혈관내피세포에서 TNF-α 자극에 의해 유도되는 혈관염증에 대한 전통식품 품질인증 된장의 효능 평가

전통식품 품질인증 된장시료 중 1년 이상 장기간 숙성 Deonjang(DJ#3, DJ#13) 시료 10 g에 증류수 100 mL을 가하 여 80℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 교반시켜 3회 추출하 였으며 4℃에서 800 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 분리 된 상등액을 Whatman No.1 filter paper로 여과한 후 여액을 수거하여 동결건조 시킨 뒤 시료로 사용하였다.

인간 혈관내피세포(Human umbilical vascular vein endothelial cells, HUVECs)는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양하여 사용 하였다. 혈관내피세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% antibiotic-antimycotic(GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.1 mg/mL heparin(Sigma, St. Louis, MO, USA), 0.03 mg/mL endothelial cell growth supplement(ECGS, ATCC, Manassas, VA, USA) 함유한 F-12K 배지에서 5% CO2 배양 기로 37℃ 조건에서 배양하였다. 배양액은 3~4일 간격으로 갈아주었으며, 세포 배양접시에 cell density가 80~90% 정도 자라게 되면 0.25% trypsin-EDTA(0.53 mM EDTA)(Gibco, USA)를 처리하여 계대배양 하였다.

세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5- diphenyldiphenyl- tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다(29). 혈관내피세포를 1×106 cells/well 로 96-well plates에 분주한 후 48시간 배양한 다음, DJ#3과 DJ#13 추출물을 10, 20, 50, 100 μg/mL을 처리한 후 24시간 동안 5% CO2배양기 내에서 배양하여 MTT를 환원시켜 생 성된 formazan crystal이 배지에 떨어져나 가지 않도록 배지 를 조심스럽게 제거하였다. dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 200 μL 분주하여 20분 동안 혼합한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

혈관내피세포를 1×106 cells/well로 24-well plate에 분주 하여 48시간 배양한 다음, DJ#3과 DJ#13 추출물을 10, 20, 50, 100 μg/mL을 농도로 처리하여 4시간 배양한 후, tumer necrosis factor(TNF)-α(20 ng/mL) 를 각각 주입한 다음 혈관 내피세포를 18시간 배양하였다. 100 uL의 배지 상층액에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylene diamine dihydrochloride in 2.5% phosphoric acid solution)를 50 μL 주입한 후 10분간 상온에서 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 NaNO2 를 농도별로 조제하여 사용하였다(30).

세포 배양액 내의 CAMs(VCAM-1, ICAM-1)양을 측정하 기 위해 ELISA를 수행하였다. 혈관내피세포를 1×106 cells/well로 24-well plate에 분주한 세로를 48시간 후에 DJ#3과 DJ#13 추출물을 농도별로 처리하고 4시간 후 20 ng/ml의 TNF-α를 처리하였다. 18시간 후 세포 배양 액을 CAMs(VCAM-1, ICAM-1 Human ELISA kit)(abcam, UK.) 측정에 이용하였다. 배양액을 적절한 농도로 희석한 후, CAMs로 coating된 96-well plate 에 50 μL씩 첨가하여 상온 에 2시간 반응시켰다. Washing buffer로 3회 세척하고 100 μL의 biotinylated antibody reagent를 각각의 well에 처리하 여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 3회 세척한 다음, 100 μL의 streptavidine-HRP solution을 처리하여 1시간 동안 상 온에서 반응시킨 후 다시 washing buffer로 3회 세척하였다. 여기에 di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxy benzalmalonate(TMB) substrate를 100 μL씩 처리하여 5~30분간 반응시킨 후 100 μL의 stop solution을 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

Total RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA,USA)를 사용하여 수행하였고, total RNA에서 cDNA를 합성은 oligo dT primer와 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT, USA)를 사용하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 VCAM-1, ICAM-1, eNOS, iNOS and COX-2의 유전자를 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 internal control로 사용하였 다. 각 PCR 산물들을 1% agarose gel을 이용하여 전기영동 하고 safe-pinky DNA Gel staining solution을 이용하여 염색 한 후 UV 하에서 확인하였다. 측정하고자 하는 mRNA는 GAPDH로 수치를 정량화 하였고 Image Lab statistical software(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 계산하였다. 각각 mRNA primer는 Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에서 제작하 였으며 다음과 같다.

GAPDH, sense 5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTT G-3' anti-sense 5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'; COX-2, sense 5'-CTTGGGTGTCAAAGGTAA-3'anti-sense 5'-AGGGACTTGAGGAGGGTA-3'; iNOS, sense 5'-TCTTGG TCAAAGCTGTGCTC-3' anti-sense 5'-CATTGCCAAACG TACTGGTC-3'; eNOS, sense 5'-GTGTTTGGCCGAGTCCTCACC-3' anti-sense5'-CTCCTGCAAGGAAAAGCTCTG-3'; VCAM-1, sense 5'-AAGATGGTCGTGATCCTTGG-3', anti-sense 5'-GGTGCTGCAAGTCAATGAGA-3'; ICAM-1, sense 5'-GGCTGGAGCTGTTTGAGAAC-3', anti-sense 5'-CTGACAAGTTGTGGGGGAGT-3'.

혈관내피세포를 100 mm dish에 3×105 cells/well농도로 24시간 배양한 후 DJ#3 추출물을 농도별로 처리하고, 4시간 후 20 ng/mL의 TNF-α를 첨가하였다. 18시간 배양 후 DPBS 로 3회 세척한 후 세포를 얻어 원심 분리하여 pellet에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 13,000×g 에서 10분간 원심 분리 하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 Bradford (Bio-Rad, USA)를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDS polyacrylamide gel에서 영동하고 Nitrocellulose membrane (NC membrane)으로 전사하였다(31). 전사된 NC membrane 을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer(0.1% Tween 20 in Tris-buggered saline) 에서 blocking한 후 1차 antibody(ICAM-1, VCAM-1, pp38, p-ERK, β-actin)를 1:200~1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 다시 2차 antibody(Anti-mouse IgG, Anti-rabbit IgG)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응한 다음, ECL solution을 반응시켜 단백질 발현 정도를 Chemidoc image analyzer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정 후 정량하였다.

본 실험의 결과는 3회 반복 실험을 실시한 뒤 mean± SEM으로 나타내었으며, 각 군 간의 유의성의 검증은 SPSS 17.0 version(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 Student t-test및 ANOVA 법으로 검증하여 p값이 0.05 미만 을 유의한 것으로 간주하였다.

MTT assay를 이용하여 혈관내피 세포에서 DJ#3과 DJ#13 추출물의 세포독성을 확인하였다. 그 결과 control군 과 비교해 DJ#3과 DJ#13 추출물을 농도별(10, 20, 50, 100 μg/mL)로 처리한 군 모두 90% 이상 생존율을 보여 혈관내 피세포에서 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(Fig. 1). 본 실험에서는 DJ#3과 DJ#13 추출물의 농도가 세포독성 에 영향을 미치지 않는다고 사료되어, DJ#3과 DJ#13 추출 물 20, 50, 100 μg/mL의 농도로 추출물을 실험에 이용하였다.

Fig. 1. Effect of doenjang extracts (DJ) #3 and #13 on cell viability in human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). Cells (1×10⁶) in 96-well plates were incubated with and without indicated various concentrations (10, 20, 50, 100 μg/mL) of DJ#3 (white) and DJ#13 (black) extracts for 24 hr. Cell viability was estimated by the MTT assay. Values are expressed as the mean±SD (n=3). *p<0.05, versus a media alone-treated group.

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NO는 NO 합성효소에 의해 L-arginine으로부터 생성되 는 무기 유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관 이완 등 여러 생물학적인 과정에 관여하며 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용하기도 하고 세포독성을 일으 키기도 한다(32). TNF-α(20 ng/mL)로 산화적 스트레스를 유발시킨 혈관내피세포에서 된장 추출물의 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 알아보았다. 실험결과 control군에 비하여 TNF-α를 처리한 군에서 NO생성이 현저히 감소하 였음을 확인하였고, DJ#3과 DJ#13(20, 50, 100 μg/mL)을 처리했을 때 NO의 생성이 TNF-α 처리군에 비해 증가하는 경향을 확인하였다(Fig. 2). 내피세포에서 소량 생성된 NO 는 혈관확장과 혈소판의 응집을 방해하여 혈류의 흐름을 원활하게 하는데, 된장추출물을 처리했을 때 증가한 NO도 인체를 순환기 질환으로부터 보호해 줄 것으로 기대된다.

Fig. 2. Effect of DJ#3 and DJ#13 extracts on tumor necrosis factor (TNF)-α-induced NO production in human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). Cells were plated in 24-well plates at 1×10⁶ cells/well. After 48 hr, cells were treated with various concentrations (20, 50, 100 μg/mL) of DJ#3 (white) and DJ#13 (black) in the absence or presence of 20 ng/mL TNF-α. The media were conditioned and collected at 18 hr after DJ#3 and DJ#13 treatment. NO in the conditioned media were measured using the NO Griess reagent system. Values are expressed as the mean±SD (n=3). *p<0.05, versus a media alone-treated group.

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DJ#3과 DJ#13 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 동맥경화의 초기현상을 나타내는 세포부착분자(CAMs) 생 성에 미치는 영향을 알아보고자 TNF-α로 자극한 혈관내피 세포에서 DJ#3과 DJ#13 추출물을 농도별로 18시간 처리한 후 ICAM-1과 VCAM-1의 발현을 ELISA를 측정하였다. 그 결과, Control군에 비하여 TNF-α 20 ng/mL 농도로 자극한 혈관내피세포의 CAMs 생성량이 증가함을 확인하였고, TNF-α 자극으로 증가된 VCAM-1의 생성량은 DJ#3과 DJ#13 추출물을 처리했을 때 유의성 있게 감소하였고, TNF-α 자극으로 증가된 ICAM-1의 생성량은 DJ#3 추출물 을 100 μg/mL 농도로 처리했을 때 유의성 있는 감소를 보였 다(Fig. 3). 이것으로 보아, DJ#3 추출물은 동맥경화를 유발 시키는 인자인 VCAM-1과 ICAM-1의 생성을 효과적으로 감소시켜 동맥경화를 예방할 수 있는 것으로 사료된다.

Fig. 3. Effect of DJ#3 and DJ#13 extracts on tumor necrosis factor (TNF)-α-induced CAMs production in human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). HUVEC cells were plated in 24-well plates at 1×10⁶ cells/well. After 48 hr, cells were treated with various concentrations (20, 50, 100 μg/mL) of DJ#3 (A) and DJ#13 (B) in the absence or presence of 20 ng/mL TNF-α. The media were conditioned and collected at 18 hr after DJ#3 and DJ#13 treatment. VCAM-1 and ICAM-1 in the conditioned media were measured using the VCAM-1, ICAM-1 Human ELISA kit. Values are expressed as the mean±SD (n=3). *p<0.05 VS. control, #p<0.05 VS. TNF-α.

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TNF-α로 자극한 혈관내피세포에서 DJ#3 추출물이 혈관 이완과 혈소판응집, 심혈관 항상성의 메카니즘 조절과 관 련 있는 NO생성효소인 eNOS의 mRNA gene 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 혈관내피세포만 배양 한 control군에 비하여 TNF-α 20 ng/mL 농도로 자극한 혈관 내피세포는 eNOS 발현이 감소하였으며, DJ#3 추출물 처리 했을 때 농도 의존적이진 않았지만, 모든 농도에서 TNF-α 처리한 군과 비교해 eNOS 발현이 증가하였다(Fig. 4). 증가 된 eNOS에 의해 생성된 NO는 관상동맥을 포함하는 모든 종류의 혈관을 확장시키며 혈소판의 응고나 백혈구의 부 착, 평활근의 증식, 동맥경화를 막는 효과를 가진다(33). 위 결과로 DJ#3 추출물에 의한 eNOS 생성은 혈관확장에 기여하며 혈압을 낮추는 효과가 있음을 보여주는 것으로 사료된다.

Fig. 4. Effects of DJ#3 on eNOS, iNOS and COX-2 mRNA gene expression in tumor necrosis factor (TNF)-α-stimulated human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). Cells (3×10⁵ cells) in 100 mm dishes were preincubated with and without the indicated concentrations (20, 50, 100 μg/mL) of DJ#3 for 4 hr and then incubated with TNF-α (20 ng/mL) for 18 hr. Untreated represents the negative control without TNF-α treatment. Levels of mRNA expression were determined by RT-PCR analysis. GAPDH was used as an internal control. The data are expressed as fold basal value and are the mean±SD (n=3). *p<0.05 VS. control, #p<0.05 VS. TNF-α.

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활성산소의 일종으로 염증유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로 서, NOS(nitric oxide synthase)에 의해 L-arginine으로 생성 되는데 특히 iNOS(inducible NOS)가 염증반응에 관여한다 (34). iNOS는 세포내 존재하지 않으나 일단 자극에 의해 유도가 되면 NO를 생성하며 생성된 NO는 혈관확장, 세포 독성, 조직손상과 같은 작용을 하며 염증을 심화시키는 것 으로 알려져 있다(35). COX-2는 cytokine, 자외선, 세균성 내독소 및 TNF 등과 같은 여러 종류의 pro-inflammatory agent에 의하여 과발현되어 염증뿐만 아니라 각종 퇴행성 질환의 발병과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(36). TNF-α에 의해 자극된 혈관내피세포부터 DJ#3 추출물의 iNOS, COX-2 mRNA 발현에 대한 억제효과를 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 혈관내피 세포만 배양한 control군에 비하여 TNF-α 20 ng/mL의 농도 로 처리한 경우 iNOS와 COX-2의 발현이 현저히 증가하였 다. DJ#3 추출물을 처리했을 때, TNF-α 자극으로 증가된 iNOS의 발현은 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 경우 유의 성 있게 감소하였고, 증가된 COX-2의 발현은 TNF-α를 처 리한 군에 비하여 발현이 억제되었다(Fig. 4). Yoon 등(37) 은 큰비쑥(Artemisia fukudo) 추출물이 iNOS, COX-2 단백질 발현을 효과적으로 저해하여 항염증 효과가 있다고 보고하 였으며, 이는 DJ#3 추출물의 염증 억제 기전과 유사한 경향 을 나타내었다.

CAMs ELISA 결과를 바탕으로 TNF-α로 자극한 혈관내 피세포에서 DJ#3 추출물이 세포부착분자(VCAM-1과 ICAM-1)의 mRNA 유전자 발현 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 측정하였다. 그 결과, TNF-α 처리에 의해 증가된 VCAM-1과 ICAM-1의 mRNA 유전자 발현이 DJ#3 추출물 에 의해 감소함을 보였다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects of DJ#3 on VCAM-1 and ICAM-1 mRNA gene expression in tumor necrosis factor (TNF)-α-stimulated human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). Cells (3×10⁵ cells) in 100 mm dishes were preincubated with and without the indicated concentrations (20, 50, 100 μg/mL) of DJ#3 for 4 hr and then incubated with TNF-α (20 ng/mL) for 18 hr. Untreated represents the negative control without TNF-α treatment. Levels of mRNA gene expression were determined by RT-PCR analysis. GAPDH was used as an internal control. The data are expressed as fold basal value and are the mean±SD (n=3). *p<0.05 VS. control, #p<0.05 VS. TNF-α.

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Western blot을 측정하여, TNF-α로 자극한 혈관내피세포 에서 DJ#3 추출물이 세포부착분자(VCAM-1과 ICAM-1)의 단백질 발현 억제효과를 조사하였다. 그 결과, control군이 비하여 TNF-α에 의해 VCAM-1과 ICAM-1 단백질 발현이 유의하게 증가하였으나, DJ#3 추출물을 처리했을 때 유의 한 차이는 없었지만 ICAM-1 발현은 농도 의존적으로 감소 함을 보였고, VCAM-1 발현은 50, 100 μg/mL의 농도로 처리 한 경우에 TNF-α를 처리군에 비하여 유의성 있게 억제효과 를 보였다(Fig. 6). 동맥경화증에서 VCAM-1 및 ICAM-1의 발현 증가와 이에 따른 세포 간 접착의 유발로 혈관협착 및 혈전형성이 가속화된다는 사실이 국내외 많은 연구에서 입증되었고(38,39,40), 또한 콩의 성분인 genistein은 VCAM-1, ICAM-1의 분비를 저해함으로써 단핵구가 동맥벽으로 침 투를 저해하는 잠재성을 가진다고 보고하고 있다(41). 위의 결과로 보아 DJ#3 추출물이 세포부착분자의 발현을 억제하 는 것으로 보아 동맥경화 초기 발생과정을 효과적으로 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 6. Effects of DJ#3 on VCAM-1 and ICAM-1 protein expression in tumor necrosis factor (TNF)-α-stimulated human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). Cells (3×10⁵ cells) in 100 mm dishes were preincubated with and without the indicated concentrations (20, 50, 100 μg/mL) of DJ#3 for 4 hr and then incubated with TNF-α (20 ng/mL) for 18 hr. Untreated represents the negative control without TNF-α treatment. Levels of protein expression were determined by western blot analysis. β-actin was used as an internal control. The data are expressed as fold basal value and are the mean±SD (n=3). *p<0.05 VS. control, #p<0.05 VS. TNF-α.

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