갈색계 천연색소 추출물의 항산화 특성

본 실험에 사용된 시료(한련초, 상황, 아선약, 자단향, 유백피, 종대황, 가자)는 2014년 3월에 경북 영천시에서 구입하여 사용하였으며, 시료의 학명, 일반명 및 사용된 부위에 대해서는 Table. 1에 나타내었다. 열수추출물과 플 로럴워터 2종류의 시료를 준비하기 위하여 증류장치를 변 형하여(Clevenger type apparatus) 건조된 시료 20g에 2L의 증류수를 넣고 3시간 동안 추출하였으며 이때 발생되는 증기를 플로럴워터 원액 시료로 사용하였으며 남아 있는 추출액을 다시금 2 L로 부피를 맞춘 후 Whatman No. 2 여과지로 여과하여 고형분을 제거하고 동결 건조하여 사용 하였다. 실험에 사용된 용매 및 시약은 Dukan(GR grade), sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

추출된 시료의 총 폴리페놀 함량을 평가하기 위해 Folin-Ciocalteu법(9)을 이용하였다. 즉 시료 100 μL와 Folin- Ciocalteu 시약 50 μL, 20% Na2CO3 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 보관한 후, 분광광도계(UV-1800 Shimadzu, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 표준 검량선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 시료 1 mg 중의 mg gallic acid로 계산하 였다. Gallic acid의 농도는 10~500 mg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 765 nm에서 흡광도를 평가하여 작성하였다.

Brand-Williams 등의 방법(10)에 따라 DPPH(2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 6×10-5 M DPPH를 methanol에 녹인 후, DPPH 라디칼 용액 900 μL와 시료 100 μL를 혼합한 후 5분간 반응시킨 후 분광광도 계(UV-1800 Shimadzu, Japan)를 사용하여 517 nm에서 흡광 도를 평가하였다. DPPH 라디칼의 소거능은 아무 것도 첨가 하지 않은 대조군과 시료 첨가 후 흡광도의 변화로 하여 다음 식으로 계산하였다.

시료의 농도별 DPPH 라디칼 소거능(전자공여능, %)을 도식화하여 전자공여능 50%일 때의 시료 농도를 50% inhibition concentration(IC50)로 나타내었다.

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 라디칼 소거활성을 이용한 항산화 력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(11)에 의하 여 측정하였는데, 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate를 섞어 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시켜 냉장 보관하였으며, radical stock solution은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되도록 에탄올로 희석하였다. 이 용액 0.9 mL에 농도별로 제조한 각 시료용액 0.1 mL를 가한 후 실온에서 7분간 반응시킨 후, 반응액의 흡광도 변화를 734 nm에서 측정하였다. ABTS radical cation decolorization 정도는 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Rose bengal(RB)의 광증감 반응에 의해 생성된 단일항산 소를 측정하기 위하여 imidazole-RNO bleaching 방법(12)을 이용하였다. 단일항산소 분석은 2 μM rose bengal, 5 mM imidazole 그리고 4 μM RNO를 녹인 20 mM Tris-succinate buffer(pH 6.5) 반응액이 빛에 노출되기 전후 흡광도 변화를 440 nm에서 측정하여 나타내었다. 시료는 150 W halogen-lamp(Osram, Augsburg, Germany)로부터 백색광( λ>400 nm, 100 W·m-2)에 4분간 노출되어졌으며, 모든 분석 은 25℃에서 이루어졌다. 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 각 군간의 차이는 Student’s t-test를 사용하여 평가하였으며, p<0.05 수준일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

본 실험에서 분석된 폴리페놀성 화합물 함량(total phenolic contents, TPC) 분석 결과는 Table. 2에 나타난 바와 같다. 각 시료로부터 얻어진 열수 추출물의 TPC는 0.015~ 0.142 mg GA/mg extract의 범위를 나타내었는데 그중 아선 약, 자단향, 가자 추출물이 월등히 높은 수준으로 분석되었 다. 일반적으로 페놀성 화합물은 자연계에 널리 분포하는 2차 대사산물로서 대부분 그 함량은 항산화력과 정의 상관 관계를 나타내며(13), 본 실험 결과 천연색소 추출물에 따른 총 페놀 함량이 아선약, 가자, 자단향, 유백피, 종대황, 상황, 한련초의 순으로 분석되었다.

DPPH는 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있 는 물질로 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화 합물 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연 소재로부터 항산화물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(14). 천연색소로부터 얻어진 열수추출물과 플로럴워터의 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 1과 같은데, 색소 시료의 열수추출물 0.1 mg/mL 농도에서 DPPH 라디칼 을 아스코빅산 97.1%, 자단향 97.3%, 아선약 96.7%, 종대황 54.9%, 상황 54.4%, 가자 47.7%, 유백피 40.5%, 한련초 추출 물이 20.8%를 소거하는 것으로 나타났으며, 반응 시약에 10%의 플로러워터(0.1 mL)를 처리했을 때 DPPH 소거 활성 은 열수추출물에 비해 효과적이지 못한 결과를 보였다. 비 교 물질로 사용된 ascorbic acid 0.1 mg/mL 처리 시와 비교해 볼 때 아선약과 자단향 열수 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 력은상당히높은수준의항산화력을가지는것을확인하였다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of water extract (dark gray bars) and floral water (open bars) of brownish natural pigment. The data are expressed as mean±SD of triplicate experiments. AA, ascorbic acid; A, Eclipta prostrata L.; B, Phellinus linteus.; C, Uncaria gambir Roxburgh; D, Terminalia chebula Retzius; E, Ulmus macrocarpa Hance; F, Rheum officinale Baillon; G, Pterocarpus santalinus L.

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ABTS와 potassium persulfate를 암소에 방치하면 ABTS 라디칼이 생성되는데 추출물의 항산화력에 의해 ABTS 라 디칼이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색된다. 이와 같이 ABTS 라디칼 탈색반응은 이미 생성된 자유라디 칼의 제거 정도를 흡광도로 나타내어 ABTS 라디칼의 소거 활성능을 측정하는 방법으로 ABTS 라디칼 탈색반응이 1분 안에 종료되므로 단시간 측정할 수 있고, 소수성과 친수성 모두에 적용 가능하다(15). 갈색계 천연색소 열수 추출물 및 플로럴워터의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 나와 있는바와 같이, 열수추출물(0.1 mg/mL) 처리 시의 ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 소거능에서의 결과와 동일하게 아선약, 자단향 및 종대종에서 가장 우수한 활성 을 나타내는 것으로 확인이 되었고, 10% 플로랄워터(0.1 mL) 처리시의 ABTS 라디칼 소거능은 한련초에서 가장 우수한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 DPPH 라디칼 저해 활성이 ABTS 라디칼 저해 활성보다 높게 나온 경향을 볼 수 있는데 이는 ABTS 라디칼이 DPPH 라디칼 보다 좀 더 강력한 산화물질이기 때문인 것으로 사료된다 (16).

Fig. 2. The ABTS cation radical scavenging activity of water extract (dark gray bars) and floral water (open bars) of brownish natural pigment. The data are expressed as mean±SD of triplicate experiments. AA, ascorbic acid; A, Eclipta prostrata L.; B, Phellinus linteus.; C, Uncaria gambir Roxburgh; D, Terminalia chebula Retzius; E, Ulmus macrocarpa Hance; F, Rheum officinale Baillon; G, Pterocarpus santalinus L.

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다양한 천연색소 열수추출물에 대한 단일항산소 억제 효과를검증하기위하여광증감반응(Type-II photosensitization) 에 의해 발생되는 활성산소(1O2)의 억제 효과를 분석하였 다. 0.2 mg/mL 시료 처리에 따른 단일항산소 억제 효과는 Fig. 3에 나타내었는데, 단일항산소 억제 효과는 아선약, 상황 및 자단향에서 유의성을 보였으며 이러한 결과는 앞서 기술한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능의 결과 유사하게 나타났다. 반면 플로랄워터의 단일항산소 소거능은 아주 낮은 수준으로 분석되었다.

Fig. 3. Singlet oxygen quenching capacity of water extract of various brownish natural dyeing agents. The data are expressed as mean±SD of triplicate experiments. AA, ascorbic acid; A, Eclipta prostrata L.; B, Phellinus linteus.; C, Uncaria gambir Roxburgh; D, Terminalia chebula Retzius; E, Ulmus macrocarpa Hance; F, Rheum officinale Baillon; G, Pterocarpus santalinus L.

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결론적으로, Table 3에서 전자공여능 50%일 때의 처리시 료 농도를 50% 억제 농도값(50% inhibition concentration, IC50)으로 하여 7종의 천연색소 추출물에 대한 비교를 나타 내었다. 3가지 방법에 의해 얻어진 결과 동일하게 catechin 성분을 함유한 아선약 추출물과 santalin 성분을 함유한 자 단향의 천연색소 추출물에서 우수한 항산화 활성을 보이는 것으로 확인되었으며 이들은 Ascorbic acid의 DPPH 라디칼 소거능 IC50(9.5 μg/mL)와 비교해 볼 때 매우 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 뿐만 아니라 빛에 의해 야기되는 단일 항산소 소거능 결과로 보아 광에 노출되었을 때 일어날 수 있는 생체기관의 광피해로부터 생명체를 보호하는 중요 한 반응을 할 것이라고 판단한다(17). 향후 식품 및 향장산업 소재화를 위해서는 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 필요하다.