, 대조군에 비해 미숙과에서 천홍, 미황, 가납암백도 가 8.4배, 6.1배, 5.3배로 천홍이 가장 높은 활성을 나타난 반면, 성숙과에서는 유의적 차이가 나타나지 않았다.

CUPRAC 활성은 환원제(antioxidant)에 의해서 구리이온 (Cu²⁺)이 환원되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하 는 방법이다(36). 품종별 미숙과 추출물에서는 대조군 대비 천홍이 8.4배의 활성이 나타났으며, 미황과 가납암백도와 비교하여 유의적 활성이 관찰되었지만, 성숙과에서는 FRAP 결과와 마찬가지로 유의적 차이가 나타나지 않았다.

이에 따라 복숭아의 품종별 성숙정도에 따른 항산화 실 험 결과를 토대로 성숙과에 비해 미숙과의 항산화 활성이높 았으며, 품종별로는 천홍의 활성이 가장 우수하였다. 이는 총 페놀 및 플라보노이드의 함량이 우수함에 따라 높은 항산화 활성을 보여, 페놀 및 플라보노이드와 DPPH, ABTS 및 CUPRAC assay 간의 관련이 있음을 보여준다.

복숭아에 함유되어 있는 주된 생리활성 화합물은 클로로 겐산(chlorogenic acid), 카테킨(catechins), 아미그달린 (amygdalin) 등 이 알려져 있다(3). 이에 위 3종의 화합물을 표준 물질로 사용하였고, UPLC 크로마토그래피를 이용하 여 Fig. 1에 나타냈다. 복숭아 3종의 미숙과 추출물의 함유 성분에 대한 UPLC 크로마토그래피를 비교 분석한 결과 유사한 패턴이 관찰되었지만, 각 피크의 함량에는 차이가 나타났다. 클로로겐산의 머무름 시간인 11분일 때에 모든 샘플에서 나타났으며, 이를 확인하기 위해 UV 스펙트럼을 관찰한 결과 클로로겐산에서 나타나는 UV 스펙트럼과 유 사한 형상이 관찰되어 클로로겐산으로 확인 하였다(Fig. 2). 또한 20-25분 사이의 피크 패턴이 천홍 미숙과가 미황과 가납암백도 미숙과와의 피크 패턴과 다르게 나오는 것이 확인 되어 천홍 미숙과의 유효성분이 다른 미숙과와 다른 성분이 함유 되어 있을 것으로 예상하였다. 그에 반해 성숙 과의 품종별 UPLC 크로마토그래피는 미숙과에 비해 전체 적으로 피크가 낮게 확인 되었으며, 미숙과에서 관찰된 클 로로겐산의 11분 피크가 약하게 관찰되었지만, UV 스펙트 럼을 관찰한 결과 클로로겐산으로는 확인되지 않았다(Fig. 3). 위의 결과는 총 페놀 및 플라보노이드 함량의 관계를 간접적으로 예상하였고, 추후 다른 물질에 대한 확인은 LC-MS 및 NMR 분석을 통한 분석이 필요 할 것으로 예상된 다.

Fig. 1. UPLC chromatograms (A) and UV scan graphic (B) of standard compounds (amygdalin, catechin and chlorogenic acid).

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Fig. 2. UPLC chromatograms (left) and UV scan graphic (r ight) of the unr ipe extracts of three peach cultivars. A, Miwhang; B, Kanoiwa Hakuto; C, Cheonhong.

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Fig. 3. UPLC chromatograms (left) and UV scan graphic (r ight) of the r ipe extracts of three peach cultivars. A, Miwhang; B, Kanoiwa Hakuto; C, Cheonhong.

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본 연구 에서 복숭아 3품종의 성숙과와 미숙과 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위해 LPS 자극에 의해 유도된 RAW 264.7 대식세포(macrophage)의 염증 반응에서 NO 억제 활성 실험을 수행하였다. 면역세포중의 하나인 대식 세포는 능동 및 수동 면역반응에서 매우 중요한 역할을 하여 LPS 같은 외부항원 자극 시 종양괴사인자(tumor necrosis factor alpha, TNF-α), 인터루킨 1β(IL-1β), 인터루킨 6(IL-6)와 같은 다양한 염증매개 물질 등을 유도 하며, 이러 한 염증매개 물질 형성은 NO 형성을 증가 시켜 염증 반응을 촉진 시킨다(37).

RAW 264.7 세포에서 미황 미숙과의 추출물은 약 30%의 NO 생성 억제 효과가 관찰되었고, 가납암백도 미숙과가 약 29%, 천홍 미숙과가 약 20%의 효과가 나타났지만, 복숭 아 성숙과 3품종에서는 활성이 나타나지 않았다(Fig. 4). 본 연구에 따라 성숙과에 비해 미숙과의 항염증 활성이 높게 나타나므로 미숙과 3품종에 대한 항염증 소재 개발의 가능성을 확인 할 수 있었다.

Fig. 4. Effects of fruits r ipening of peach on production of nitr ic oxide and cell viability in RAW 264.7 cells. MH, Mihwang; KH, Kanoiwa Hakuto; CH, Cheonhong. Values are means±SD of triplicate determinations. Different superscripts within a column (a-b) indicate significant differences of p<0.05.

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복숭아 3품종의 성숙과와 미숙과의 총 플라보노이드 함 량과 총 페놀 함량과의 상관성이 0.995로 유의적(p<0.01)으 로 가장 높은 상관관계를 나타냈으며, 항산화 활성간의 상 관성은 FRAP 활성과 CUPRAC 활성 간의 상관성(0.994, p<0.01), DPPH 라디칼 소거능과 FRAP 활성 간의 상관성 (0.970, p<0.01), ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거 능 간의 상관성(0.908, p<0.05), CUPRAC 활성과 ABTS 라 디칼 소거능의 상관성(0.886, p<0.05) 순으로 모두 유의적인 상관관계가 확인되었다. 또한 총 페놀 함량과 총 플라보노 이드 함량의 항산화 활성들 간의 상관관계에서 고도의 정의 상관성(0.889-0.968)을 나타내었다. 이는 플라보노이드성 페놀 화합물이 라디칼을 직접 소거하는 항산화 작용뿐만 아니라 환원력에도 관여한다는 것을 확인할 수 있다. 반면, 항염증 활성과 항산화 활성들 간의 상관성은 낮게 확인되었 다. 또한 항염증 활성과 총 페놀 및 플라보노이드 함량간의 상관성은 낮은 상관관계를 나타내며, 이는 플라보노이드성 페놀 화합물이 항염증 활성에 대한 관여성이 낮다는 것을 확인 할 수 있다(Table 4). 따라서 본 연구에서 복숭아 3품종 의 성숙과와 미숙과의 플라보노이드성 페놀 화합물이 다양 한 항산화 활성에서 효능을 나타내고 있으며, 항염증 활성 에는 비 플라보노이드성 페놀 화합물이 작용 하는 것으로 확인할 수 있었다.