다양한 염도에서 제조한 된장의 장기 숙성 시 품질변화

메주는 순창 장류 주식회사에서 대원콩 품종을 사용하여 제조한 약 700 g 중량의 순창 메주를 구입하여 사용하였고, 소금은 신안지역에서 생산된 3년 숙성 천일염(CJ)을 마트에서 구입하여 2015년 실험에 사용하였다.

된장 제조는 순창장류주식회사에서 제공한 매뉴얼을 참조하여 일부 변형하여 실시하였다. 먼저 소금물은 각각 8, 16, 30, 40% 농도로 만들어 하룻밤 침지시킨 후 용해된 소금물의 불순물 제거를 위해 거름망(mesh size 150 μg)으로 걸러 준비하였고, 각각의 스테인레스 용기에 메주 4개씩을 넣고 소금물을 부은 후 누름돌로 침수시켜 28℃ 항온기에서 20일 동안 발효시킨 후 간장과 된장을 분리하기 위해 장가르기를 하였다. 그 후 분리한 된장을 잘게 으깨어 4, 8, 15, 20%의 염도로 맞춘 후 4.5 L 스테인레스 용기에 된장 2 kg씩 담아 30℃에서 발효를 진행하였다.

수분 함량은 식품공전(15)에 따라 105℃ 상압건조법에 의해 분석하였으며, 된장 1 g을 105℃ Dry oven(MOV-112, Sanyo Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 항량이 될 때까지 건조시켜 백분율(%)로 계산하였다.

염도는 AgNO₃ 적정법(15)을 변형하여 측정하였다. 된장 5 g에 증류수로 20배 희석하여 진탕배양기(SI-IS20 model, Shin-il Co., Seoul, Korea)에서 160 rpm 1시간동안 추출 후 여과지(Whatman No. 1)로 여과하고 이 여액 10 mL를 취하여 0.1 N AgNO₃로 적정하였다.

pH는 된장 10 g을 증류수로 5배 희석하고 Homogenizer (Polytron PT-MR 2100, Kinematica AG, Lucerne, Switzerland) 로 균질화한 후 8,000 rpm에서 10분간 원심분리(Supra 25k, Hanil Co., Ltd., Incheon, Korea)한 상층액을 시료액으로 사용하였다. 이 시료액을 pH meter(Corning 340, Corning Co., NY, USA)로 분석하였다.

Shin 등(17)이 제시한 방법에 따라 산도는 pH 측정을 위해 준비한 시료액 10 mL에 1% phenolphthalein 지시약을 첨가하여 시료의 pH가 8.3이 될 때까지 소비된 0.1 N NaOH 의 양을 측정하였다.

환원당 함량은 DNS법(16)에 따라 분석하여 측정하였다. 시료액 1 mL에 DNS 시약 3 mL을 혼합하여 100℃의 물에서 5분 동안 중탕한 것을 충분히 식힌 후 spectrometer(Libra S35, Biochrome Ltd., Cambridge, England)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 포도당을 표준물질로 하여 작성한 검량곡선으로부터 환원당 함량(%)을 계산하였다.

된장의색도는색도계(Minolta CR-300, KONICA MINOLTA, Osaka, Japan)를 이용하여 측정한 후 Hunter값 명도(L, lightness), 적색도(a, redness), 황색도(b, yellowness) 및 색차 (ΔE)값을 측정하여 평균값으로 나타내었다(17).

아미노태 질소(NO₃-N)는 Formol법(AOAC 1990)(18)을 토대로 일부 변형하여 측정하였다. 시료액 5 mL에 중성 formalin(pH 8.3) 10 mL과 증류수 10 mL을 넣어 0.1 N NaOH 로 pH 8.4가 될 때까지 중화하기 위해 적정하였다. 이때 소모된 0.1 N NaOH mL 양을 아미노태 질소함량으로 결정하였다. 대조구는 시료액을 대신하여 증류수를 사용하여 측정하였다.

암모니아태 질소(NH₄-N)는 indophenol-blue법(19)을 참고하여 시료액 0.1 mL에 A용액과 B용액을 각각 2 mL씩 차례로 넣고 37℃에서 20분간 반응시켜 spectrometer(Libra S35, Biochrome Ltd., Cambridge, England)를 이용하여 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)을 표준물질로 하여 작성한 검량곡선으로부터 암모니아태 질소 함량(mg%)을 계산하였다(A용액, phenol 10 g and sodium nitroprusside dehydrate 0.05 g in distilled water 1,000 mL; B용액, Na₂HPO₄·12H₂O 9 g, NaOH 6 g and NaOCl 10 mL in distilled water 1,000 mL).

α-Amylase 활성은 건강기능식품공전(20)을 일부 변형하여 수행하였다. 효소 활성 측정을 위한 조효소액은 된장 시료 2 g에 증류수로 10배 희석하고 진탕배양기(Shin-il, Seoul, Korea)에서 180 rpm, 4시간동안 추출한 후 하룻밤 냉장보관 후 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 여과지 (Whatman No. 2)로 여과한 여액을 조효소액으로 사용하였다.

1% 전분 기질용액 1 mL을 40℃에서 5분간 예열시킨 후 조효소액 50 μL를 첨가하였다. 이후 이 반응액 50 μL에 요오드 용액 5 mL을 넣어 30℃ incubation에서 30분간 반응 시킨 실험구와 반응 전 대조구를 각각 660 nm에서 흡광도 를 측정하여 효소활성을 측정하였다.

단백질분해효소 활성 측정은 건강기능식품공전(20)을 일부 변형하여 수행하였다. 0.6% casein 기질용액 100 μL와 조효소액 100 μL를 각각 취하여 37℃에서 10분간 방치하였다. 그 후 반응을 정지시키기 위해 0.4 M TCA 용액 200 μL를 넣고 37℃에서 25분간 반응시켰다. 이 용액의 침전물을 제거하기 위해 원심분리하여 상층액 100 μL를 취하고, 여기에 0.4 M 탄산나트륨 500 μL와 3배 희석한 Folin 시약100 μL를 넣어 37℃에서 20분간 반응시킨 후 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 1 unit는 1 μmole의 tyrosine을 유리시키는 효소의 양으로 하였다.

된장의 발효기간 중 미생물변화를 관찰하기 위해 총균수와 된장의 신맛을 부여하는데 관여하는 유산균수를 측정하기 위해 식품공전(16)의 방법을 일부 변형하여 수행하였다. 일정량의 된장 시료를 취하여 0.85% (w/v) 생리식염수를 9배로 희석하여 시험관에 담아 균질화시키고 이를 단계별로 희석하여 총균수는 plate count agar(Difco Lab. Detroit, MI, USA), 유산균수는 MRS(Difco Lab. Detroit, MI, USA)배지를 이용하여 접종 도말하였다. 총균수는 37℃에서 24시간동안 호기배양을, 유산균수는 48~72시간동안 혐기배양한 후 형성된 집락을 2회 반복 계수하여 log CFU/g로 환산하여 표시하였다.

발효기간에 따른 된장의 맛 변화를 살펴보기 위하여 맛센서 분석기(TS-5000Z, Insent, Atsugi, Japan)를 이용하여 수행하였다. 된장 시료의 전처리는 각각의 샘플 20 g을 취해 증류수로 5배 희석한 후 원심 분리하여 얻은 상등액을 여과지(No. 2)로 거른 후 시료로 사용하였다. 맛 센서 분석기에 시료를 70 mL씩 넣어 3회 반복 측정한 후, 평균값을 구하여 쓴맛(bitterness), 짠맛(saltiness), 신맛(sourness), 감칠맛(umami), 떫은맛(astringency)의 값을 객관적으로 나타내었다(21).

미생물 수를 제외한 모든 실험은 3회 반복 실험하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 실험값에 대한 통계분석은 SAS 9.2 program(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 통계처리 하였으며, Duncan's multiple range test 방법과 t-test를 이용하여 평균값 간에 유의수준 p<0.05에서 유의성을 검정하였다.

다양한 염 농도(4, 8, 15, 20%)에서 제조한 된장을 12개월동안 발효하면서 수분 함량 및 염도의 변화를 조사하여 Table 1에 제시하였다.

수분 함량에서는 통계적으로 유의성 있게(p<0.05) 염도가 높을수록 수분 함량이 낮았는데 4% 된장의 경우 담금 직후 65.3±0.1%에서 발효기간 내내 비슷한 수준을 유지하다가 12개월 경과 후 69.8±0.4%로 크게 증가하였고 15와 20% 된장은 담금 초기에 각각 54.7±0.9와 54.6±0.8%에서 발효 12개월 경과 시 54.1±1.0와 52.2±0.6%로 담금 초기와 큰 변화 없이 유사한 값을 유지하였다. 이에 염도를 달리하여 제조한 된장은 장가르기 후 된장 담근 직후에 염 농도에 따라 수분 함량 차이를 나타낼 뿐 발효기간 12개월 동안 그다지 큰 변화를 보이지 않음을 알 수 있었다. 전통식품 규격기준(22)에 따르면 된장의 수분함량이 60%이하로 규정되어 있어 본 실험에서 제조한 4와 8%의 저염 된장의 경우 수분 함량이 높았기에 20일간의 소금물 침지 기간동안 삼투압 작용을 고려하여 탈수 조건을 검토하여 규격에 맞게 낮추는 방안을 모색해야 할 것으로 사료된다.

염도 변화는 식염 농도를 4, 8, 15 및 20%로 조정한 각각의 된장은 담금 초기의 염도 값과 큰 차이를 보이지 않아 발효기간 동안 소금 농도에 따라서는 된장의 염도 변화에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

된장의 장기 숙성에 따른 pH, 산도 및 환원당 변화는 Fig. 1에 제시하였다.

Fig. 1. Change on pH, titratable acidity and reducing sugar of Doenjang according to various salt concentrations during fermentation period. Means±SD (n=3) within each column followed by the same letter are not significantly different (p<0.05). , 4% Doenjang; , 8% Doenjang; , 15% Doenjang; , 20% Doenjang.

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pH는 된장 담금 초기에는 염도가 높을수록 pH값이 4.3±0.0에서 5.1±0.0로 통계적 유의적인 차이를 보였고, 발효기간 5개월이 경과되면서 낮은 염농도인 4와 8% 된장에서는 초기보다 다소 증가하여 9개월째에는 7.1±0.0와 5.4±0.0를, 12개월 경과 시에는 8.2±0.0와 5.8±0.0을 나타내었는데 특히 4% 된장의 경우 유의적인 차이로(p<0.05) 크게 증가하여 알칼리성을 띄었다. 이는 Shin 등(17)의 보고와 같이 숙성초기에는 유산균 등의 발효미생물의 생육이 용이하여 젖산 생성도 병행되어 pH가 낮아졌지만, 장기 발효가 진행되면서 15와 20% 된장을 제외한 4와 8% 염농도로 제조한 저염 된장만이 pH가 높아져 Jung 등(23)이 제시한 17.6% 된장이 후발효가 진행되는 약 180일 이후부터 pH가 급격히 증가하였다는 보고와 상이한 결과를 나타내었다. Bang 등(24)은 저염 된장에서 pH가 약간 증가한 것은 유기산 감소로 인한 것으로 다른 미생물들이 생육을 위해 젖산 등 유기산을 영양원으로 이용하여 소실된 것으로 언급하고 있다.

산도 변화는 장담금 직후에는 4와 8% 된장은 1.8과 1.5%이었고, 15와 20% 된장은 1.4와 1.2%로 염농도가 낮을수록 높았는데 발효 2개월까지는 급격히 증가하여 최대치까지 높아졌다가 이후 꾸준히 감소되었으나, 발효 12개월째에는 발효초기와 달리 각각 0.7, 1.0, 2.2, 1.5%로 저염 된장이 고염에 비해 낮은 산도 값을 보였는데 고염(15, 20%)된장에서는 발효 9개월째에 산도가 증가했다가 다시 감소하였다. 이런 산도변화는 미생물의 대사 작용으로 인해 생성되는 lactic acid 및 acetic acid 등 유기산의 축적으로 인해 산도가 높아졌다가 이후 이들 유기산이 미생물에 의해 대사되어 낮아진 현상이라 판단된다(25).

환원당 함량 변화는 소금농도에 상관없이 발효기간 1~2개월 내에 환원당 함량이 최대값을 나타내었고 그 이후는 감소하는 경향을 보였는데, 4% 된장은 발효초기 0.4±0.0에서 12개월째 0.4±0.0%로 거의 변화가 없었던 반면 8, 15 및 20% 된장의 경우 각각 초기 1.7±0.0, 1.7±0.0 및 1.5±0.0%에서 0.7±0.0, 1.4±0.0 및 1.1±0.0%로 환원당 함량이 통계적 유의성 있게 감소하였는데, 8% 된장의 경우 좀 더 높은 감소율을 보였다. 이는 장 담금 후에는 미생물에 의해 생성된 amylase의 높은 활성에 의해 탄수화물이 분해되어 환원당 함량이 높았지만, 발효기간이 진행될수록 미생물 영양원 또는 유기산 발효의 기질로 유리당이 소모되어 감소된 것으로 사료된다(26).

된장의 색은 맛과 함께 소비자 기호도에 큰 영향을 줄 수 있어 발효에 따른 된장의 색도 변화를 관찰하여 Fig. 2에 제시하였다.

Fig. 2. Change on color of Doenjang according to var ious salt concentrations dur ing fermentation per iod. Means±SD (n=3) within each column followed by the same letter are not significantly different (p<0.05). , 4% Doenjang; , 8% Doenjang; , 15% Doenjang; , 20% Doenjang.

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염도를 달리하여 제조한 된장은 30℃에서 12개월간 발효하였을 때 모든 시료에서 L값이 발효초기 51.7~58.3 범위에서 꾸준히 감소하여 36.7~37.8 범위까지 낮아져 어두운 색을 띠었다. 또한 a값은 담금 직후 6.1~7.3의 값으로 시작하여 발효 3개월째 8.3~9.8로 꾸준히 증가하다가 5개월을 전후로 감소하는 경향을 보였다. 반면 b값에서는 4% 된장만 담금 직후부터 발효 3개월까지 경미하게 증가하다 감소하였고 나머지 시료는 담금 직후부터 꾸준히 감소된 값을 나타내었다.

이와 같이 된장은 발효가 진행되면서 갈변 현상을 보이며 색 변화가 이루어지는데, 이 값을 변색도(ΔE)로 나타내었을 때 모든 시료들은 발효기간이 길어질수록 점진적으로 변화하였고, 이와 같은 현상은 Chang 등(27)이 보고한 바와 같이 콩의 단백질과 전분이 분해되어 생성된 당과 아미노산의 화학반응인 mallard 반응에 의한 갈색화로 인한 것으로, 발효식품인 된장은 염농도에 따라 영향을 받아 이런 현상이 다르게 나타날 수 있음을 알 수 있었다

염도를 달리하여 제조한 된장을 1년 동안 발효시키면서 아미노태 질소 및 암모니아태 질소 함량 변화를 살펴보고 Fig. 3에 그 결과를 제시하였다.

Fig. 3. Changes in amino- and ammonia-type nitrogen contents of Doenjang according to various salt concentrations during fermentation period. Means±SD (n=3) within each column followed by the same letter are not significantly different (p<0.05). , 4% Doenjang; , 8% Doenjang; , 15% Doenjang; , 20% Doenjang.

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아미노태 질소 함량은 모든 시료에서 발효가 진행되면서 꾸준히 증가하는 경향을 보였는데 담금 초기에 저염(4, 8%) 된장은 520.3±2.9~570.3±11.9 mg%, 고염(15, 20%)된장은 363.5±4.9~477.9±2.4 mg%값을 보였고 발효가 진행될수록 증가하다가 12개월째에는 각각 1,127.9±6.3~1,268.4±32.9 mg%과 813.4±16.8~859.6±2.8mg%로 통계적 유의적인 차이로(p<0.05)의 값으로 저염 된장에서 더 높은 값을 나타내었다. 이는 Lee 등(26)의 보고에서 낮은 염농도에서 16주동안 발효시킨 된장이 protease 등 단백질 분해에 관여하는 효소 활성이 높아 아미노태 질소 함량이 높았다고 본 연구와 유사한 결과를 보여주었다.

암모니아태 질소 함량은 발효초기에는 염농도에 따른 큰 차이를 보이지 않았지만, 5개월 경과 후 저염 된장(4와 8%)이 각각 18.8±5.6와 9.5±2.0 mg%의 값으로 다른 시료에 비해 유의적으로 높았는데, 이후부터 4% 된장만이 높은 함량을 나타내어 발효 12개월째에는 암모니아태 질소 함량이 88.2±0.7 mg%로 급격히 높아졌고, 다른 시료들은 발효가 진행되면서 꾸준히 감소하였다. Lee 등(26)이 언급한 것처럼 염 농도가 낮을수록 휘발성 염기질소 중 하나인 암모니아태 질소 함량이 높은 값을 나타내긴 했지만, 발효가 진행되면서 지속적으로 증가하였다는 보고와는 상이하였다.

암모니아태 질소는 발효식품에서 이상 발효의 지표로 사용되어 된장에서 아미노태 질소함량은 높고 암모니아태질소 함량은 낮을수록 우수한 품질을 나타내므로 저염 환경에서 발효식품을 제조할 경우 고염 환경에서보다 단백질 가수분해 효소의 활성이 높으므로 단백질이 아미노산으로 과잉 분해되어 이상 발효가 진행되지 않도록 염 농도를 고려하여 수행해야 할 것으로 사료된다.

된장의 주원료인 콩 전분질과 단백질을 가수분해하여 된장의 단맛과 구수한 맛을 결정하는데 있어 미생물에 의해 분비된 amylase와 protease 등의 효소활성은 깊은 관련이 있다. 이에 된장을 장기간 발효 과정 동안 효소 활성도 변화를 측정하여 Fig. 4에 나타내었다.

Fig. 4. Changes on enzymatic activity of α-amylase and protease of soybean paste (Doenjang) at 4, 8, 15, and 20% salt content during fermentation. , 4% Doenjang; , 8% Doenjang; , 15% Doenjang; , 20% Doenjang

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염 농도를 달리하여 제조한 된장 내 α-amylase 효소 활성 변화를 살펴 본 결과 8, 15, 20% 농도의 된장은 장 담금시 1차 발효과정에서 미생물 작용이 활발하여 효소활성이 초기에 약 0.5 Unit/g으로 높았고, 4% 된장만이 0.05 Unit/g 이하로 낮아 통계적으로 유의적인 차이를 나타내었지만, 그 이후 점차 감소하여 염도 간에 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 이는 저염 된장이 숙성기간 중 α-amylase 효소활성이 초기와 비슷한 수준을 유지하였다는 보고와는 상이하였다(28).

protease 효소 활성은 장 담금 초기에 고염 된장(15와 20%)은 약 50 Unit/g의 낮은 활성을 나타낸 반면 저염 된장(4와 8%)에서는 약 200 Unit/g로 통계적 유의적인 차이로 높은 활성을 보였는데 발효 9개월째에는 그 활성이 감소하여 농도 간 차이를 보이지 않았다. 이는 Mok 등(28)이 저염된장 숙성 중 단백질분해효소의 활성이 염농도가 낮을수록 높은 값을 보였다는 보고와 유사하였다. 앞에서 언급한 바와 같이 단백질 분해효소는 저염 환경에서 높은 활성을 나타내는 것으로 생각되어 진다.

된장은 발효하는 동안 미생물 생육으로 인해 생성된 효소작용으로 맛과 향에 관련된 성분들이 생성되어 품질에 영향을 준다. 이에 염도를 달리하여 제조한 된장을 장기간 발효시키면서 미생물 변화를 살펴보았고 그 결과는 Table 2에 제시하였다.

총균수 변화는 모든 그룹에서 발효초기부터 3개월까지는 8.0~8.6 log CFU/g 범위로 큰 편차를 보이지 않았지만, 발효 5개월째는 저염 된장(4, 8%)이 8.9~9.0 log CFU/g로 고염 된장(15, 20%)이 8.6 log CFU/g에 비해 총균수가 다소 높은 값을 나타내었지만 통계적 유의성은 없었다. Kim (29) 역시 6과 10%로 염농도를 달리하여 제조한 된장을 16주 동안 발효시켰을 때 호기성 세균이 10⁸~10⁹ FU/g 수준으로 큰 변화가 없었다고 보고하였다.

유산균은 증식하면서 생산한 유기산과 박테리오신과 같은 물질에 의해 오염균 증식을 방지하는 반면 과잉 생산된 젖산에 의한 산도 증가로 된장에 강한 신맛을 부여하여 기호도에 영향을 준다. Table 2에 나타낸 바와 같이 유산균 수는 된장 담금 직후부터 급격하게 감소하였는데, 발효 2개월째에 저염된장(4, 8%)은 1.5~2.7 log CFU/g의 유산균수를 나타낸 반면 고염된장(15, 20%)에서는 불검출 되어 큰 미생물 변화를 보여주었다. 그러나 4% 된장에서는 장기 숙성기간 동안 꾸준한 생육을 나타내었지만, 나머지 된장과 마찬가지로 급격히 감소하여 발효 9개월째는 불검출 되었다. 비록 42일의 짧은 발효기간 동안이지만 Lee 등(26)의 보고와 유사하게 발효초기에 비해 발효가 진행되면서 꾸준히 유산균수가 감소하는 경향을 보여 유산균 생육이 된장 발효를 마친 후 맛에 어떤 영향을 주었을지 살펴볼 필요가 있다고 판단된다.

염 농도를 각각 4, 8, 15, 20%로 맞춰 제조한 된장의 장기발효에 따른 맛의 변화를 맛 센서 분석기로 측정하였고, 그 결과를 Fig. 5에 나타내었다. 발효초기에는 시료 간 뚜렷한 맛의 차이를 보이지 않았지만, 발효 중기에는 신맛과 감칠맛에서 시료 간 차이를 나타내었는데, 신맛의 경우 4와 8% 저염된장은 -11.31~-11.35이었고, 15와 20% 고염 된장은 -7.12~-7.45로 저염 된장이 조금 더 약한 신맛을 나타내었다. 이와 반대로 쓴맛(bitterness)은 저염 된장이 5.28~6.24이었고, 고염 된장이 4.28~5.06으로 염도가 낮을수록 쓴맛이 높아지는 결과를 나타내었다. 발효 12개월째에는 신맛의 경우 4% 된장이 -27.64로 가장 낮았고, 20% 된장이 -7.40으로 가장 높아 신맛의 생성에 있어 염도가 깊이 관련됨을 알 수 있었다. 쓴맛과 떫은맛에서는 4% 된장이 각각 13.32와 2.01로 가장 높았고, 8% 된장 시료가 각각 4.35과 0.62로 유의적인 차이로 가장 낮았으며, 감칠맛은 저염 된장이 11.17~13.12이었고, 고염 된장이 2.09~2.71으로 염도가 낮을수록 감칠맛이 높아지는 결과를 보였다. Park 등(30)이 소금농도가 김치의 맛에 미치는 영향을 보고한 바에 따르면 염농도가 낮을수록 신맛과 감칠맛이 높아졌다고 언급하였는데, 감칠맛의 경우에만 된장에서도 동일한 값을 나타내었다.

Fig. 5. Taste intensities of the fermented Doenjang compared with a tasteless mater ial such as deionized water. A taste intensity more than tasteless (dotted line) are perceptible. (A), Doenjang fermented for 0 month; (B), Doenjang fermented for 5 months; (C), Doenjang fermented for 12 months.

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종합적으로 본 연구에서는 다양한 염도로 제조한 된장이 장기 발효 시 나타나는 품질변화를 살펴본 결과, 된장 품질에 영향을 끼치지 않는 범위 내에서 첨가 가능한 최소 식염의 양은 8% 정도임을 알 수 있었다.