효소 처리에 따른 단삼 추출물의 이화학적 특성

본 실험에 이용된 단삼은 2014년 경북 봉화군에서 재배· 건조한 1년생을 영양단삼으로부터 구입하여 재료로 사용 하였다. 이때 사용된 건조된 단삼원료의 수분, 탄수화물, 조단백, 조지방, 회분 및 환원당은 각각 6.83, 64.17, 16.0, 0.0, 4.1 및 8.9%이다. 본 실험에 이용된 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH), salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone Ⅰ 및 tanshinone ⅡA, acetonitrile은 Sigma(St. Louis, Mo, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Table 1

단삼의 추출조건은 다음과 같다. 국내산 단삼 200 g을 칭량하고 3차 증류수 2 L와 혼합하여 100℃에서 30분간 추출한 후 방냉하여 각각의 효소제를 첨가하여 진탕 항온기 (HB-205SW, Hanback Sci., Co., Incheon, Korea)를 이용하여 45 및 60℃에서 4시간 추출하여 여과지(Whatman No. 41)로 여과한 추출액을 이용하였다.

각 조건에서 얻어진 단삼 추출물의 추출수율은 추출액 10 mL을 취하여 105℃에서 증발 건조(HB-502M, Hanbaek Scientific Co., Incheon, Korea)시켜 그 무게를 측정하여 사 용된 원료 양의 백분율로 추출수율을 나타내었다(28). 단삼 추출액의 pH는 pH meter(Metrohm 691, Metrohm UK Ltd., Herisau, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 당도는 digital refractometer(PR-101, Atago Co., Tokyo, Japan)를 사 용하여 측정하였다.

시료추출물의 색도는 UV-visible spectrophotometer(UV- 1601, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 L(lightness), a(redness), b(yellowness)를 각각 측정하여 Hunter's color value로 나타내었다. UV-visible spectrophotometer의 대조 구는 증류수(L=100.00, a=0.06, b=-0.09)를 사용하였다. 단 삼 시료 추출물의 갈색도는 420 nm에서 측정하였다.

총 페놀성 화합물 함량은 Folins-Denis법(29)을 이용하여 비색 정량하였다. 시료 추출물 2 mL에 50% phenol reagent (Folin-Ciocalteu’s reagent) 2 mL을 첨가하여 3분간 방치 후 10% Na₂CO₃용액을 2 mL을 가한 다음 실온에서 30분간 정치 발색시키고 UV-visible spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu Co.)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 이때 gallic acid(Yakuri pure chemicals Co., Ltd., Kyoto, Japan)를농도별로조제한후 상기의방법으로작성한표준곡 선으로부터 환산하였으며 대조구는 증류수를 사용하였다.

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, sigma) 라디칼 소거 활성은 Blois방법(29)을 변형하여 측정하였다. DPPH 0.15 mM을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후, 50% ethanol용 액을 대조구로 하여 517 nm에서 DPPH용액의 흡광도를 약 1.0이 되도록 희석하여 사용하였다. 시료 0.5 mL에 DPPH용액 5 mL을 혼합하여 정확히 3분 동안 반응시킨 후 UV-visible spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu Co.) 를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식으로 부터 DPPH radical 소거활성을 계산하였다.

As : Absorbance of group with sample

Ac : Absorbance of group without sample

ABTs radical 소거능은 Re 등의 방법(30)을 일부 수정하 여 실험하였다. ABTs 7 mM과 potassium persulfate 2.45 mM을 증류수에 용해하여 12~16시간 동안 암소에 방치하 여 ABTs cation radical(ABTS^˙+)을 형성시켰다. 이 용액을 80% ethanol을 이용하여 734 nm에서 0.700±0.002의 흡광도 값을 갖도록 희석하였다. 증류수에 희석한 시료 추출물 50 μL를 시험관에 가한 다음 희석된 ABTS^˙+ 용액 3 mL를 첨가하였다. 실온에서 6분간 반응시켜 UV-visible spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu Co.)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitrite 소거 활성은 시료 1 mL에 1mM NaNO2 용액 1 mL을 첨가하고, 0.1 N HCl(pH 1.2)로 전체 부피를 10 mL로 정용하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 각 반응액 1 mL에 2% acetic acid solution 5mL 과 Griess 시약(30% acetic acid 로 조제한 1% sulfanilic acid 와 1% naphtylamine 의 1:1 혼합액) 0.4 mL을 가하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 UV-visible spectrophotometer(UV- 1601, Shimadzu Co.)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측 정하여 nitrite 소거활성을 측정하였다(31). 대조구는 증류 수를 사용하였다.

단삼의 유효 성분인 salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone Ⅰ 및 tanshinone ⅡA는 HPLC(1260 Infinity Quaternary LC System, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 이용하여 분석하였으며, 분석 조건은 Table 2 와 같다. 함량 측정은표품salvianolic acid B, cryptotanshinone, tanshinone Ⅰ 및 tanshinone ⅡA을 이용하여 작성한 검량선 의 희귀식에서 구하였다.

본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 측정한 평균과 표준 편차로 나타내었으며, 각 실험결과에 대한 통계분석은 PASW Statistics(18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용 하였다. 실험군 간의 유의적 차는 일원배치 분산분석법 (One-way Analysis of Variance)을 시행하였고, Duncan’s multiple range test로 각 실험군의 평균치 간의 유의적 차이 를 검증하였다(p<0.05).

국내산 단삼을 이용한 추출물의 추출수율, pH 및 당도 변화를 조사한 결과는 Table 3에 나타내었다. 효소제 종류 및 효소 처리 온도에 따라 차이를 나타내었다. 단삼추출물 의 추출수율은 45℃에서, 효소 무처리구 35.4%로 가장 낮았 으며, 60℃, amylase계 효소를 처리한 구에서 58.3%로 가장 높게 나타났으며, 처리온도가 높을수록 추출수율이 많아지 는 경향을 나타내었다. Lee 등(32)의 효소제를 이용한 감태 추출물에 관한 연구에서는 비교적 추출수율이 높은 효소추 출물에서 우수한 항산화 활성이 나타났다고 보고된 바 있 다. 효소제 종류에 따른 단삼 추출물의 pH 변화를 조사한 결과는 45℃에서 효소 무처리구는 pH 5.87이었으나, amylase계 효소를 사용하여 60℃에서 4시간 처리구는 pH 6.04로 가장 높게 나타내었다. 효소제 종류에 따른 당도의 변화는 효소 처리 유무 및 효소제 종류에 따른 변화를 나타 내었다. 45℃, 효소 무처리구는 2.67°Brix 로 가장 낮으며, 효소제를 사용한 추출물의 당도는 추출수율의 증가와 함께 높은 온도에서 처리한 구간에서 증가하는 경향으로 나타났 으며, amylase계 효소를 사용하여 60℃, 4시간 처리구에서 5.97°Brix로 가장 높게 나타났다. Pectinase계 효소를 이용하 여 45℃, 4시간 처리구에서 5.10°Brix로 효소 처리를 한 구간 에서는 가장 낮은 당도를 나타내었다.

효소제를 이용한 국내산 단삼 추출물의 색도 및 갈색도 변화를 조사한 결과는 Table 4에 나타냈으며, 효소제 종류 및 효소 처리 온도에 영향을 받는 것으로 나타났다. 색도는 45℃ 추출 효소 무처리구의 L, a, b값은 43.27, 16.36 및 27.18로 적갈색을 나타냈으나, pectinase계 효소제를 이용 하여 45℃에서 4시간 처리한 구는 39.45, 9.44 및 22.78로 L 및 b값이 가장 낮았으며 옅은 황적색을 보였다. Amylase 계 효소를 이용하여 60℃에서 4시간 처리구는 65.06, 9.81 및35.13의밝은황적색으로L값과b값이가장높게나타났다.

효소 처리를 한 단삼 추출물의 갈색도 변화는 45℃에서 효소 무처리구가 1.81로 가장 낮게 나타났으며, 60℃ 추출 amylase계 효소 4시간 처리구에서 2.48로 가장 높았으며, cellulase계 효소를 이용하여 45℃에서 4시간 처리구에서 2.36으로 비교적 높은 흡광도를 나타내었다. 식품 성분 중 질소화합물은 열처리 과정에서 갈변 반응을 일으켜 갈색 색소 및 행가 성분을 생성하며, 이 과정에서 생성된 amino-carbonyl 반응 생성물은 항산화 능력을 지니는 것으 로 알려져 있다(33).

식물에 존재하는 많은 phytochemical 중 phenol성 화합물 은 그 함량이 높을수록 항산화 활성은 증가하며, 항콜레스 테롤 작용, 정장작용, 항암 및 항산화 작용 등의 생리적 효과도 높아지는 것으로 알려져 있으며(34), 여러 가지 화학 물질은 생체 내에서 산화적 대사과정을 거치면서 비로소 활성화되어 변이원성이나 발암성을 나타내는 경우가 많다 (35). 보통 항산화능을 나타내는 전자공여능의 활성과 총 페놀함량이 비례하는 경향을 나타낸다(36). 국내산 단삼을 이용한 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 조사한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 효소 처리 유무 및 효소 활성 온도에 따라 차이를 나타내고 있으며, 탄수화물의 함량이 비교적 높은 단삼은 amylase계 효소를 이용하여 60℃, 4시간 처리 구에서 28.09 mg/g로 가장 높은 총 페놀성 화합물 함량을 나타내었다. Yang 등(37)은 고온고압 처리한 수삼의 경우 에는 처리온도가 높아지고, 처리시간이 길어질수록 총 페 놀성 화합물의 함량이 증가된다는 보고와는 비슷한 결과를 나타내었다.

Fig. 1. Changes in the total phenolic content of Salvia miltiorrhiza Bunge extracts. Values are mean±SD (n=3). Means with different superscripts are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. A, Glucoamylase of amylase system; B, Cellulase of cellulase system; C, Rapidase C80 Max of pectinase system; D, ProteAX of protease system.

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국내산 단삼을 이용한 추출물의 DPPH radical 소거능을 조사한 결과는 Fig. 2에 나타냈으며, 효소제 종류에 따른 차이를 나타내며 효소 활성 온도가 높을수록 비교적 높은 활성 경향을 나타내었다. 단삼 추출물의 55 ppm에서는 70% 이상의 소거능을 나타내어 비교적 높은 항산화능을 보이 며, amylase계 효소를 60℃ 4시간 처리구의 13.75 ppm에서 35.99%, 27.50 ppm 농도에서 54.03%, 41.25 ppm에서 68.94% 및 55.00 ppm에서는 84.25%로 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 높아지는 경향을 보였으며, 60℃ 4시간 처리구의 27.50 ppm 농도에서 50.0%이상의 소거능 을 나타내었다. 페놀성 화합물 함량에 대한 많은 연구들이 DPPH radical에 대한 긍정적 상호관계를 보고(38)한 바와 비슷한 경향을 나타내고 있다. DPPH의 환원력은 항산화 활성과 연관성이 높아 다양한 천연소재로부터 항산화 물질 을 검색하는데 이용되고 있다(39). 효소 처리를 하지 않고 고온에서 열수 추출한 단삼 추출물의 DPPH 소거능을 연구 한 Yeo(15)의 결과에서 단삼 추출물의 25 및 125 ppm농도 에서 37.84 및 50.23%를 나타냈다는 결과보다 효소를 이용 한 저온 추출법을 이용한 본 실험에서 높은 활성을 나타낸 것은 성분함량이 우수한 국내산 단삼을 이용하여 저온에서 효소 처리를 한 것이 유효성분의 안정성에 더 효과적인 것으로 판단된다.

Fig. 2. Change in the DPPH radical scavenging activity of Salvia miltiorrhiza Bunge extracts. Values are mean±SD (n=3). Means with different superscripts are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. A, Glucoamylase of amylase system; B, Cellulase of cellulase system; C, Rapidase C80 Max of pectinase system; D, ProteAX of protease system.

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ABTs radical 소거활성은 수소공여항산화제(hydrogendonating antioxidants)와 연쇄 절단형 항산화제(chain-breaking antioxidants) 모두를 측정할 수 있으며, 수용상(aqueous phase)과 유기상(organic phase) 모두에 적용 가능한 측정 방법이다(30). 국내산 단삼을 이용한 추출물의 ABTs radical 소거능을 조사한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 효소 활성 온도가 높을수록 비교적 높은 활성을 나타내었으며, 60℃ 에서 4시간 amylase계 효소 처리구의 13.75, 27.50, 41.25 및 55 ppm에서 23.26, 41.06, 63.00 및 84.11%로 농도 의존적 으로 가장 높은 활성을 나타내었다. Kim 등(38)은 천연 한약 재를 이용하여 열수 및 메탄올 추출물의 총 페놀성 화합물 함량 변화를 연구한 결과 페놀성 화합물은 항산화 작용을 가진 대표적인 물질이며, 항산화성의 정도는 식물의 종류 및 이들에 함유되어 있는 항산화 유효성분의 종류와 추출방 법에 따라 현저히 차이가 있음을 보고한 바 있다.

Fig. 3. Changes in the ABTS radical scavenging activity of Salvia miltiorrhiza Bunge extracts. Values are mean±SD (n=3). Means with different superscripts are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. NS, not significantly different. A, Glucoamylase of amylase system; B, Cellulase of cellulase system; C, Rapidase C80 Max of pectinase system; D, ProteAX of protease system.

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NO는 분비조직과 세포의 기능에 영향을 미치며 세포성 면역계의 주된 역할의 하나로 세포독성이나 성장억제작용 을 하며, NO 자신은 매우 약한 산화성을 가진 라디칼로서 vitamin E 와 비슷하게 세포의 지질과산화물을 막는 항산화 기능을 수행한다(36). 국내산 단삼 추출물 55 μg/g 농도를 이용하여 pH 1.2에서 반응시켜 아질산염 소거능을 조사한 결과는 Fig. 4에 나타내었으며 추출온도에 따른 차이를 보 이고 있다. Amylase계 효소를 이용하여 60℃, 4시간 처리구 에서 71.78%의 높은 활성을 나타냈으며, 그 다음이 protease 계 효소를 이용하여 60℃, 4시간 처리구에서 67.37%의 활성 을 나타냈다. 45℃ 4시간 처리구에서 amylase계 효소를 사 용한 구에서 62.09%의 활성으로 다른 효소제를 이용한 구 간보다 높은 NO radical 소거 활성을 나타내었다.

Fig. 4. Changes in the nitr ite scavenging ability of Salvia miltiorrhiza Bunge extracts. Values are mean±SD (n=3). Means with different superscripts are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. A, Glucoamylase of amylase system; B, Cellulase of cellulase system; C, Rapidase C80 Max of pectinase system; D, ProteAX of protease system.

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Salvianolic acid B는 radical과 반응성이 높은 페놀성 수산 기를 7종이나 지니고 있으며, 가수분해, decarboxylation 등 의 반응에 더하여 radical과 반응까지 수반됨으로써 분해 반응은 가열에 의해 급속히 진행 될 것이라고 한 보고(39)가 있다. 단삼의 여러 성분 중 tanshinone Ⅰ은 활성화된 간성상 세포의 자가사멸을 유도하여 항섬유화 효과를 나타내는 효능이 발표(39)되었다.

국내산 단삼을 이용한 추출물의 유효성분 HPLC chromatogram 패턴은 Fig. 5와 같으며, 저온 효소처리 단삼 추출물의 유효성분 함량의 변화를 조사한 결과는 Table 5에 나타내었다. 효소 처리에 따른 유효성분의 변화는 추출 온 도 및 효소제 종류에 따라 변화를 나타내고 있으며 4종의 유효성분 중 salvianolic acid B와 cryptotanshinone 및 tanshinone Ⅰ는 검출되었으나 tanshinoneⅡA는 미량이 검 출되었다. Salvianolic acid B함량이 45℃ 효소 무처리구 1,650.7 mg%로 가장 낮게 나타났으며 45℃, 4시간 처리시 amylase계 효소 처리구에서 2,583.8 mg%로 가장 높은 함량 을 나타내었다. 60℃에서 4시간 처리구에서는 salvianolic acid B함량은 amylase계 효소 처리구에서 2,397.6 mg%으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, pectinase계 효소 처리구에 서 낮은 함량을 나타내었다. Cryptotanshinone 함량은 45℃ 에서 4시간 효소 무처리구에서 2.3 mg%로 가장 낮게 나타 났으며, 60℃, 4시간 amylase계 및 protease계 효소 처리구에 서 3.8 mg%으로 가장 높게 나타났다. Tanshinon Ⅰ함량은 60℃, 4시간 protease계 효소 처리구에서 14.2 mg%으로 가 장 높게 나타났다. 단삼성분의 정량에 대한 보고에서 중국 약전에 75% 메탄올로 30분 초음파 추출로 단삼의 salvianolic acid B 함량은 3% 이상, tanshinone ⅡA는 0.2% 이상을 함유하도록 규정되어 있으며(22), 대한약전에서는 75% 메탄올로 30분 초음파 추출시 salvianolic acid B 함량 4.1% 이상으로 명시되어 있다(3). 본 실험에 사용한 단삼은 대한약전의 규격에 적합한 단삼을 활용하였으며, 본 저온 효소추출시 75%메탄올 용매로 추출시 단삼의 지표성분 함량대비 salvianolic acid B의 추출수율은 56~77%, tanshinone ⅡA의 추출수율은 58~71%의 범위로 나타났다. 효소중에서는 amylase계 효소를 이용시 지표성분의 추출수 율이 높고, 안정적 추출이 가능한 것으로 확인하였다.

Fig. 5. HPLC chromatogram of Salvia miltiorrhiza Bunge extracts. A, Salvianolic acid B; C, Cryptotanshinone; D, Tanshinone I.

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