Korean Journal of Food Preservation
The Korean Society of Food Preservation
ARTICLE

3T3-L1 세포분화 중 지방축적 및 ROS 생성에 대한 연화 열수 및 에탄올 추출물의 효과

오지원1, 이진하1, 이옥환1, 김계훈2, 김혜란2, 이효구2,*
Ji-Won Oh1, Jin-Ha Lee1, Ok-Hwan Lee1, Kye-Hoon Kim2, Hey-Ran Kim2, Hyo-Ku Lee2,*
1강원대학교 식품생명공학과
2공주대학교 식품공학과
1Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
2Department of Food Science and Technology, Kongju National University, Gongju 32588, Korea
*Corresponding author : hhklee@kongju.ac.krPhone:82-41-330-1482, Fax:82-41-330-1489

© The Korean Society of Food Preservation . This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Received: Sep 8, 2015; Revised: Sep 24, 2015; Accepted: Sep 25, 2015

Abstract

The present study was designed to investigate the effects of hot water and ethanol extracts of Nelumbo nucifera Gaertner flower on lipid accumulation and reactive oxygen species (ROS) production during adipogenesis in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 preadipocytes were treated with both hot water and ethanol extracts for up to 8 days following standard induction of differentiation. Regarding anti-adipogenic activity, compared with the control, the hot water and ethanol extracts significantly inhibited lipid accumulation (37.4 and 66.6%, respectively) and ROS production (46.4 and 46.8%, respectively) during adipogenesis in 3T3-L1 cells. Treatment with hot water and ethanol extracts significantly inhibited mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) and CCAAT/ enhancer-binding protein alpha (C/EBPα), thereby reducing the mRNA expression of adipocyte-specific fatty acid binding protein (aP2). Moreover, both the extracts significantly inhibited mRNA expression of NADPH oxidase (NOX4). Overall, our research suggests that N. nucifera Gaertner flower extracts might be a valuable source of bioactive compounds that exhibit anti-adipogenic activity and could have applications in the field of medicine and food industry.

Keywords: Nelumbo nucifera Gaertner; extracts; 3T3-L1 cell; lipid accumulation; reactive oxygen species

서 론

연화(lotus flower)는 연꽃(Nelumbo nucifera Gaertner)의 꽃봉우리로서 수련과의 여러살이해 수상식물이며 East Indian lotus 및 Chinese water lily라고도 불리운다(1). 연꽃 의 씨앗은 연자육(Nelumbinis Semen)이라하며, 연꽃의 뿌리 는 연근(lotus root, Nelumbinis Rhizoma)으로 식품원재료 데이터베이스에 식품원료로 사용가능하다고 분류되어 있 으며, 연잎, 연화 등도 건강식품의 원료로 사용되고 있다 (1,2). 최근에 보고된 연꽃에 관한 연구로 연화 및 연화주의 영양성분 및 항산화활성(3), 국내 재배 연근과 연자육의 항비만과 항산화 효과(4), 6가 크롬으로 유도된 세포독성에 대한 연꽃 추출물의 보호효과(5), 과산화수소로 손상된 배 양 인체피부흑색종세포에 대한 연꽃수술추출물의 항산화 효과 및 멜라닌화 방어효과(2), 활성산소종인 glucose oxidase로 손상된 배양 C6 Glioma 세포에 미치는 항산화효 과(6), tyrosinase 활성억제 및 멜라닌 생성억제에 의한 미백 효과(1), UVB 자외선 조사에 의한 각질형성세포의 보호 및 피부 노화방지(7) 등이 보고되었다. 연꽃에 함유된 주요 flavonoid 성분으로는 quercetin, luteolin, isoquercitrin, luteolin glucoside, kaepferol-3-diglucoside등이 알려져 있다 (8-10).

서구화된 식습관과 생활습관의 변화로 에너지 불균형에 의한 체내 중성지방의 축적은 비만(obesity)을 야기하며 비 만으로 인한 인슐린 저항성, 이상지혈증 등의 만성질환의 유발은 급속하게 증가되고 있다(11,12). 체내 지방의 축적 은 조직내 지방세포(adipocytes)의 비대(hypertrophy)와 과 형성(hyperplasia)으로 진행되며 분화된 세포 내의 활성화 된 지방질 생합성(lipogenesis) 작용에 의하여 생성된 지방 구 축적에 의하여 유도된다. 또한, 지방세포 과형성은 전지 방세포(preadipocytes)의 활발한 증식과 활성화된 지방세포 분화 과정으로 인하여 유도되기 때문에 지방세포의 분화 (adipogenesis)는 지방세포의 과형성 뿐만 아니라 hypertrophy capacity 결정에 중요한 요소로서 adipogenesis를 억제하는 것은 비만에 있어서 효율적인 타깃으로 연구되고 있다 (13-17). 지방세포 분화과정에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과도한 생성은 세포내 산화적 스트레스를 유발하게 되며 이로 인하여 단백질 변성, 지질과산화물 생 성, DNA 변이를 일으켜 노화와 암을 유발시키는 주요원인 이 되기도 한다(18,19).

최근 천연물을 이용한 지방세포 분화억제 및 ROS 저감 에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는 시점에서, 연화에 대한 연구는 초기단계에 머물러 있다. 따라서 본 연구는 3T3-L1 전지방세포의 세포분화 과정에서 지방축적 및 ROS 생성에 미치는 연화 열수 및 에탄올 추출물의 효과를 관찰 하고자 하였다. 연화 추출물에 의한 지방세포 분화단계에 서의 주요 전사인자(adipogenic transcription factors), NADPH 산화효소 4(NAPDH oxidase 4, ROS 생성 유전자) 및 catalase(항산화효소)들의 발현 정도를 조사하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 연화는 2014년에 수확한 것으로 경북 칠곡의 영농조합법인 석전상온전통주가에서 제공받아 사 용하였다. 전지방세포(3T3-L1) 배양 및 분화에 사용된 시약 으로 penicillin-streptomycin(P/S), insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), nitroblue tetrazolium (NBT), Oil Red O(ORO), isopropyl alcohol, N-Acetyl-Lcysteine( NAC)은 Sigma(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), bovine serum(BS), phosphate-buffered saline(PBS) 및 trypsin-EDTA 등은 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용 하였다.

열수 및 에탄올 추출물의 제조

연화 열수 및 에탄올 추출물을 제조하여 지방세포 분화 억제 효능평가를 실시하였다. 세척하여 이물을 제거한 연 화를 동결건조(FD5508, Ilshinbiobase Co., Ltd., Gyeonggi, Korea) 한 후, 조분쇄하여 20~30 mesh로 분말화 하였다. 분말화된 연화 50 g에 약 20배의 증류수 및 80% 에탄올을 각각 첨가하고 80∼100℃ 수욕 상에서 3시간동안 환류냉각 하면서 3회 반복 추출하였다. 각각의 조추출물은 Whatman filter paper No. 3(Whatman Ltd., Maidstone, Kent, UK)를 이용하여 여과 한 뒤 4℃에서 방냉한 후, 동일 여과지로 재여과하여 50℃에서 감압농축(N-1200A, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan) 한 후 동결건조 하여 연화 열수 추출물 및 80% 에탄올 추출물을 제조하였다.

3T3-L1 세포 배양 및 분화

3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였 다. 3T3-L1 전지방세포는 실험목적에 따라 100Φ, 24-well 및 96-well plate에 각각 1×106 cells/well을 seeding한 후, BS(10%) 및 P/S(1%)를 함유한 고농도 포도당 DMEM(89%) 에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다. 이로부터 2일 후에, 지방세포 분화유도 물질(10 μg/mL insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 FBS(10%) 및 P/S(10%)를 함유한 DMEM 으로 전지방세포를 지방세포로 분화유도 하였다. 지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 시료를 각각 400 μg/mL로 처리하 였고, 양성 대조군(positive control)에는 항산화제인 NAC를 처리하여 비교하였다. 지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 10 μg/mL insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리한 후, 8일 동안 분화시키면서 지방축적량 및 ROS의 생성량을 관찰하 였다.

XTT assay를 이용한 세포독성평가

3T3-L1 세포에 대한 연화 열수 및 에탄올 추출물의 세포 독성평가는 XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium-5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하 여 측정하였다.

Oil red O staining을 이용한 지방축적량 관찰

분화 과정에 따른 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 측정하 고자 각각의 시료를 처리하여 24-well에서 8일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 10% formalin 용액 500 μL를 첨가하여 5분간 실온에서 방치한 뒤 제거하였다. 그 후 동량의 formalin 용액으로 분화된 3T3-L1 세포 1시간 이상 실온에서 방치한 후, formalin을 제거하고 60% isopropyl alcohol 용액 500 μL로 세척하여 세포를 완전히 건조시켰다. 완전히 건조된 세포들은 미리 제조해 둔 Oil red O working solution(Oil red O : DDW = 6 : 4)으로 세포 내 축적된 지방성분들을 충분히 염색 한 후, 증류수를 이용 하여 세포를 3~4회 세척하고 완전히 건조시켰다. 세포 내 축적된 지방 성분과 결합한 Oil red O는 100% isopropyl alcohol을 이용하여 모두 용출 시킨 후, microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

NBT assay를 이용한 ROS 함량 측정

분화과정에 따른 지방세포의 ROS 생성량을 측정하기 위하여 먼저 24-well에 배양 및 분화된 3T3-L1 세포의 배양 액을 제거한 후 멸균된 PBS(pH 7.4)를 이용하여 2회 세척, 0.2% NBT 용액 0.2 mL를 첨가하여 CO2 incubator안에서 90분간 반응시킨 뒤 DMSO와 1 N KOH를 7:3 혼합한 용액 을 이용하여 이들 dark blue formazan을 모두 용출시켜 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하 였다.

지방축적 및 ROS 생성과 연관된 주요 유전자의 발현 조사

지방세포 분화에 영향을 미치는 주요 관련 유전자들의 발현 정도 변화를 검토하기 위하여 지방세포에 존재하는 total RNA를 추출한 후, 역전사중합효소(reverse transcriptase) 를 사용하여 complementary DNA(cDNA)를 만들고 합성된 cDNA와 primer로 RT-PCR을 이용하여 유전자의 발현 정도 를 측정하였다. 실험에 사용한 유전자는 GAPDH(Forward; CAAGGTCATCCATGACAACTTTG, GGCCATCCACAG TCTTCTGG), PPARγ(Forward; CCAGAGTCTGCTGATC TGCG, Reverse; GCCACCTCTTTGCTCTGATC), C/EBPα (Forward; GCAGTGTGCACGTCTATGCT, Reverse; AGCC CACTTCATTTCATTGG), aP2(Forward; GACCTGGAAA CTCGTCTCCA, Reverse; CATGACACATTCCACCACCA), NOX4(Forward; GAAGCCCATTTGAGGAGTCA, Reverse; GGGTCCACAGCAGAAAACTC), catalase(Forward; TCTG CAGATACCTGTGAACTG, Reverse; TAGTCAGGGTGG ACGTCAGTG) 이었다. RT-PCR 산물은 1.5% 한천 (agarose) 겔에서 전기영동 후 자외선투시기를 이용하여 증 폭된 DNA band를 확인하였다. DNA band는 Carestream MI SE(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA) 프로그 램을 이용하여 band intensity로 수치화하여 나타내었다.

통계분석

모든 실험결과는 SAS(9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 통계분석 하였다. 유의성 분석은 ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법 (Duncan's multiple range test)으로 유의성은 p<0.05 수준에 서 검정하였다.

결과 및 고찰

3T3-L1 분화과정 중 연화 추출물들의 지방축적 저감효과

연화 열수 및 에탄올 추출물은 100, 200 및 400 μg/mL의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았으며, 현미경 상에서 의 morphology의 변화도 관찰되지 않았다(Fig. 1). 3T3-L1 세포분화 억제 효과를 확인하기 위하여 중성지방만을 붉은 색으로 염색하는 Oil red O 염색법을 통해 3T3-L1 지방세포 내 생성된 중성지방의 양을 측정한 결과는 Fig. 2(A)와 같다.

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Fig. 1. Effects of hot water and ethanol extracts of Nelumbo nucifera Gaertner flower on cell viability. Cell viability was measured by XTT assay. The exponentially growing cells were plated into 96-well plates at a density of 1×106 cells/well in DMEM/BS medium and incubated for 24 hr prior to treatment at 37℃ in 5% CO2. Cells were divided into a control group and a treatment groups. Each value is the mean±standard deviation (n=6) and is representative of results from at least two different experiments. Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA (p<0.05).
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Fig. 2. Hot water and ethanol extracts of Nelumbo nucifera Gaer tner flower inhibit adipose conversion and ROS production dur ing differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. (A) Oil red O staining and NBT assay at day 8 with or without Nelumbo nucifera Gaertner flower extracts. (B) ROS production during differentiation of 3T3-L1 cells into adipocytes. Each value is the mean±standard deviation (n=6) and is representative of results from at least two different experiments. Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA (p<0.05).
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연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군에비하 여 연화 열수 및 에탄올 추출물을 각각 400μg/mL 처리한 군에서 지방축적량은 유의적으로 감소하는 경향을 보였으 며, 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 지방세포 분화 억제 효능이 높게 나타났다. 이러한 결과는 Kwak 등(3)과 Lee 등(20)의 연구에서 연화 열수 및 에탄올 추출물에 함유 된 총 페놀(69.7∼76.0 mg GAE/g) 및 총 플라보노이드(20.1 ∼21.9 mg QE/g) 화합물이 항산화활성 등의 생리활성을 나타낸다는 실험결과와 유사한 경향을 보였다. 지방세포의 분화 및 지방축적과 연관된 주요 전사인자로 알려진 PPAR γ, C/EBPα 및 aP2의 발현에서도 Fig. 3에서와 같이 연화 열수 및 에탄올 추출물 처리군이 대조군에 비해서 각각 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이들 유전자의 발현은 지방세포의 분화정도를 측정할 수 있는 대표적인 전사인자들로 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 연화 열수 및 에탄올 추출물을 각각 400 μg/mL 처리한 군에서 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 지방조직에서 주로 나타나는 PPAR γ, C/EBPα 및 aP2는 발현이 증가할수록 세포의 전지방세포에서 지 방세포로의 분화를 크게 증가시키는 것으로 알려져 있는데 3T3-L1 세포의 분화시 연화 열수 및 에탄올 추출물의 처리 에 따른 지방생성 억제 효과는 PPAR γ, C/EBPα 및 aP2의 발현과 크게 관련이 있다고 판단되어 진다(21,22). 실험에 사용된 NAC는 대표적인 항산화제로 3T3-L1의 분화과정 중 처리하면 중성지방의 축적을 억제시키고, 또한 지방세 포의 분화를 조절하는 전사인자인 PPAR γ와 C/EBPβ의 발 현을 억제하는 것으로 알려져 있어 양성 대조군으로 사용하 였다(23). 이 결과를 통해 연화 열수 및 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 생성 및 축적 억제효과가 큰 것으로 나타났다.

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Fig. 3. Effects of hot water and ethanol extracts of Nelumbo nucifera Gaer tner flower on mRNA expression of adipogenic transcr iption factors dur ing adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes. Total cellular RNA was extracted and subjected to RT-PCR. PPAR γ (A), C/EBPα (B) and aP2 (C) mRNA levels were quantified and normalized with to GAPDH. Each values are the mean±standard deviation of the samples. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at p<0.05 by one-way ANOVA.
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3T3-L1 분화과정 중 연화 열수 및 에탄올 추출물에 의한 ROS 생성 억제 효과

NBT assay는 NBT 용액이 지방세포 내에 축적된 ROS과 반응하여 dark blue formazan을 생성하게 되며, 이를 용출하 여 세포 내 ROS의 생성량을 알 수 있다. 3T3-L1 전지방세포 에 분화 유도 물질을 처리하여 지방세포로 분화 시킨 뒤 생성된 ROS 생성량을 측정하기 위하여 NBT assay를 이용 하여 측정한 결과는 Fig. 2(B)와 같다. 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 연화 열수 및 에탄올 추출물을 각각 400 μg/mL 처리한 군에서 ROS 생성 량이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. NOX4 (NADPH oxidase 4)는 지방세포 내 대사과정에서 생성되는 NADPH에 의하여 ROS를 생성하는 단백질로 지방세포에 서만 특이적으로 발현된다. 지방세포의 분화과정에서 NOX4에 의하여 생성된 superoxide는 지방세포의 주요 활성산소종으로 알려져 있다(24,25). Catalase는 세포내 hydrogen peroxide(H2O2)를 유의적으로 소거하여 ROS에 대 항하는 중요한 항산화효소로서 일반적인 물질대사 과정 동안에 발생한 H2O2를 H2O와 O2로 변환시키는 역할을 하 는 것으로 알려져 있다(26). Fig. 4는 연화 열수 및 에탄올 추출물에 의한 지방세포 내 NOX4 및 catalase의 유전자 발현을 나타낸 것으로 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리 하지 않은 대조군에 비하여 연화 열수 및 에탄올 추출물을 각각 400 μg/mL 처리한 군에서 NOX4의 발현량이 유의적 으로 감소하는 것으로 나타났으며 항산화효소인 catalase의 발현량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. Yang 등 (27)과 Lee 등(28)에 의하면 연화에는 quercetin, kaempferol 등 플라보노이드 계열의 성분이 함유되어 있는 것으로 보고 되어 이와 같은 효능은 연화에 함유된 플라보노이드 계열 성분에 기인한 것으로 사료된다. 양성 대조군으로 사용된 NAC는 3T3-L1의 분화과정 중 ROS의 생성을 억제하며, 글루타치온(glutathione)의 전구체로써 세포 내 항산화 효소 의 생성에 도움을 주는 것으로 보고되고 있다(29).

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Fig. 4. Effects of hot water and ethanol extracts of Nelumbo nucifera Gaer tner flower on mRNA expression of NOX4 (A) and catalase (B) dur ing adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes. CON, control (MDI); NAC, N-acetyl cysteine. Total cellular RNA was extracted and subjected to RT-PCR. NOX4 and catalase mRNA levels were quantified and normalized with to GAPDH. Each values are the mean±standard deviation of samples. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at p<0.05 by one-way ANOVA.
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위 결과를 통하여 연화 열수 및 에탄올 추출물은 지방세 포 내의 중성지방의 축적 및 ROS 생성을 억제하여 비만과 산화적 스트레스에효과를갖는천연소재임을 알수 있었다.

요 약

본 연구에서는 연화 열수 및 에탄올 추출물의 3T3-L1 지방세포 분화 및 ROS생성 저감효과를 구명하기 위하여 3T3-L1 전지방세포 분화과정 중 연화 열수 및 에탄올 추출 물에 의한 지방축적과 ROS 생성을 관찰하였다. 연화 열수 및 에탄올 추출물은 XTT assay에서 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 세포 독성을 보이지 않았다. 지방세포 분화 중 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량을 비교한 결과, 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리한 지방세포의 경우 지방축적량과 ROS 생성량 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 특히 연화 열수 및 에탄올 추출물을 처리함으로써 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 PPAR γ, C/EBPα 및 aP mRNA의 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 유전자인 NOX4 및 catalase의 유전자발현 또한 유의적으로 감소하였다. 이 결과를 통해 연화 열수 및 에탄 올 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적 억제 효과와 더불어 ROS 생성 억제에 효과적으로 작용함을 확인 하였다. 따라서 연화 열수 및 에탄올 추출물은 비만과 같은 대사증후군 관련 질환의 개선을 위한 천연물 기능성 소재로 의 활용이 기대된다.

감사의 글

본 연구는 2015년도 공주대학교 학술연구비 지원에 의하 여 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

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